通过胚胎移植生成具有突变单倍体肢体的嵌合体墨西哥钝口螈

该方案可产生经诱变的单倍体肢体，用于墨西哥钝口螈的遗传筛选。在单倍体个体中，即使低水平的诱变也能在细胞内产生功能缺失的表型。该移植技术还可用于挽救胚胎致死性表型。

该方法可用于研究任何适用于体外受精和移植的两栖动物物种的再生过程。在使用单倍体胚胎作为供体之前，我们建议先在GFP阳性与阴性的二倍体胚胎之间进行移植操作练习，并确认移植成功。对于雌性配子供体的准备，需将一条性成熟的白色或白色RFP雌性墨西哥钝口螈麻醉，作为配子供体。

确认对疼痛刺激无反应后，使用30号胰岛素注射器将0.15毫升人绒毛膜促性腺激素注入后肢背侧肌肉。进针时针头与中线呈45度角，以避免接触脊髓。将注射后的动物置于新鲜的40%霍尔特弗雷特溶液中，并将墨西哥钝口螈转移至8至12摄氏度的冰箱中保存48小时。

然后将雌性放回室温环境。在雌性产卵的同时，将一只完全麻醉的雄性置于解剖显微镜下湿润的纸巾上，使其呈仰卧位，并用惯用手将P1000移液枪的枪头置于泄殖腔基部。用另一只手的食指和拇指捏住距骨盆前方2至3厘米处，轻轻挤压动物，并将手指向后肢方向移动，以排出精性尿液，将每份样本收集至新的微量离心管中。

然后从每个样品中转移五微升至一个培养皿中，使用倒置显微镜检查精子质量。计数后，将精子用0.1X无菌MMR稀释至浓度为每毫升8×10⁴个细胞，并将每个卵子加入0.5微升精子悬液至新的培养皿中。接着用移液器枪头将悬液铺成厚度为一毫米的薄层，并使用塑料镊子将样品置于距离254纳米交联仪灯泡四厘米处，以8×10⁵微焦耳/平方毫米的剂量进行照射。

采集健康的精子样本后，将雌性个体置于一叠湿润的纸巾上，使其呈仰卧姿势，并采用类似的冲洗动作从雌性墨西哥钝口螈体内取出未受精的卵。然后使用湿润的镊子将卵转移至一个10厘米的培养皿中。在采集后15分钟内，使用P10移液器将经辐照处理的精子滴加到未受精卵上，使每个卵均匀覆盖0.25至0.5微升的灭活精子。

将卵子在室温下静置30分钟后，用0.1X MMR溶液浸没卵子。水合30分钟后，使用尖头镊子去除卵子的胶质层，并将卵子置于18摄氏度环境中，于七小时内进行显微注射。为构建单倍体-二倍体嵌合体，将一个健康的单倍体供体与一个或两个发育阶段相匹配的GFP阳性二倍体宿主胚胎置于预冷的手术培养皿的凹槽内，该培养皿中含有手术培养基，并放置在10摄氏度或更低温度的冷却台上。

使用两把超细的已灭菌直头镊子，完整移除肢芽及其周围的外胚层和中胚层组织，并将宿主组织放置一旁。从单倍体供体中取出大小相当的组织鞘，将其移植到宿主胚胎的相应区域。用经灭菌的显微镜盖玻片碎片制成的矩形玻璃片固定组织，并轻轻按压，使组织嵌入宿主胚胎体内。

将锚定装置保持原位 60 至 75 分钟，每隔 20 分钟检查一次，确认玻璃未发生滑动后，再用镊子剥离盖玻片碎片。将移植后的胚胎转移至新鲜手术培养基中，在 8 至 12 摄氏度下过夜培养使其恢复，随后将移植后的胚胎分别置于 12 孔板或 24 孔板中培养。38.7% 的卵母细胞发育为正常发育的单倍体胚胎。

在移植阶段，单倍体胚胎在前后轴方向上表现出弯曲程度减小，并且卵黄栓封闭不完全。此外，可利用荧光显微镜确认单倍体胚胎中不存在父源性GFP表达。移植失败或不纯的移植会产生多种表型。

当移植物清洁且正常发育时，GFP 表达应主要局限于臂丛神经，即来源于宿主脊髓的神经网络。在迁移到发育中肢体的血液来源宿主细胞中，可见单个细胞呈现点状 GFP 表达，这些细胞似乎是感觉神经元。当使用 RFP 阳性供体时，单倍体移植物肢体表现出普遍的 RFP 表达。

在发育过程中，嵌合动物中未经诱变的单倍体肢体明显短于相对应的二倍体前肢。尽管单倍体肢体完全能够再生，但与二倍体相比，其达到指状突起阶段的时间略有延迟。请注意使用无菌操作技术，并将胚胎宿主中的中胚层和外胚层组织彻底清除并完全替换，以获得清晰移植的肢体。

可对突变肢体进行截肢并评分其再生表型。利用下一代测序技术可对突变等位基因进行定量分析。结合CRISPR-Cas9诱变技术，我们的移殖方法使得我们能够在单倍体肢体再生过程中对靶向基因进行负向筛选。