Name: 在微流体进化加速器上生成跨癌症人群的异构药物梯度，用于实时观察 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 了解微流控芯片技术在癌症研究中的应用，通过进化加速器平台实时观察肿瘤细胞动态行为。该方法可在单细胞水平定量分析癌症形态、运动和迁移特征，为临床前药物开发提供更接近生理环境的肿瘤模型。

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本工作由 NSF PHY-1659940 资助。

1. 微流控装置的制备
<ol>
	<li>使用版图设计软件生成所需的微流控图案（参见补充材料）。</li>
	<li>制备光掩模。详见材料表。
	<ol>
		<li>使用激光直写仪，将图案写入涂有100 nm铬层和500 nm光刻胶AZ1518的钠钙玻璃片上。</li>
		<li>用显影液AZ300MIF显影光刻胶60秒。</li>
		<li>使用Cr-7铬蚀刻剂去除未被光刻胶保护的铬层。</li>
		<li>在70 °C条件下，使用去胶剂去除残留光刻胶，处理45分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光刻胶图案化。详见材料表。
	<ol>
		<li>在硅片上以4000 rpm转速旋涂HMDS，持续40秒。</li>
		<li>在硅片上以4000 rpm转速旋涂光刻胶AZ4330，持续40秒。</li>
		<li>在95 °C条件下对硅片进行前烘60秒。</li>
		<li>使用掩模对准仪对硅片进行紫外光曝光。</li>
		<li>用显影液AZ300MIF显影光刻胶4分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行DRIE刻蚀。详见材料表。
	<ol>
		<li>使用硅深反应离子刻蚀（DRIE）系统对带有光刻胶图案的硅片进行干法刻蚀，深度为100 µm。</li>
		<li>用丙酮去除光刻胶，并使用等离子刻蚀机进行等离子清洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>晶圆氧化与硅烷化处理。详见材料表。
	<ol>
		<li>将刻蚀后的硅片置于炉中，在1100 °C下进行热氧化处理1小时。</li>
		<li>等待硅片冷却后，将其放入干燥器中，并在靠近硅片的小容器内滴加数滴三氯-1H,1H,2H,2H-全氟辛基硅烷（PFOTS）。</li>
		<li>在室温下将干燥器抽真空至0.5 atm，持续60分钟。经适当硅烷化处理后，硅片模具应呈现疏水性，可通过在硅片表面滴加数滴水进行测试验证。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>软光刻。详见材料表。
	<ol>
		<li>按10:1的质量比混合预聚物与交联剂（来自聚二甲基硅氧烷（PDMS）试剂盒）。</li>
		<li>将混合后的PDMS浇注到硅烷化处理的硅片模具上，形成高度为10 mm的薄膜。</li>
		<li>将PDMS-硅片体系置于干燥器中脱气30分钟至1小时。</li>
		<li>将PDMS-硅片置于70 °C培养箱中过夜，以固化PDMS。</li>
		<li>PDMS固化后，小心地将其薄膜从硅片上剥离下来。</li>
		<li>使用活检针根据PDMS上的图案位置在进样口处打孔，并使用圆形打孔器切割出直径为27 mm的芯片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PDMS层键合。
	<ol>
		<li>热固化两组直径为27 mm的PDMS圆柱体（无图案），分别作为装置的储液层和封顶层。</li>
		<li>在储液层的进样口周围切出两个直径为7 mm的圆孔，并使用活检针在封顶层的进样口处打孔。</li>
		<li>通过氧等离子体处理将三层PDMS（图案化层、储液层、封顶层）键合在一起。</li>
		<li>使用活检针在装置的出样口和中心端口处打孔。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 培养基与细胞系的准备
<ol>
	<li>准备用于培养PC3细胞系（包括PC3-EMT和PC3-EPI）的培养基：将RPMI 1640培养基与10%胎牛血清（FBS）和1×抗生素-抗真菌剂混合。细胞系的构建方法如前所述14。 
	注意：PC3细胞系在上述培养基中培养，置于37 °C、含5% CO2的加湿培养箱中。每3天传代一次，在细胞融合度达到100%之前进行分瓶培养。</li>
	<li>如前所述12，转染细胞系以表达细胞质标记的荧光蛋白，以便更清晰地观察，其中PC3-EMT表达细胞质GFP，PC3-EPI表达细胞质mCherry。需注意，该技术同样适用于任何荧光标记的细胞，以及未标记细胞的明场成像。</li>
</ol>
3. 实验装置
<ol>
	<li>金属板支架的制备
	<ol>
		<li>加工或3D打印一个足以同时容纳透气性培养皿以进行平行实验的培养板支架。3D CAD文件（&#34;3孔板。FCStd&#34;可在 GitHub 上作为参考获取（https://github.com/kechihl/3-well-plate）。</li>
		<li>拧下支架的各个部件（图2) 并用螺丝刀拆卸。通过紫外线照射对组件消毒至少1小时，并置于无菌环境中。 
		注意：该支架设计用于提供充分的热平衡条件和理想气体组分，其气体通道入口可允许气流通过。更多细节可参见我们之前的研究工作12.</li>
		<li>准备最多三个透气性培养皿，其细胞培养膜应具有相对较高的柔韧性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞系接种
	<ol>
		<li>实验开始前24小时，用胰蛋白酶消化5分钟收集PC3-EPI和PC3-EMT细胞。加入预热的培养基后，以150 x g离心 g 3 分钟后弃去上清液。</li>
		<li>使用血细胞计数板对每种PC3-EPI和PC3-EMT细胞进行计数，并分别收集总计2.5 × 10⁵个细胞4 每种细胞类型在每个透气性培养皿中的数量。</li>
		<li>将两种细胞类型在2 mL培养基中混合并重悬，随后将细胞接种至每个透气性培养皿中。</li>
		<li>将整个培养板架放入培养箱中过夜，以使细胞贴壁。</li>
		<li>通过紫外线照射对PDMS装置消毒至少1小时，并置于无菌环境中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置温控单元和气体供应系统
	<ol>
		<li>如图所示 图3，建立一个包含CO的气体供应系统2 和 O2 对照单元、气体泵、气体混合室、加湿器或鼓泡器，以及三组独立的气体阀门和压力表。更多细节可参见我们之前的研究工作12.</li>
		<li>设置 CO₂ 培养箱2 和 O2 对照单元，使其调节来自 CO 的气体混合速率2 和 N2 水箱和 O2 或者，任何在常氧条件下提供气体的气体供应系统均可使用。</li>
		<li>确保气体在混合室中混合后，通过鼓泡器加湿，使相对湿度升高至85%（由相对湿度监测仪读取），并将气体导入三个独立的带压力表的气体阀门，以控制和监测板架中的气体流速。</li>
		<li>将整个板架放入带有独立加热子单元的台上培养温控装置中，该装置分别对盖子和底部板进行加热，所有单元均设置为 37 °C。参见 材料表 详情请见。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微流控装置的安装。参见 材料表 如需了解更多详情。
	<ol>
		<li>确认3孔板支架的各个详细部件均按顺序排列，如 图2三个小室完全相同且相互独立，每个小室均配有独立的气体通道。每个小室包含一个透气性培养皿支架、一个PDMS芯片支架、一个玻璃窗支架以及一对35 mm玻璃窗。这些组件可通过配套螺丝进行组装。 
		注意：玻璃窗可确保透气性培养膜与孔之间形成一个热隔离空间，从而避免因界面处的温度差异而产生水凝结。请注意，这3个孔相互独立，可分别进行3个实验。</li>
		<li>将培养基在37 °C预热，并在真空室中脱气20 min。</li>
		<li>使用氧气等离子体系统处理PDMS芯片30秒，以保持其亲水性。</li>
		<li>建立注射器系统。缓慢向两个注射器中加入培养基，另两个注射器中加入所需的目标试剂（如培养基、含药物的培养基等）。将每支注射器分别连接至一段50 cm长的导管（0.020）&#34; x 0.060&#34;通过23 G分配针将OD注入一根中空钢针中。将一根中空钢针插入管路的另一端。</li>
		<li>用培养基预润管路，并将钢针穿过盖层插入每个PDMS芯片中。填充储液层，并用培养基润湿PDMS图案层。储液层可作为芯片上的气泡捕获装置，防止气泡进入微流控通道。</li>
		<li>用1 mL注射器吸取培养基。将注射器连接至一段5 cm长的导管（0.020）&#34; x 0.060&#34;通过23 G分配针将OD注入一根空心钢针中。将一根空心钢针插入管路的另一端，并对管路进行预灌注。</li>
		<li>将空心钢针插入芯片的中心孔中，以便在后续芯片密封过程中从中抽出过量的培养基。</li>
		<li>由于每个PDMS装置需要在注射泵上装载四个10 mL注射器，因此在前部载架上每块芯片装载两个10 mL注射器，并将另外两个注射器放置在注射系统抽吸载架中。</li>
		<li>将芯片直接放置在透气性培养膜上方（细胞已贴附于膜上）。为避免微流控通道中截留微小气泡，在组装前先向35 mm透气性培养皿中加入1 mL预热并脱气的培养基，然后确保芯片以15度倾斜角接近液面。</li>
		<li>将透气性培养皿及其培养皿孔固定在每块芯片的透气性培养皿支架中，使PDMS芯片支架将PDMS装置向下推压。</li>
		<li>用封口膜覆盖在PDMS装置顶部，并使用PDMS芯片夹具夹紧，以防止芯片干燥。</li>
		<li>将流过阵列的培养基流速设定为 20 µL/h。</li>
		<li>将整块培养板置于倒置显微镜电动载物台上的载物台培养箱内。将气体供应系统连接至气体通道，并对可透气体的培养膜施加压力，使其紧贴已安装的PDMS芯片，以确保装置密封。维持表压为0.2 psi（1.4 × 104 Pa</li>
		<li>使用1 mL注射器从中心孔缓慢抽出芯片中多余的培养基。抽吸过程中在显微镜下观察芯片，当芯片完成封合时停止抽吸。芯片封合现象应较为明显，因为部分细胞会被微结构压碎。</li>
		<li>将台上培养箱的温度感应单元连接至3孔板，并设置为37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 单细胞延时成像
<ol>
	<li>使用倒置显微镜设置成像软件以进行延时图像采集。请注意，进行EA实验需要配备全电动化x-y载物台、调焦旋钮、快门和滤光片组的倒置荧光显微镜。</li>
	<li>配置软件，对每个芯片在10倍放大下双通道成像，并在一次自动对焦后自动拼接图像。需注意，Perfect Focus等自动校正系统并不能保证令人满意的图像质量。更推荐基于芯片范围内的自动对焦或手动对焦，建立自定义的对焦曲面，以用于长期图像采集。</li>
	<li>每小时拍摄一次图像，实验持续运行数周时间。每日监测图像质量，并在必要时更新对焦曲面。</li>
	<li>按照先前所述方法13，准备PDMS芯片和透气性培养皿，用于后续免疫荧光分析。</li>
</ol>
5. 图像处理与分析
<ol>
	<li>实验后处理
	<ol>
		<li>将图像转换为 TIFF 格式，以便使用 Fiji/ImageJ 进行图像处理和测量。</li>
		<li>压缩 TIFF 文件，以方便进一步的图像处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fiji/ImageJ 分析
	<ol>
		<li>为识别细胞，执行背景减除和颗粒分析，以识别荧光亮点，用于细胞定位检测和自动细胞计数。</li>
		<li>利用插件（Manual Tracking、Chemotaxis、Migration Tool、Trackmate）分析细胞运动性和迁移能力。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

未声明利益冲突。

传统的细胞培养技术发展于近一个世纪前，尽管其在癌症研究中预测临床结果的能力已被证实存在局限性，但至今仍是生物医学研究中最常用的临床前模型。17动物模型在生理相关性和遗传相似性方面与人类最为接近，但长期以来人们也认识到其在预测人类结果方面存在显著局限性18在所有现有的临床前模型中，基于微流控技术的器官芯片癌症模型似乎是满足癌症研究未竟需求的最有前景的候选者9,19,20然而，目前的芯片上癌症模型尚未提供一个能够全面模拟肿瘤微环境关键组分和相互作用，同时又足够简单以获得可靠且可重复的定量数据的平台。我们的代表性数据表明，我们开发的微流控细胞培养技术可为异质性微环境中长期细胞培养提供稳定的物理和生化条件&#173;环境。该多功能平台可对时间进行精密调节&#173;依赖性化学梯度以及环境气体成分。该平台具有便携性，并可与大多数荧光倒置显微镜兼容，用于高&#173;高...

癌症 increasingly 被认为是一个复杂的生态系统，其不仅依赖于突变细胞群体的持续失调，还依赖于癌细胞与宿主微环境之间的关键相互作用。从这一角度来看，癌症的演化发生在一个由多种因素构成的适应性景观中，包括异质性的肿瘤微环境以及与多种宿主细胞的交互对话，这些因素共同施加选择压力，促使进一步的遗传或表观遗传改变1,2,3。在实体瘤的背景下，化疗药物及其他资源梯度的不均匀分布导致了其分子异质性，并可能在耐药性的产生、特定肿瘤亚群的血管生成增强乃至转移过程中发挥重要作用4,5,6。传统的体外二维细胞培养研究虽然具备大规模、操作便捷的实验能力，但所提供的均一、静态和均场条件往往缺乏精确的空间与时间环境控制，难以真实模拟体内肿瘤的动态行为。因此，在药物研发流程中，需要在动物模型之前建立更具代表性的离体模型，以更准确地预测癌症的进展以及在动态应激环境下对药物的反应。微流控技术被认为有望弥合二维细胞培养研究与更复杂的体内动物研究之间的鸿沟，后者可能难以支持可控的定量研究7,8,9。
一种理想的体外系统，应能够生成异质性微环境，以模拟肿瘤中可能发生的适应性细胞反应，同时能够在单细胞分辨率下观察这些动态过程。本文介绍了一种微流控细胞培养平台，即一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的装置，称为“&#34;进化加速器&#34;（EA），该平台可在数周时间内实现对癌细胞动态的并行体外研究，具备细胞级分辨率和实时数据采集能力，同时在培养区域内稳定维持应力梯度。该平台的设计基于我们先前的研究工作，即在某种条件下，异质种群中生物体的进化动态可以被加速10,11。具体而言，在一组空间上分离但存在一定程度相互作用的种群中，当暴露于异质性应激环境中时，适应性最强的物种相较于大型均一环境中的种群，能更快地在局部种群中占据主导地位。随后，这些优势物种会迁移到邻近的微环境中以获取资源和空间，并最终主导整个种群。如图1所示，微流控EA芯片的结构包括：（i）一对蛇形通道，用于提供新鲜培养基循环，并为化学物质扩散建立固定的边界条件；（ii）位于中心的六边形细胞培养区域，由109个相互连接的完整六边形腔室和24个半六边形腔室组成，呈蜂窝状结构。芯片深度为100 µm。培养基通道与细胞培养区域之间通过宽度约为15 µm的狭缝连接，这种设计可防止培养区域产生直接的培养基流动及由此引起的剪切应力，同时仍允许化学物质通过狭缝扩散，并实现营养物质、代谢废物等的交换。化学梯度的形成如图1B所示，其中一个培养基通道含有0.1 mM荧光素，而另一通道不含荧光素。细胞培养于一层透气膜上，通过膜对芯片施加正向背压，使微结构将膜封装固定。装置支架的组成部分如图2所示，实验装置如图3所示，其中培养过程在倒置显微镜下进行，温度维持在37 °C，相对湿度高于85%，并处于常氧气体环境中。
该系统通过明场和荧光通道实现对局部细胞相互作用的详细观察，并可进行空间分辨的下游检测，如免疫荧光、蛋白质印迹或质谱分析。我们先前已以微流控芯片上癌症模型为例，验证了其原理，实现了上皮性和间充质性PC3前列腺癌细胞的长期共培养12，并利用上皮性PC3细胞系观察到耐药性多倍体巨癌细胞的出现13。尽管本文展示了该平台在多西他赛压力梯度下研究上皮性PC3细胞与间充质性前列腺癌细胞时空动态行为的应用，但该微流控系统亦可轻松应用于其他任何细胞系组合以及资源梯度（如药物、营养物质、氧气）的研究。

<table><tbody><tr><td>10 mL BD Luer-Lok 尖端注射器</td><td>BD</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>1x 抗生素-抗真菌素混合液</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF</td><td>Merck KGaA</td><td>18441123163</td><td>光刻胶显影液</td></tr><tr><td>AZ1518</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ1518</td><td>光刻胶</td></tr><tr><td>AZ4330</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ4330</td><td>光刻胶</td></tr><tr><td>Cr 铬蚀刻剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>651826</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberg DWL 66+ 激光直写系统</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>DWL66+</td><td>用于制作光掩模</td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷（HMDS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379212</td><td>用于增强光刻胶附着力</td></tr><tr><td>空心不锈钢针</td><td>New England Small Tube</td><td>NE-1300-01</td><td>&amp;nbsp;.025 外径，.017 内径，长 .500 / 304 型，全硬态</td></tr><tr><td>ibidi 多孔板加热系统，K-Frame</td><td>ibidi</td><td>10929</td><td>载物台培养箱&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Luer-Lok 23 G 分液针头</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>用于连接注射器与管路</td></tr><tr><td>Lumox 35 培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.331</td><td>透气性细胞培养皿</td></tr><tr><td>Microposit 去除剂 1165</td><td>Dow Electronic Materials</td><td>Microposit Remover 1165</td><td>光刻胶剥离剂</td></tr><tr><td>Microseal B 粘合密封膜</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSB1001</td><td>粘合密封剂</td></tr><tr><td>O 型圈（用于 Lumox 培养板密封）</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K114</td><td>编号 27；内径 1-5/16&quot;，外径 1-7/16&quot;；硬度 Duro 70</td></tr><tr><td>O 型圈（用于底部玻璃窗密封）</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K74</td><td>编号 20；内径 7/8&quot;，外径 1&quot;；硬度 Duro 70</td></tr><tr><td>Plasma-Preen 等离子清洗/刻蚀系统</td><td>Plasmatic Systems, Inc</td><td>Plasma-Preen</td><td>氧气等离子体系统</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Samco RIE800iPB 深反应离子刻蚀系统</td><td>Samco</td><td>RIE800iPB</td><td>深反应离子刻蚀系统</td></tr><tr><td>Suss MA6 掩模对准器</td><td>SUSS MicroTec</td><td>MA6</td><td>掩模对准器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>PDMS 弹性体</td></tr><tr><td>TePla M4L 等离子刻蚀机</td><td>PVA TePla</td><td>M4L</td><td>等离子刻蚀机</td></tr><tr><td>三氯-1H,1H,2H,2H-全氟辛基硅烷（PFOTS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>用于硅片硅烷化处理</td></tr><tr><td>Tygon 微孔管（0.020&quot; × 0.060&quot; 外径）</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06419-01</td><td>用于培养基输送的管路</td></tr></tbody></table>

在微流控进化加速器上生成跨越癌细胞群体的异质性药物梯度以实现实时观察

Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation

传统的细胞培养仍然是最常用的临床前模型，尽管其在预测癌症临床结果方面的能力已被证实存在明显局限。微流控芯片上的癌症模型被提出，旨在弥合过于简化的传统二维培养与更为复杂的动物模型之间的差距，后者在产生可靠且可重复的定量结果方面能力有限。本文介绍一种微流控芯片上的癌症模型，该模型能够全面地重现复杂肿瘤微环境的关键组分，同时结构足够简单，可对癌症动态提供稳健的定量描述。这种微流控芯片上的癌症模型——&#34;进化加速器&#34;——将大量癌细胞群体分解为相互连接的肿瘤微环境阵列，同时生成异质性的化疗药物压力分布。通过该系统，可在数周内实时监测癌症在药物浓度梯度作用下的进展及进化动态，并可在实验过程中结合延时成像，开展多种下游实验。

芯片上细胞最佳生长的验证 
实验平台的主要目标是以全面但足够简洁的方式重现复杂肿瘤微环境中关键的组分与相互作用，从而提供定量、可靠且可重复的数据。只有在我们能够完全控制物理和生物化学环境因素的情况下，才能实现这一目标。我们必须排除不需要的因素，或找到将不可控因素纳入定量模型的方法，以正确解读群体行为。
第一个测试是确保细胞在装置上的最佳生长状态。该装置上的细胞增殖速率必须与传统细胞培养中的生长特征相同或相近。作为原理验证，将人前列腺癌细胞系PC3细胞在无外界应力条件下培养于PDMS芯片中。这些细胞的细胞质经荧光标记，以便通过倒置荧光显微镜观察并定量细胞数量。细胞汇合度（定义为细胞覆盖的面积）通过Fiji15软件对荧光图像设定特定荧光强度阈值后，在不同时间点对每个微环境区域进行测量。各选定位置的细胞生长曲线如图4</stron...

我们介绍了一种微流控芯片上的癌症模型，即&#34;进化加速器&#34;技术，该技术可在明确定义的环境条件下，在单细胞水平上对癌症动态进行长期、实时、定量的可控研究。该技术有望作为基础研究或临床前药物开发的体外模型。

传统的细胞培养仍然是最常用的临床前模型，尽管其预测癌症临床结果的能力已被证实有限。

这种我们称之为“进化加速器”的微流控芯片上癌症模型，为在明确定义的环境条件下，于单细胞水平进行长期、实时的癌症动态定量研究提供了一个可控的平台。该技术使我们能够在类似肿瘤的应激环境下，探究癌症的进化动态，获取随时间变化的细胞形态、群体数量、运动性及迁移行为等信息。通过在严格控制的应力梯度下调控和监测混合肿瘤群体的行为，我们的技术可能为临床前药物开发提供一种更具生理相关性的模型。所展示的压力密封封装方法也可应用于其他需要精确调节环境气体成分以及具备下游实验能力的微流控系统。成功开展长期实验的关键在于确保一个物理和生物化学上均稳定的环境。应始终监测温度、湿度和气体成分。首先，在3D打印设备上制作一个能够同时承载透气培养皿的培养皿支架。使用螺丝刀拧开定制的三孔样品板的各个组件。通过紫外线照射对组件进行至少一小时的消毒，并置于无菌环境中。开始细胞系接种时，在每个直径10厘米培养皿中的PC3-Epi或PC3-EMT细胞培养物中加入5毫升胰蛋白酶，在37摄氏度的培养箱中消化5分钟。将细胞从培养皿中转移至15毫升离心管中，然后以150 × g离心3分钟。弃去上清液。将15毫升离心管中的每个细胞沉淀重新悬浮，并使用血细胞计数板对每种PC3-MP或PC3-EMT细胞进行计数。每种细胞类型共分离2.5 × 10⁴个细胞。将两种分离的细胞混合，并加入两毫升培养基。将两毫升细胞培养液分别接种到三个透气培养皿中。将透气培养皿置于37摄氏度培养箱中过夜，使细胞贴壁。通过紫外线照射对PDMS装置消毒至少一小时，并置于无菌环境中。现在设置一个气体供应系统，该系统包括二氧化碳和氧气控制单元、气体泵、气体混合室、加湿器或鼓泡器，以及三套独立的气体阀门和压力表。或者，可使用提供常氧条件的气体供应系统。确保混合室内的相对湿度升高至85%以上。设置一个舞台式培养温控装置，温度为37摄氏度，并配备分别用于顶盖和底板的独立加热单元。第二天，从培养箱中取出透气性培养皿，并确认各组件齐全有序，每个孔都包含一个透气性培养皿支架、一个PDMS芯片支架、一个玻璃窗支架以及一对35毫升宽的玻璃窗。使用配套螺丝组装这些组件，并夹紧透气性培养皿。然后将预热的培养基转移至真空室中，脱气处理20分钟。将PDMS芯片置于氧气等离子体系统中处理30秒，以保持其亲水性。接着，缓慢吸取10 mL脱气后的生长培养基至两个注射器中，另两个注射器则分别吸取10 mL脱气后的目标试剂。例如培养基以及含药物的培养基。将每支单独的注射器通过23号分配针连接至50厘米长的管路，并接入一根中空钢针。将另一根中空钢针插入管路的另一端。推动培养基进入管路以排尽管路中的空气，完成管路预润，并通过封盖层将钢针插入每个PDMS芯片中。用培养基注满储液层，并润湿PDMS图案层。储液层可作为芯片上的气泡捕获结构，防止气泡进入微流控通道系统。然后用培养基装填一支

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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