利用噬菌体展示肽库筛选和鉴定靶向成纤维细胞生长因子受体2的小肽

与其他方法相比，本实验方案无需了解靶蛋白的水合稀释结构及构象形成，即可对新的拮抗剂、激动剂和变构调节剂进行定性和定量分析。本方案高效、操作简便、经济且试剂易于获取。将此高通量筛选方法与等温滴定量热法（ITC）分析相结合，可对功能性小肽进行定性和定量获取。

本实验操作将由本实验室的研究生 Ying Zhao 和 Qiang Wang 演示。开始此操作前，用包被缓冲液配制浓度为 10 微克/毫升的 FGFR2 溶液。取 1 毫升该溶液加入 35 平方厘米的培养皿中，反复旋转混匀，直至表面完全润湿。

在4°C条件下振荡孵育过夜。次日，倒出包被液，加入配制好的封闭液。在4°C条件下孵育至少一小时，随后弃去封闭液，并用TBST快速洗涤平板六次，注意确保平板不干燥。

将原始噬菌体文库重悬于1 mL TBST中，并加入包被的培养皿。在室温下于摇床上轻轻振荡孵育两小时。随后弃去上清液，并用TBST洗涤培养皿10次。

通过向培养皿中加入1毫升0.2摩尔的甘氨酸盐酸溶液，并在室温下轻轻摇动10分钟，洗脱结合的噬菌体。将洗脱液转移至灭菌的微量离心管中，并加入100微升1摩尔的Tris-HCl（pH 9.1）进行中和。首先，将准备好的LB培养基和IPTG X-Gal平板在使用前于37摄氏度预热至少1小时。

使用带滤芯的移液枪头，将洗脱液在LB培养基中用10倍系列稀释法稀释至100微升。当制备的大肠杆菌（E.coli）培养物达到对数生长期中期时，将200微升培养物分别加入已灭菌的微量离心管中，每种洗脱液稀释度对应一管。为启动感染，向含有大肠杆菌培养物的各管中加入50微升相应稀释度的洗脱液。迅速涡旋混匀，并在室温下孵育5分钟。

然后使用涂布棒将90微升该混合物涂布于LB和IPTG X-GAL平板上。5分钟后，将平板倒置，并在37摄氏度下过夜培养。待噬菌斑出现后进行计数。

首先，在250毫升锥形瓶中，将过夜培养物稀释于20毫升LB培养基中。加入未扩增的洗脱液，并在37摄氏度下剧烈振荡培养4.5小时。接着，在4摄氏度下以12,000 × g离心10分钟。

将上清液转移至新的离心管中。在相同条件下再次离心，并弃去沉淀。取上清液上层的80%转移至新的离心管中，加入其体积1/6的20%聚乙二醇和2.5 mol/L氯化钠。

将噬菌体在 4 摄氏度下沉淀过夜。次日，在 4 摄氏度下以 12,000 ×g 离心 15 分钟，收集沉淀的噬菌体。弃去上清液，并在相同条件下再次离心。

使用移液器去除残留的上清液。将沉淀物重悬于1毫升TBS中，并将上清液转移至微量离心管中。在4°C条件下以12,000 × g离心5分钟。

将上清液转移至新的微量离心管中，加入相当于体积1/6的20%聚乙二醇和2.5摩尔氯化钠，再次进行沉淀。冰上孵育15至60分钟。随后，在4°C条件下以12,000 × g离心10分钟。

弃去上清液，并在相同条件下再次离心。用移液器吸除残留的上清液。将沉淀重悬于 200 µL TBS 中，再离心 1 分钟以去除杂质。

然后将上清液转移至新的微量离心管中，以获得扩增后的洗脱液。本研究中，噬菌体的输入数量保持不变，而FGFR2蛋白的包被浓度逐步降低。噬菌体滴度结果显示，回收的噬菌体数量逐渐增加，经过三轮筛选后，较第一轮增加了65倍。

随后进行等温滴定量热（ITC）实验，以测定该小肽与FGFR2的亲和力。结果表明，SP1肽对FGFR2具有高亲和力。该数据证明了筛选方案的有效性。

为了研究SP1肽的生物学活性，使用CCK-8试剂盒进行成纤维细胞增殖实验。将BALB/C3T3细胞与不同浓度的SP1肽共同孵育。结果表明，SP1肽抑制了细胞的生长。

此处必须避免野生型噬菌体的污染。务必使用防气溶胶的移液器吸头。在通过噬菌体扩增进行培养时。

该方法还可用于筛选与碳水化合物、培养细胞及组织结合的小分子肽。这些肽可进一步用于诊断和靶向治疗的扩增