用于测试 Vivo 中巨噬菌体招募的异位化学表达模型

此处描述的协议允许我们研究化疗的功能和巨噬细胞在体内的行为。现有的大多数细胞化疗实验模型都是基于体外细胞实验。但是体外实验有时太简单，不能对体内的复杂环境进行建模。

此外，它们可能并不代表体内的化疗能力。这些方法利用斑马鱼的具体优势进行直接细胞行为观察，这对小鼠来说是困难的。首先生成 TGFABP-10A 白细胞间-34 转基因结构。

将FABP-10A白细胞素-34构造注入一个细胞阶段Tg（mpeg1:GFP）转基因和野生型鱼胚胎以及转相 MRNA。根据手稿说明饲养和收集胚胎。然后，在4摄氏度下过夜或室温下用4%甲醛固定两小时。

固定后，用PBST清洗胚胎三次，每次洗涤五分钟。在PBST中用50%甲醇单独脱水胚胎，然后用100%甲醇，然后换至新鲜的100%甲醇，并在负20摄氏度下储存至少2小时。当准备好探针杂交时，在PBST中50%甲醇中单独补充胚胎的水分。

然后，用 PBST 清洗三次，每次洗涤五分钟。在室温下用PBST中的蛋白酶K消化胚胎。然后，丢弃消化液，在室温下用4%甲醛重复固定20分钟。

固定后，用PBST清洗胚胎两次，每次洗涤10分钟。在 65 摄氏度下使用加热杂交缓冲液进行预润滑，至少一小时。然后，将白细胞间-34探针预热至65摄氏度，10分钟。

将杂交缓冲液回收到原始管中，并在 65 摄氏度下使用预热探头进行杂交。第二天，用50%的甲酰胺和2X SSCT清洗胚胎，然后用2XSSCT清洗，然后在65摄氏度下清洗0.2XSSCT。每次洗涤重复三次，每次洗涤20分钟。

然后，用PBST清洗胚胎三次，每次洗涤五分钟。在室温下用600毫升的阻滞缓冲液阻挡样品一小时。然后，加入400微升的抗迪戈西格宁HRP抗体溶液，并在4摄氏度下孵育胚胎过夜。

第二天，取出抗体，用PBST洗六次胚胎，每次洗涤20分钟。最后一次洗涤后，用30微升1X加扩增稀释剂冲洗每个样品5分钟。在黑暗中孵育氟磷泰胺工作溶液中的样品5至15分钟。

如果信号较弱，将潜伏时间延长到30分钟。然后，用PBST清洗胚胎三次，每次洗涤10分钟。并在一夜之间用四摄氏度的原抗体孵育它们。

第二天，用PBST洗胚5次，每次洗涤30分钟，并在4摄氏度下用二级抗体孵育。第二天，在PBST中清洗胚胎三次，每次洗涤10分钟，并在4摄氏度或负20摄氏度的黑暗中储存在70%甘油中，时间更长。在成像之前，使用荧光显微镜选择 DS 红色和 GFP 双阳性胚胎。

要安装鱼，使用金属浴将1%低熔化的气糖加热至90摄氏度以上。然后，冷却到体温，混合在50微升0.2%三丁。将麻醉胚胎转移到底部盖滑梯上的小盘子。

去除周围的水，慢慢将低熔化的气糖滴在胚胎上。在加糖凝固之前，请仔细设置鱼的位置，使肝脏区域靠近盖滑梯。一旦阿加罗斯凝固，小心地用另一层加糖盖住它，以加固它。

将盘子放在共和显微镜载体桌上，用三辛的 E2 溶液盖住鱼，然后开始成像。要操作共体显微镜，请打开 Zen Black 2.3 软件并单击定位，然后孵育，然后将温度设置为 29 摄氏度。单击采集菜单，在智能设置菜单中选择所需的扫描模式和激光。

然后选择 Z 堆栈和位置。单击实验设计器菜单并选择在第一个块中启用多块实验，以在低放大率下查找样本。然后，切换到高放大率，让观测区域位于视场的中心。

设置位置和 Z 堆栈信息。然后，选择适当的激光强度、扫描层和成像速度。设置所有块后，设置适当的循环数并开始录制。

该协议用于将肝脏特异性白细胞-34通过表达质粒注射到转基因鱼胚胎中，转基因鱼的巨噬细胞被贴上了GP的标签。利用全安装荧光在原位杂交和免疫污染分析白细胞间-34和GGFP标记巨噬细胞的表达。在未注射的细胞数量上对巨噬细胞数进行了定量分析，并构建了注射胚胎的肝和尾区。

活成像用于直接观察巨噬细胞，标有绿色，通过控制鱼的肝脏，并迁移到白细胞间-34的肝脏，过度表达鱼。该协议的重要步骤包括选择合适的转基因生产线来标记感兴趣的细胞。并适当的组织成像您的转基因基因表达以及适当的观察时间窗口。

该技术可用于研究其他化疗素对体内其他细胞（如T细胞和嗜中性粒细胞）行为的功能。