Name: 用于向小鼠眼睛输送生物制剂的封装细胞技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 了解使用海藻酸盐微胶囊封装技术向小鼠眼睛输送生物制剂的方法。该技术可实现靶向递送并减少免疫反应，为眼部疾病治疗提供可靠的长期给药方案。

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本研究部分得到了美国国立卫生研究院（R01EY019320）、退伍军人事务部（RX000444 和 BX003050）以及南卡罗来纳州 SmartState 基金授予 B. R. 的资助。

所有实验均遵循眼科与视觉研究中动物使用声明（ARVO声明），并经南卡罗来纳医科大学动物护理与使用委员会在方案编号00399下批准。 
1. 细胞培养
<ol>
	<li>根据已发表的方案14,15，构建稳定表达目标基因的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）细胞系。</li>
	<li>将细胞培养于添加了10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞。</li>
	<li>每2–3天更换一次培养基。</li>
	<li>当细胞融合度达到70%–80%时，采用标准的组织培养操作进行传代。</li>
</ol>
2. 细胞包封
<ol>
	<li>将海藻酸钠与去离子水（DI 水）混合，配制成终浓度为 2% w/v 的溶液，并使用 0.2 µm 无菌注射器滤器过滤纯化。</li>
	<li>通过胰酶消化、离心并用 10 mM HEPES 缓冲盐水溶液（pH = 7.4）洗涤，制备待与海藻酸钠溶液混合的细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞终浓度调整为 1 × 106 个/mL 海藻酸钠溶液。 
	注意：包封过程应在无菌操作台内进行。</li>
	<li>将约 300 µL 海藻酸钠与细胞的混合液装入 3 mL 注射器中，并将其连接至注射泵。溶液将以 7 mm 的针尖至液面喷涂距离，通过 30 G 钝头针头被泵入置于无菌 50 mL 烧杯中的无菌凝胶浴中。</li>
	<li>凝胶浴包含 40 mL 含 100 mM 氯化钙（CaCl2）和 0.5% w/v 多聚-L-鸟氨酸（PLO）的 10 mM HEPES 缓冲盐水。PLO 是一种可选的次级聚合物包被材料，可根据研究者需求省略或更换。</li>
	<li>调节电压和流速，并在包封过程中保持恒定，流速设为 60 mm/h，初始电压为 6.0 kV，以生成直径约为 150 µm 的微胶囊。</li>
	<li>将高压电源的阳极导线夹（红色）连接至针头，将接地夹（黑色）连接至部分浸入凝胶浴中的铜丝。每批 1 mL 的海藻酸钠 + 细胞混合液约需 30 分钟完成包封，可制得约 25,000 个微胶囊。</li>
	<li>用洗涤液（含 1.5 mM CaCl2 的 10 mM HEPES 缓冲盐水，pH = 7.4）对形成的含细胞微胶囊清洗两次。禁止使用 PBS 进行洗涤。</li>
	<li>将包封后的细胞置于含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中，在 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中孵育。 
	注意：包封过程所用仪器如 图 1 所示。</li>
</ol>
3. 验证包封不影响细胞活力
<ol>
	<li>将包封的细胞在培养基中孵育 24 小时后，取约 500 µL（约 30 个微胶囊）的小样用于染色。</li>
	<li>用洗涤液（含 1.5 mM CaCl2 的 10 mM HEPES 缓冲盐水）洗涤微胶囊 2 次，并使用活/死细胞活力检测试剂盒进行活-死染色。</li>
	<li>配制染色混合液，其中钙黄绿素 AM（乙酰氧基甲酯）和碘化丙啶同型二聚体-1（ethidium homodimer-1）的终浓度分别为 2 µM 和 4 µM。</li>
	<li>向包封的细胞中加入 2 mL 染色混合液，在室温（RT）避光条件下孵育 30–45 分钟。</li>
	<li>小心吸除染色液，用洗涤液将微胶囊洗涤 2 次。使用荧光显微镜系统观察并成像包封的细胞。 
	注意：包封效果的记录如图 2所示。</li>
</ol>
4. 确认胶囊尺寸适合递送以及生物制剂的递送效果
<ol>
	<li>小鼠眼内玻璃体注射通常使用连接至2.5 µL Hamilton注射器的27 G钝头针（内径210 µm）进行。</li>
	<li>制备直径在100至200 µm范围内的微胶囊，将其悬浮于无血清培养基中，并小心吸入Hamilton注射器内。磷酸盐缓冲液（PBS）不适合作为载体，因为海藻酸盐微胶囊在PBS中会溶解。</li>
	<li>缓慢将含微胶囊的1 µL液滴排出至显微镜载玻片上，使用直立式明场显微镜检测其完整性。</li>
	<li>通过相应调节电压和流速来调整微胶囊大小（见步骤2.3）。提高电压并略微降低流速可非线性地生成更小的微胶囊8。在我们的实验中，直径为150 µm的微胶囊效果最为理想。微胶囊大小的调节还需在改变其他参数的同时保持海藻酸盐浓度恒定。</li>
	<li>将另一组细胞封装于合适尺寸的微胶囊中，并在无血清培养基中培养，以测定目标生物制品的分泌量。使用高灵敏度ELISA或蛋白质印迹法（Western blotting）检测上清液中生物制品的浓度。</li>
	<li>根据已知治疗药物的药代动力学/药效学（PK/PD）数据，确定所需注射的微胶囊数量。在我们的实验中，每只小鼠眼注射10个微胶囊效果最佳。</li>
</ol>
5. 将胶囊递送至小鼠玻璃体
<ol>
	<li>使用解剖显微镜进行玻璃体内注射。手术设置及操作过程中所用材料见图3。有关玻璃体内注射的详细方案，可参见其他文献16。</li>
	<li>通过腹腔注射赛拉嗪和氯胺酮（剂量分别为20 mg/kg和80 mg/kg）或其他经本机构动物护理与使用委员会批准的麻醉剂对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度是否合适17。</li>
	<li>使用盐酸去氧肾上腺素（2.5%）和硫酸阿托品（1%）散大鼠瞳孔，以便清晰观察玻璃体腔，并在眼睛上涂抹润滑性眼用凝胶，以保持术中眼球湿润。</li>
	<li>在角巩膜缘处用26 G针头刺穿巩膜作为引导孔，操作时需确保：1）针头与眼球及操作台呈45°角；2）斜面针尖朝上，以避免刺破晶状体。</li>
	<li>在直视下，使用连接至哈密尔顿注射器的27 G钝头针以45°角小心注入微胶囊，注意避免针头接触晶状体。晶状体损伤将导致白内障形成。注入后，微胶囊应在玻璃体中可见（通过解剖显微镜观察，图4A）。</li>
	<li>拔出针头后，对注射部位使用新霉素和硫酸多粘菌素B软膏，同时加用地塞米松眼用抗生素软膏。</li>
	<li>向双眼滴加2.5%羟丙甲纤维素眼用胶体溶液，以防止恢复期间角膜干燥。</li>
	<li>将小鼠置于设定为37°C的加热垫上，并持续监测直至完全清醒。</li>
	<li>成功注射包裹的ARPE-19细胞后，通过光学相干断层扫描或其他成像方法观察小鼠眼内玻璃体腔，应可见完整微胶囊，仅伴有少量碎片（图4B）。</li>
	<li>小鼠眼部在经历数天术后恢复后，现已准备好进入当前实验方案。 
	注意：手术设置及眼内微胶囊的记录分别如图3和图4所示。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

这种细胞包封技术相对快速且易于操作；然而，为获得准确的下游结果，必须注意某些要点。在包封前，细胞应在培养皿中进行培养，并维持适当的汇合度。包封操作应尽可能在具有可控气流的适当通风橱中进行。过强的气流可能影响微胶囊的形成，尤其是在长期实验中。无菌的器具和溶液对于细胞在微胶囊内的长期维持至关重要。
目前，活-死染色法被用作一种确证工具，以确定微囊内细胞的存活能力。每个微囊中的细胞数量以及在当前条件下的细胞数（通常为每个微囊12–20个细胞）也通过目视确定。每批包封细胞的存活率均通过此方法进行监测。为进一步确定细胞的存活能力，将包封的细胞溶解后重新培养。该步骤可进一步证明微囊内细胞的存活能力与完整性，从而验证细胞包封的成功。
针对该特定细胞类型，细胞包封所用的参数已经确定。上述参数是本实验中用于ARPE-19细胞包封的条件。流速、海藻酸钠浓度、施加电压以及微囊的二次包被均为可调节变量，可根据微囊的具体应用需求进行优化。同样，特定实验所需的微囊数量也需通过经验确定，或依据已知的生物制剂药代动力学/药效学（PK/PD）参数来估算。必须始终进行适...

基于细胞的疗法是一类革命性的生物技术，已在医学领域得到广泛应用。近年来，这类疗法已成功应用于神经退行性疾病、眼部疾病和癌症的治疗。细胞疗法涵盖从细胞替代到药物递送的广泛领域，而本实验方案重点关注后者。可生物降解的海藻酸盐微胶囊（MC）已被证明是一种有效的递送系统，并在生物医学领域得到日益广泛的应用。由于海藻酸盐具有简单的凝胶化过程、可生物降解性、优异的生物相容性以及在体内条件下的稳定性，因此被广泛用于微胶囊化技术1,2,3,4。
作为一种微胶囊化技术，电喷雾法已成功用于包封多肽和蛋白质，所用材料包括海藻酸盐（基础聚合物）和聚-L-鸟氨酸（次级包被聚合物）。这两种聚合物均为天然存在，因其良好的生物相容性而被广泛应用5,6,7。然而，细胞治疗中的主要挑战在于如何抑制宿主免疫系统，以避免免疫抑制药物引起的副作用。海藻酸盐微胶囊的通透性被认为是细胞封装的理想特性，它允许营养物质、代谢废物和治疗因子在细胞内外扩散，同时使细胞免受宿主免疫反应的攻击8,9,10。
在眼部，包封细胞已用于临床试验，以持续递送生物制剂（例如生长因子11,12和生长因子拮抗剂13），用于治疗视网膜色素变性或年龄相关性黄斑变性。其他靶点如补体抑制剂14目前也正在临床前研究中进行探索。

<table><tbody><tr><td>3 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>30 G 1&quot; 钝头针</td><td>SAI Infusion technology</td><td>B30-100</td><td></td></tr><tr><td>海藻酸钠，来自褐藻</td><td>Sigma</td><td>A0682</td><td></td></tr><tr><td>硫酸阿托品滴眼液 (1%)</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-215-15</td><td>用于瞳孔扩张</td></tr><tr><td>BD 1 mL 注射器 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>DG518105 500029609 REF 309625</td><td>用于制备引导孔</td></tr><tr><td>氯化钙，无水，颗粒状</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal 人工泪液</td><td>Alcon</td><td>NDC 0078-0429-47</td><td>用于麻醉期间润滑眼睛</td></tr><tr><td>Goniotaire：羟丙甲纤维素 (2.5%) 滴眼用保护液（无菌）</td><td>Altaire Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 59390-182-13</td><td>用于麻醉期间润滑眼睛</td></tr><tr><td>Hamilton 针/注射器头：27 G，小接头 RN 针，定制长度 (12 mm)，尖端类型 3，6 支/包</td><td>Hamilton</td><td>7803-01</td><td>用于玻璃体内递送微胶囊</td></tr><tr><td>Hamilton 注射器：2.5 &amp;micro;L，型号 62 RN SYR，针头单独出售</td><td>Hamilton</td><td>7632-01</td><td>用于玻璃体内递送微胶囊</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液，1 M</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP299100</td><td></td></tr><tr><td>高压发生器</td><td>ESD EMC Technology</td><td>ES813-D20</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 活性/细胞毒性检测试剂盒</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>L-鸟氨酸盐酸盐，99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12111</td><td></td></tr><tr><td>新霉素和多粘菌素 B 硫酸盐及地塞米松滴眼膏</td><td>SANDOZ</td><td>NDC 61314-631-36</td><td>抗生素，用于预防玻璃体内注射后感染</td></tr><tr><td>盐酸去氧肾上腺素滴眼液 (2.5%)</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-201-15</td><td>用于瞳孔扩张</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器滤器，0.2 &amp;mu;m</td><td>VWR</td><td>28143-312</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>GRASEBY</td><td>MS16A</td><td></td></tr></tbody></table>

用于向小鼠眼部递送生物制剂的包封细胞技术

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

目前许多针对眼后极部疾病的在研治疗药物均为生物制剂。这类药物通常需要频繁给药，典型方式为玻璃体内注射。包封细胞可表达特定的生物制剂，正逐渐成为局部蛋白质生成与释放的工具（例如用于长期药物递送）。此外，包封系统采用可渗透材料，允许营养物质、代谢废物及治疗因子在细胞内外扩散，同时使细胞免受宿主免疫系统的识别，从而避免需要抑制宿主免疫系统。本方案描述了以海藻酸盐作为聚合物，结合电喷雾法进行微囊化包封的技术。ARPE-19细胞是一种自发形成的人视网膜色素上皮细胞系，因其长期功能性已被用于长期细胞治疗实验，本文中用于细胞包封及向小鼠眼部递送微囊。该文总结了细胞微囊化、质量控制及眼部递送的操作步骤。

ARPE-19 细胞是一种自发永生化的人视网膜色素上皮细胞系，已被证明适用于包封，并在将微囊植入眼内后能够长期存活。图1展示了海藻酸盐包封所用的工具。本研究中，通过明场成像证实了海藻酸盐微囊内的细胞存在（图2A）。对微囊内细胞进行活/死细胞染色检测，结果显示包封后细胞存活率达90%（图2B）。为确保微囊内细胞的长期存活能力，将微囊溶解于柠檬酸钠溶液中，随后将细胞重新接种（图2C）。在独立实验中确认稳定转染的 ARPE-19 细胞能够表达并分泌目标生物制品14，并确定了细胞安全包封的参数后，制备了用于眼内注射的微囊。
向小鼠眼球内进行玻璃体内注射时，需使用27 G钝头针（内径210 µm）及精确的递送系统，以稳定注入所需的1 µL微小体积。通过显微镜确认了在经27 G针头推出过程中未受损胶囊的尺寸（<...

本文介绍了一种利用海藻酸盐作为聚合物对永生化细胞进行微囊化，以实现向啮齿类动物眼部长期递送生物制剂的实验方案。

目前许多针对眼后极部疾病的在研疗法均为生物制剂。这些药物需要频繁给药，……

该技术是一种可靠的方法，可将药物、蛋白质或细胞等物质递送至组织或动物体内的特定部位。您能够追踪递送过程，并根据实验需求调节内容物的释放。该技术可用于治疗多种疾病，从伤口愈合到眼部及心脏疾病均可应用。该方法的主要优势在于能够利用海藻酸盐微胶囊将治疗性细胞递送至靶部位，而不会引发任何免疫反应，并可在较长时间内持续递送新分泌的治疗因子。首先，根据论文中的指示培养视网膜上皮细胞。当细胞融合度达到70%至80%时，采用标准的组织培养操作进行传代。为包封细胞，将海藻酸钠与去离子水混合，配制成终浓度为2%（重量/体积）的溶液，并使用0.2微米无菌注射器滤器过滤纯化该混合液。用胰蛋白酶消化细胞，离心并用10毫摩尔HEPES缓冲盐溶液洗涤细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将最终细胞浓度调整为每1毫升海藻酸钠溶液含100万个细胞。将300微升海藻酸盐与细胞混合物分装至3毫升注射器中，并将其连接至注射泵。根据论文中的说明配制凝胶浴，并将其置于无菌的50毫升烧杯中，烧杯位于注射器针尖下方，针尖与凝胶浴之间的喷雾距离为7毫米。调节电压至8千伏，流速至每小时30毫米，以制备直径约150微米的微胶囊。将黑色接地夹连接到半浸入凝胶浴中的铜线上，将红色阳极线的夹子连接到针头上。每1毫升海藻酸盐与细胞混合物制备包封细胞约需30分钟。形成微胶囊后，用洗涤液清洗两次，并将其置于含10% FBS的DMEM培养基中，在37摄氏度、5% CO2的湿化培养箱中孵育。经过24小时孵育后，通过在洗涤液中清洗两次，制备500微升微胶囊样品用于染色。使用活/死细胞检测试剂盒对微胶囊进行活力染色。为确保微胶囊具有合适的尺寸，将其用无血清培养基稀释。使用 2.5 微升 Hamilton 注射器小心吸取。缓慢推出 1 微升液滴至显微镜载玻片上，利用直立式明场显微镜观察微胶囊的完整性。在适当麻醉的小鼠眼中，涂抹眼用润滑剂以保持眼球湿润，并使用 26 号 3/8 英寸斜面注射针头在角巩膜缘下方进行初步穿刺。务必从鼻侧方向以45度角接近眼球，保持斜面针尖朝上，以避免刺穿晶状体。接下来，确保将整个针尖插入眼内以形成导孔，但需小心不要插入过深，以免刺破颞侧视网膜。完成后，缓慢撤出针头。在显微操作仪内，放置一支已装入包埋液的27号钝头2.5微升Hamilton注射器，并将针头对准初始导向孔。固定动物头部，使其保持稳定，然后小心地将针头推进至眼球。为确保针头位于玻璃体内的正确位置，继续插入注射器，直至在晶状体后方可见针尖。然后在25至30秒内缓慢注射囊膜溶液。注射完成后，逐渐撤出钝头注射器，以尽量减少对眼睛的损伤。如有必要，可根据文稿中的说明，通过调节电压和流速来调整囊膜大小。通过明场成像确认了细胞在海藻酸盐中的包封，LIVE/DEAD 检测显示包封后90%的细胞具有活性。通过将微囊溶解于柠檬酸钠溶液并重新接种，确保了细胞的长期存活率。玻璃体内注射在视觉监测下进行，从而可在玻璃体中观察到微囊的存在。进行此操作时，任何洗涤步骤均不得使用PBS，因为PBS会溶解形成的海藻酸盐微胶囊。该技术开发完成后，本实验室已将其用作治疗心力衰竭和高血压的递送系统。该技术被认为是未来治疗多种心血管和神经系统疾病的有前景工具。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于向小鼠眼睛输送生物制剂的封装细胞技术

介绍了一种在小鼠体内传代人视网膜母细胞瘤肿瘤的方法。将肿瘤细胞直接注射到免疫缺陷小鼠的眼内。该方法已成功用于建立继发性肿瘤，所用细胞既包括直接从人肿瘤组织中获取的细胞，也包括培养的肿瘤球细胞。...

建立和传代人视网膜母细胞瘤肿瘤在免疫缺陷小鼠中的模型

我们展示了一种 体内 电穿孔转染方案，用于在多种出生后年龄段的小鼠中转染单个或少量成簇的视网膜神经节细胞（RGCs）及其他视网膜细胞类型。该方法实现了对出生后RGCs的标记与遗传操作 体内...

小鼠视网膜神经节细胞的转染 体内 电穿孔

一种将质粒DNA导入小鼠视网膜细胞以开展功能获得或功能缺失研究的方法 体内...

体内 电穿孔转染发育中小鼠视网膜

该手术技术演示了将基因治疗载体和干细胞注射到小鼠眼球视网膜下腔的方法。...

围产期小鼠眼内视网膜下注射基因治疗载体与干细胞

本视频介绍了一种通过将细菌悬液注射到小鼠眼内玻璃体腔中，建立模拟细菌性眼内炎的小鼠模型的方法。细菌性眼内炎是一种由细菌侵入眼内玻璃体腔引起的内部感染。该小鼠模型有助于研究疾病的发病机制并评估潜在的治疗方法。...

细菌性眼内炎小鼠模型：通过玻璃体内注射细菌悬液建立小鼠细菌性眼内炎的方法

关键词：细菌性眼内炎，小鼠模型，玻璃体内注射，细菌悬液，眼感染，实验性眼病

本视频演示了一种用于将抗体递送至小鼠脑部的对流增强递送（CED）技术。暴露麻醉小鼠的颅骨，并在目标区域钻出一个骨孔以用于抗体递送。将含有抗体的阶梯式导管插入目标部位，并通过输注泵产生压力梯度，以可控速率递送抗体。...

对流增强递送抗体至小鼠脑部

视网膜下注射是一种将基因有效递送至小鼠眼内视网膜色素上皮的外科技术。本文介绍了一种在实验小鼠中对视网膜色素上皮进行病毒载体视网膜下注射的简便且可重复的方法。...

经角膜缘入路-小鼠视网膜色素上皮基因治疗中病毒载体的视网膜下注射

关键词：角膜缘入路，视网膜下注射，病毒载体，基因治疗，视网膜色素上皮，小鼠

本文展示了一种利用高分辨率谱域光学相干断层扫描（HR-SD-OCT）将基因治疗药物递送至视网膜下腔、评估其分布范围并表征光感受器活性的新方法。...

超高分辨率小鼠光学相干断层扫描技术在视网膜基因治疗研究中辅助眼内注射

本文介绍了一种用于细菌性眼内炎小鼠模型的玻璃体内注射方法及后续细菌定量技术。该方案可进一步扩展用于检测宿主免疫反应以及细菌和宿主基因的表达。...

小鼠细菌性眼内炎模型中的玻璃体内注射及感染参数定量分析

我们提出了一种利用光纤共聚焦激光显微内镜（CLM）无创研究结膜下注射后脂质体在眼部时空分布的实验方案。...

时空 在体 内 使用光纤共聚焦激光显微内镜成像眼部药物递送系统

我们描述了一种详细的方案，用于制备经冷冻保存后的hESC来源的视光感受器前体细胞，并将其移植到rd10小鼠的视网膜下腔。...

视网膜下移植人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞至 rd10 小鼠

了解使用海藻酸盐微胶囊封装技术向小鼠眼睛输送生物制剂的方法。该技术可实现靶向递送并减少免疫反应，为眼部疾病治疗提供可靠的长期给药方案。

用于向小鼠眼部递送生物制剂的包封细胞技术

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