Name: 使用噬菌体显示肽库筛选和识别针对纤维细胞生长因子受体2的小肽 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学习使用噬菌体展示肽库筛选针对FGFR2的小肽，并通过等温滴定量热法分析其亲和力与细胞增殖抑制活性。该方法高效经济，适用于发现受体调节剂。

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本工作由广州市科技计划项目（编号：2016201604030039）资助。

1. 试剂准备
<ol>
	<li>LB（溶菌肉汤）培养基：将1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物和0.5 g NaCl溶解于100 mL H2O中。121°C高压灭菌，4 °C保存。</li>
	<li>四环素母液：用体积比1:1的乙醇与H2O配制20 mg/mL的溶液。-20 °C保存，使用前涡旋混匀。</li>
	<li>IPTG/X-gal溶液：将0.5 g IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和0.4 g X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷）溶于10 mL DMF（二甲基甲酰胺）中。避光保存于-20 °C，可稳定保存一年。</li>
	<li>LB + 四环素（Tet）平板：将1 g细菌胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、0.5 g NaCl和1.5 g琼脂溶解于100 mL H2O中。高压灭菌后冷却至&#60; 70 °C，加入100 μL四环素母液，倒平板。避光，4 °C保存。</li>
	<li>LB + IPTG/X-gal平板：将1 g细菌胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、0.5 g NaCl和1.5 g琼脂溶解于100 mL H2O中。高压灭菌后冷却至&#60; 70°C，加入100 μL IPTG/X-gal溶液，倒平板。避光，4 °C保存。</li>
	<li>甘氨酸-HCl缓冲液（0.2 M）：将1.5014 g甘氨酸和100 mg BSA（牛血清白蛋白）溶于100 mL H2O中，用HCl调节pH至2.2。用0.22 μm滤膜过滤，4 °C保存。</li>
	<li>Tris-HCl缓冲液（1 M）：将12.11 g Tris（三（羟甲基）氨基甲烷）溶于100 mL H2O中，用HCl调节pH至9.1。高压灭菌，4 °C保存。</li>
	<li>包被缓冲液（0.1 M）：将1.68 g NaHCO3溶于200 mL H2O中，用NaOH调节pH至8.6。用0.22 μm滤膜过滤，4 °C保存。</li>
	<li>封闭缓冲液：用含5 mg/mL BSA的0.1 M NaHCO3（pH 8.6）配制。用0.22 μm滤膜过滤，4 °C保存。</li>
	<li>TBS缓冲液：配制含50 mM Tris-HCl（pH 7.5）和150 mM NaCl的溶液。高压灭菌，室温保存。</li>
	<li>0.05%、0.1%或0.5% TBST缓冲液：在TBS中加入0.05%、0.1%或0.5%（v/v）Tween-20。用0.22 μm滤膜过滤，室温保存。</li>
	<li>PEG/NaCl溶液：配制含20%（w/v）聚乙二醇-8000和2.5 M NaCl的溶液。高压灭菌，室温保存。</li>
	<li>TE溶液：取1 mL 1 M Tris-HCl（pH 8.0）和2 mL 50 mM EDTA（pH 8.0），加H2O定容至100 mL。高压灭菌，室温保存。</li>
	<li>碘化物缓冲液：将30 g NaI溶于50 mL TE缓冲液（pH 8.0）中。避光，室温保存。</li>
	<li>顶层琼脂：将1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、0.5 g NaCl和0.7 g琼脂糖溶于100 mL H2O中。高压灭菌后分装为每份15 mL。室温保存备用。</li>
</ol>
2. 第一轮生物筛选：筛选结合FGFR2胞外域的噬菌体克隆
注意：为尽量减少环境中噬菌体的污染，所有实验步骤均应使用抗气溶胶移液器吸头并佩戴手套。
<ol>
	<li>在包被缓冲液中配制10 µg/mL的FGFR2（纯度&#62; 97%；参见材料表）溶液。将1 mL上述溶液加入35 cm2培养皿中，反复旋转混匀，直至表面完全润湿。于4 °C振荡孵育过夜。 
	注意：为避免筛选出诱饵靶标结合物，靶蛋白必须高度纯化。</li>
	<li>在5 mL LB + Tet培养基中接种大肠杆菌（Escherichia coli (E. coli)）ER2738菌株，于37 °C振荡培养5–10小时。扩增后的ER2738细胞将用于步骤3.3中的滴定。</li>
	<li>倒掉培养皿中的包被液（必须去除多余液体），加入封闭液。于4 °C孵育至少1小时。</li>
	<li>弃去封闭液，用TBST（TBS + 0.05% (v/v) Tween-20）快速洗涤6次。避免培养皿干燥。</li>
	<li>将原始噬菌体文库用1 mL TBST重悬（终浓度为1011噬菌斑形成单位（PFU）），加入包被后的培养皿中，在室温下轻轻摇动孵育2小时。</li>
	<li>弃去上清液，用TBST（TBS + 0.05% (v/v) Tween-20）洗涤10次，操作同步骤2.4。 
	注意：必须通过充分洗涤彻底去除未结合的噬菌体。</li>
	<li>向培养皿中加入1 mL 0.2 M甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 2.2），室温下轻轻摇动10分钟，以洗脱结合的噬菌体。</li>
	<li>将洗脱液转移至无菌微量离心管中，并加入100 µL 1 M Tris-HCl（pH 9.1）进行中和。 
	注意：在步骤2.6中，应通过10次剧烈洗涤尽可能去除未结合的噬菌体，此步骤至关重要。洗脱的噬菌体可在4 °C保存一周，但最好尽快进行下一步操作。</li>
</ol>
3. 洗脱噬菌体的滴度测定
<ol>
	<li>使用前，将 LB + IPTG/X-gal 平板在 37 °C 下预热至少 1 小时。</li>
	<li>用 LB 培养基对步骤 2.8 中的洗脱液进行 100 µL 的 10 倍系列稀释（即 101、102、103 和 104）。使用带滤芯的吸头以避免污染。</li>
	<li>使步骤 2.2 中的菌液达到对数中期（OD600 ≈ 0.5）。将 200 µL 菌液分装至灭菌的微量离心管中，每种洗脱液稀释度各一管。</li>
	<li>为启动感染，将步骤 3.2 中每种稀释液各 10 µL 加入含有步骤 3.3 中 E. coli ER2738 菌液的各个微量离心管中。迅速涡旋混匀，并在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>用涂布棒将步骤 3.4 中的混合物 90 μL 涂布于 LB + IPTG/X-gal 平板上。</li>
	<li>可选：在微波炉中融化顶层琼脂，每种洗脱液稀释度分别取 3 mL 加入无菌培养管中，并将培养管保持在 45 °C。将步骤 3.4 中的混合物转移至含有 45 °C 融化顶层琼脂的培养管中，迅速混匀后立即倾注于预热的 LB/IPTG/X-gal 平板上。轻轻倾斜并旋转平板，使顶层琼脂均匀铺展。</li>
	<li>5 分钟后，将平板倒置，并在 37 °C 下过夜孵育。</li>
	<li>计数含有约 100 个噬菌斑的平板。将每个平板上的噬菌斑数乘以相应的稀释倍数，得到每 10 µL 中的噬菌体滴度（PFU）。</li>
	<li>另取 5 mL LB + Tet 培养基，接种 E. coli ER2738，在 37 °C 振荡培养过夜，用于噬菌体扩增。 
	注意：用于测定噬菌体滴度时，应使用处于对数中期（OD600 ≈ 0.5）的 ER2738 菌液。若 X-gal/IPTG 平板上大多数噬菌斑为白色，表明噬菌体库已被野生型噬菌体污染。一旦发生污染，必须从无污染的噬菌体储存液重新开始淘选步骤。</li>
</ol>
4. 噬菌体扩增
<ol>
	<li>将步骤 3.8 中的过夜培养物在 250 mL 锥形瓶中的 20 mL LB 培养基中稀释（1:100）。加入未扩增的洗脱液，并在 37 °C 下剧烈振荡培养 4.5 小时。</li>
	<li>将培养物转移至离心管中，在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。将上清液转移至新管中，再次离心，并弃去沉淀。</li>
	<li>将上清液上层的 80% 转移至新管中，并加入 1/6 体积的 20% PEG/2.5 M NaCl。于 4 °C 下静置过夜，使噬菌体沉淀。 
	注意：需将培养上清液与 PEG/2.5 M NaCl 充分混匀。</li>
	<li>在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟，收集沉淀的噬菌体。弃去上清液，再次离心，并用移液器去除残留的上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于 1 mL TBS 中，并将上清液转移至微量离心管中。在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的微量离心管中，加入 1/6 体积的 20% PEG/2.5 M NaCl 再次沉淀。冰上孵育 15–60 分钟。在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，重新离心，并用移液器去除残留的上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于 200 μL TBS 中，并额外离心 1 分钟以去除杂质。将上清液转移至新的微量离心管中，获得扩增后的洗脱液。</li>
	<li>按照第 3 节所述方法测定扩增后噬菌体的滴度。 
	注意：扩增后洗脱液的稀释倍数较未扩增洗脱液更高；通常建议进行 108–1011 的系列稀释。</li>
</ol>
5. 第二轮生物淘选
<ol>
	<li>重复第2至第4节步骤。</li>
	<li>按照第3节所述方法，将第二轮扩增后的洗脱液滴定到LB + IPTG/X-gal平板上。 
	注意：将FGFR2蛋白的包被浓度降低至5 μg/mL。使用步骤4.7中获得的扩增噬菌体作为输入，并保持噬菌体滴度与第一轮相同（1011 PFU）。将噬菌体与包被FGFR2的培养皿孵育时间缩短至1小时，并在洗涤步骤中将Tween浓度提高至0.1%（v/v）。</li>
</ol>
6. 第三轮生物筛选
<ol>
	<li>重复步骤 2.1–2.6。</li>
	<li>通过向培养皿中加入 1 mL 的 20 μM bFGF 溶液（FGFR2 的配体），在室温下轻轻摇动孵育 60 分钟，洗脱结合的噬菌体。</li>
	<li>重复步骤 3.1–3.7。 
	注意：将 FGFR2 蛋白的包被浓度降低至 2.5 μg/mL。使用第 5 部分中扩增的第二轮噬菌体作为输入，噬菌斑形成单位（PFU）滴度与第一轮保持相同（1011 PFU）。将噬菌体与包被 FGFR2 的培养皿孵育时间缩短至 30 分钟，并在洗涤步骤中将 Tween 浓度提高至 0.5%（v/v）。</li>
</ol>
7. 获取斑块DNA用于测序
<ol>
	<li>噬菌斑扩增
	<ol>
		<li>将ER2738的过夜培养物用LB培养基稀释（1:100）。将1 mL稀释后的培养物分装至2 mL离心管中，每种待鉴定的克隆各一管。</li>
		<li>用移液器吸头从第6节的滴定平板上挑取一个分离良好、呈蓝色的噬菌斑，转移至含有稀释培养物的离心管中。共挑取15个噬菌斑。 
		注意：平板应为存放于4 °C、&#60; 1–3天内的新鲜平板，且每个平板上的噬菌斑数量应< &#60; 100个。</li>
		<li>将离心管置于37 °C下剧烈振荡培养4.5小时。</li>
		<li>将培养物转移至离心管中，在12,000 x g 条件下离心30秒。将上清液转移至新管中，再次离心。</li>
		<li>用移液器吸取上清液上层80%转移至新的离心管中。标记为扩增后的噬菌体储备液。 
		注意：将扩增的噬菌体与等体积的100%无菌甘油混合稀释后，于-80 °C保存以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>噬菌斑DNA提取
	<ol>
		<li>将500 µL扩增后的噬菌体溶液转移至新的微量离心管中，加入1/6体积的20% PEG/2.5 M NaCl溶液。颠倒混匀后，室温静置10–20分钟。</li>
		<li>在4 °C、12,000 x g 条件下离心10分钟，然后倒掉上清液。 
		注意：噬菌体沉淀可能不可见。</li>
		<li>再次离心，小心移除残留的上清液。</li>
		<li>通过剧烈轻弹管壁，将沉淀充分重悬于100 µL碘化物缓冲液中。</li>
		<li>加入250 µL 100%乙醇，室温孵育15分钟。</li>
		<li>在4 °C、12,000 x g 条件下离心10分钟，弃去上清液。用0.5 mL 70%乙醇洗涤沉淀，快速再次离心后弃去上清液，并短暂干燥沉淀。</li>
		<li>将沉淀重悬于30 µL TE缓冲液中，用于测序。 
		注意：在进行步骤7.2.6前，应提前将70%乙醇预冷至-20°C。在加入乙醇前，必须确保噬菌体沉淀已在碘化物缓冲液中充分重悬。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 肽序列的鉴定
<ol>
	<li>使用 -96 gIII 测序引物（5´-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG –3´）进行测序。</li>
	<li>根据DNA测序结果分析噬菌体表面展示的肽序列。</li>
	<li>合成小肽并通过高效液相色谱（HPLC）和质谱分析，以确认其纯度（≥98%）。</li>
</ol>
9. 通过等温滴定量热法检测获得的小肽与FGFR2胞外蛋白的亲和力
<ol>
	<li>使用超声波仪器对无菌水进行脱气处理。将小肽和FGFR2胞外蛋白溶解于无菌水中。离心样品以去除残留的沉淀物。</li>
	<li>在25 °C下进行等温滴定量热（ITC）滴定实验。将40 μM的小肽置于样品池中，从注射器中加入1.5 μM的FGFR2蛋白，搅拌速度为750 rpm。每隔5分钟以2 μL等分量加入FGFR2蛋白（共19次注射）。</li>
	<li>使用单一位点结合模型分析ITC数据。 
	注意：无菌水必须脱气，所有样品均需离心以去除气泡和残留杂质。实验必须在25 °C的恒定温度下进行。</li>
</ol>
10. 使用细胞增殖实验验证所获得小肽的生物学活性
<ol>
	<li>在96孔板中接种BALB/c 3T3细胞（每孔3.0 × 103个细胞，100 μL），加入含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），于37 °C、5% CO2条件下培养过夜。</li>
	<li>弃去上清液，更换为含0.5% FBS的新鲜DMEM，饥饿处理细胞12小时。</li>
	<li>用补充了0.5% FBS的新鲜DMEM对小分子肽进行系列稀释（浓度分别为0、0.0064、0.032、0.16、0.8、4、20和100 μM，每浓度设6个复孔），弃去96孔板中的上清液，每孔加入100 μL小分子肽溶液。于37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。</li>
	<li>弃去上清液，每孔加入含10%细胞计数试剂盒（CCK）-8溶液的新鲜DMEM 100 μL，孵育2小时。</li>
	<li>使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度，分析细胞活力。</li>
</ol>

<ol><li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li>
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作者声明不存在经济利益冲突。

组合噬菌体文库是一种强大且高效的工具，可用于高通量筛选能够结合靶分子并调控其功能的新型肽段13。目前，噬菌体展示肽库具有广泛的应用。例如，可用于筛选与受体蛋白结合的生物活性肽23、非蛋白靶标24，25、疾病特异性抗原模拟物13、细胞特异性肽段26，27、或组织/器官特异性肽段21，28，29，以及用于开发肽介导的药物递送系统19，30。简而言之，噬菌体展示肽库是在...

成纤维细胞生长因子受体（FGFRs）在体内细胞增殖、伤口愈合和血管生成中发挥关键作用1。在多种肿瘤中观察到FGFR信号通路的异常激活2,3,4,5，包括基因扩增、基因突变、染色体异常以及配体过度分泌6。许多靶向FGFR的抑制剂在临床试验中显示出良好的治疗效果，主要分为三类：（1）小分子激酶抑制剂，可结合FGFR的胞内结构域；（2）靶向胞外段的拮抗剂；（3）FGF配体捕获剂6。尽管部分小分子激酶抑制剂在体外和体内均表现出良好的治疗效果7，但大多数药物靶向特异性较差，并可能引起高血压等不良反应8。大多数拮抗剂为单克隆抗体9,10和多肽11。与小分子相比，多肽具有更高的特异性和更低的副作用。与蛋白质类药物相比，多肽还具有细胞通透性良好、不易在特定器官中蓄积的优点12。因此，靶向性小肽是一类高效且具有前景的治疗剂。
噬菌体展示技术是一种简便而强大的工具，可用于鉴定能够与特定分子结合的小肽13,14,15。我们使用了一种基于简单M13噬菌体的噬菌体展示肽库，其尾部展示出超过109种不同的肽序列，可用于与靶分子结合（见材料表）16。由于噬菌体对特定分子具有高亲和力，未结合的噬菌体可通过洗涤去除，仅保留与目标分子紧密结合并携带所需短肽的噬菌体。特定的分子靶标可以是固定的蛋白质17,18、碳水化合物、培养的细胞，甚至是无机材料19,20。已有研究报道，利用噬菌体展示技术在活体（in vivo）中筛选出器官特异性肽，这是一个令人振奋的案例21。噬菌体展示技术的优点包括高通量、操作简便、成本低以及应用范围广泛22。
本研究中，我们提供了一种利用噬菌体展示文库筛选结合固定化蛋白（FGFR2）的小肽的详细实验方案。同时，通过等温滴定量热法（ITC）测定所获得肽段与FGFR2之间的亲和力，并通过细胞增殖实验评估其生物学活性，以验证该技术的有效性。该方法还可拓展用于筛选结合碳水化合物、培养细胞甚至无机材料的小肽。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Merck Millipore</td><td>MPGP002A1</td><td></td></tr><tr><td>35 cm² 小培养皿</td><td>Thermo</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>广州化学试剂厂</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>-96 gIII 测序引物</td><td></td><td></td><td>由生工生物工程（上海）股份有限公司合成</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Nest</td><td>701001-2</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>碧云天</td><td>ST004D</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Oxoid</td><td>L0037</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c 3T3 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-&amp;shy;6587</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>百奥龙</td><td>BD-M10110</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 试剂盒</td><td>DOJINDO</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>sh30243.01</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Newprobe</td><td>PB10247</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576028</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 蛋白</td><td>义翘神州公司</td><td>10014-HNAE</td><td>纯度 &gt;95%</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>G8898-1KG</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>碧云天</td><td>ST097</td><td></td></tr><tr><td>ITC200 系统</td><td>MicroCal Omega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>广州化学试剂厂</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>NaI</td><td>毕得医药</td><td>BD40879</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>广州化学试剂厂</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>PEG&amp;ndash;8000</td><td>Sigma</td><td>P2139-250</td><td></td></tr><tr><td>Ph.D.-7 噬菌体展示肽库试剂盒</td><td>New England BioLabs</td><td>E8100S</td><td>包含 Ph.D.-7 噬菌体文库、&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ER2738 宿主菌株和 M13KE 对照噬菌体</td></tr><tr><td>重组 FGFR2 胞外域蛋白</td><td>义翘神州公司</td><td>10824-H08H</td><td>纯度 &gt; 97%</td></tr><tr><td>小肽</td><td></td><td></td><td>由吉尔生化有限公司（中国上海）合成</td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma</td><td>S-SHS-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>SLF-T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>碧云天</td><td>ST825</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>碧云天</td><td>ST912</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

利用噬菌体展示肽库筛选和鉴定靶向成纤维细胞生长因子受体2的小肽

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

人类成纤维细胞生长因子受体（FGFR）家族包含四个成员，即 FGFR1、FGFR2、FGFR3 和 FGFR4，参与多种生物学活动，包括细胞增殖、存活、迁移和分化。在多种癌症中已发现 FGFR 信号通路存在多种异常，这些异常由基因突变或基因扩增事件引起。因此，近期研究集中于开发靶向 FGFR 的治疗策略。目前处于不同临床前和临床开发阶段的 FGFR 抑制剂主要包括酪氨酸激酶小分子抑制剂或单克隆抗体，而基于肽类的抑制剂在研数量较少。本文提供了一种利用噬菌体展示技术筛选 FGFR2 拮抗小肽的实验方案。简言之，将噬菌体展示肽库与包被有 FGFR2 的酶标板共同孵育，随后用 TBST（TBS + 0.1% [v/v] Tween-20）洗去未结合的噬菌体，并用 0.2 M 盐酸甘氨酸缓冲液（pH 2.2）洗脱结合的噬菌体。洗脱后的噬菌体进一步扩增，并作为下一轮生物淘选的输入材料。经过三轮生物淘选后，通过 DNA 测序鉴定各个噬菌体克隆的肽序列。最后，对筛选出的肽进行合成，并分析其亲和力和生物学活性。

获得靶向FGFR2的高亲和力小肽。
为筛选靶向 FGFR2 的噬菌体，本研究使用了 Ph.D.-7 文库。该实验流程的示意图如图1所示。在此过程中，噬菌体输入量（PFU）保持不变，而 FGFR2 蛋白的包被浓度逐步降低。噬菌体滴度结果显示，回收的噬菌体数量逐渐增加，经过3轮筛选后，较第一轮增加了65倍（Table 1）。
接下来，我们在第三轮筛选后随机挑选噬菌体克隆，并提取噬菌体DNA进行测序。通过筛选获得的一个代表性肽段（WRARVPL）被命名为SP1。随后将其合成，并通过质谱法测定其分子量。
SP1 肽对 FGFR2 表现出高结合亲和力。
采用等温滴定量热法（ITC）实验测定小肽与FGFR2的亲和力。结果表明，SP1肽对FGFR2具有较高的亲和力（Kd ...

本文介绍了一种利用噬菌体展示肽库筛选结合FGFR2的小肽的详细实验方案。我们进一步在体外分析了所筛选小肽与FGFR2的亲和力及其抑制细胞增殖的能力。

人类成纤维细胞生长因子受体（FGFR）家族包含四个成员，即 FGFR1、FGFR2、FGFR3 和 FGFR4，它们参与多种……

与其他方法相比，本实验方案无需了解靶蛋白的水合稀释结构及构象形成，即可对新的拮抗剂、激动剂和变构调节剂进行定性和定量分析。本方案高效、操作简便、经济且试剂易于获取。将此高通量筛选方法与等温滴定量热法（ITC）分析相结合，可对功能性小肽进行定性和定量获取。本实验操作将由本实验室的研究生 Ying Zhao 和 Qiang Wang 演示。开始此操作前，用包被缓冲液配制浓度为 10 微克/毫升的 FGFR2 溶液。取 1 毫升该溶液加入 35 平方厘米的培养皿中，反复旋转混匀，直至表面完全润湿。在4°C条件下振荡孵育过夜。次日，倒出包被液，加入配制好的封闭液。在4°C条件下孵育至少一小时，随后弃去封闭液，并用TBST快速洗涤平板六次，注意确保平板不干燥。将原始噬菌体文库重悬于1 mL TBST中，并加入包被的培养皿。在室温下于摇床上轻轻振荡孵育两小时。随后弃去上清液，并用TBST洗涤培养皿10次。通过向培养皿中加入1毫升0.2摩尔的甘氨酸盐酸溶液，并在室温下轻轻摇动10分钟，洗脱结合的噬菌体。将洗脱液转移至灭菌的微量离心管中，并加入100微升1摩尔的Tris-HCl（pH 9.1）进行中和。首先，将准备好的LB培养基和IPTG X-Gal平板在使用前于37摄氏度预热至少1小时。使用带滤芯的移液枪头，将洗脱液在LB培养基中用10倍系列稀释法稀释至100微升。当制备的大肠杆菌（E.coli）培养物达到对数生长期中期时，将200微升培养物分别加入已灭菌的微量离心管中，每种洗脱液稀释度对应一管。为启动感染，向含有大肠杆菌培养物的各管中加入50微升相应稀释度的洗脱液。迅速涡旋混匀，并在室温下孵育5分钟。然后使用涂布棒将90微升该混合物涂布于LB和IPTG X-GAL平板上。5分钟后，将平板倒置，并在37摄氏度下过夜培养。待噬菌斑出现后进行计数。首先，在250毫升锥形瓶中，将过夜培养物稀释于20毫升LB培养基中。加入未扩增的洗脱液，并在37摄氏度下剧烈振荡培养4.5小时。接着，在4摄氏度下以12,000 × g离心10分钟。将上清液转移至新的离心管中。在相同条件下再次离心，并弃去沉淀。取上清液上层的80%转移至新的离心管中，加入其体积1/6的20%聚乙二醇和2.5 mol/L氯化钠。将噬菌体在 4 摄氏度下沉淀过夜。次日，在 4 摄氏度下以 12,000 ×g 离心 15 分钟，收集沉淀的噬菌体。弃去上清液，并在相同条件下再次离心。使用移液器去除残留的上清液。将沉淀物重悬于1毫升TBS中，并将上清液转移至微量离心管中。在4°C条件下以12,000 × g离心5分钟。将上清液转移至新的微量离心管中，加入相当于体积1/6的20%聚乙二醇和2.5摩尔氯化钠，再次进行沉淀。冰上孵育15至60分钟。随后，在4°C条件下以12,000 × g离心10分钟。弃去上清液，并在相同条件下再次离心。用移液器吸除残留的上清液。将沉淀重悬于 200 µL TBS 中，再离心 1 分钟以去除杂质。然后将上清液转移至新的微量离心管中，以获得扩增后的洗脱液。本研究中，噬菌体的输入数量保持不变，而FGFR2蛋白的包被浓度逐步降低。噬菌体滴度结果显示，回收的噬菌体数量逐渐增加，经过三轮筛选后，较第一轮增加了65倍。随后进行等温滴定量热（ITC）实验，以测定该小肽与FGFR2的亲和力。结果表明，SP1肽对FGFR2具有高亲和力。该数据证明了筛选方案的有效性。为了研究SP1肽的生物学活性，使用CCK-8试剂盒进行成纤维细胞增殖实验。将BALB/C3T3细胞与不同浓度的SP1肽共同孵育。结果表明，SP1肽抑制了细胞的生长。此处必须避免野生型噬菌体的污染。务必使用防气溶胶的移液器吸头。在通过噬菌体扩增进行培养时。该方法还可用于筛选与碳水化合物、培养细胞及组织结合的小分子肽。这些肽可进一步用于诊断和靶向治疗的扩增

screening-identification-small-peptides-targeting-fibroblast-growth

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用噬菌体显示肽库筛选和识别针对纤维细胞生长因子受体2的小肽

采用噬菌体展示文库筛选靶向骨组织的肽序列。研究目的是探讨这些肽对间充质细胞分化的影响，并确定其对骨再生的作用。...

来自噬菌体展示文库的多肽调节间充质细胞中的基因表达并促进单皮质骨缺损中的成骨作用

本文描述了一种可视化的方法，用于从噬菌体展示的组合合成抗体文库中，同时针对数百种抗原进行可扩展的高通量筛选。通过这种并行方法，我们分离出的抗体片段对多种抗原具有高亲和力和特异性，并可在标准免疫测定中发挥功能。...

可扩展的高通量噬菌体展示合成抗体文库筛选

多肽阵列筛选是一种用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用位点的高通量检测方法。该方法可实现对目标蛋白质多种相互作用的定位，也可用于发现靶向该蛋白质的抑制剂作用位点。本文中，我们描述了一种多肽阵列筛选与分析的实验方案。...

利用肽阵列鉴定蛋白质-蛋白质相互作用位点

我们提供一种方法，利用大肠杆菌（Escherichia...

用于筛选抗体片段文库的细菌内膜展示技术

生物淘选细菌展示文库是发现肽类亲和试剂的一种成熟技术，可作为抗体的可靠替代方法。本文所述的半自动化分选方法简化了生物淘选流程，降低了假阳性结果的出现频率。本文将阐述在候选分子评估及减少下游分析工作量方面所采用的思路与技术。...

用于肽亲和试剂发现及分离株分析的细菌展示文库半自动生物筛选

本文介绍了一种用于高通量筛选细胞外蛋白微阵列以鉴定新型受体-配体相互作用的实验方案。同时，我们还描述了一种通过使用蛋白-微珠复合物来增强瞬时蛋白质-蛋白质相互作用检测的方法。...

用于高通量检测低亲和力受体-配体相互作用的细胞外蛋白微阵列技术

本文介绍一种筛选大肠杆菌（E.

细菌肽展示技术用于筛选新型生物素化酶

本研究旨在提出一种用于鉴定药物-肽相互作用的策略。该策略基于石英晶体微天平（QCM）生物传感器进行识别药物的短肽的生物筛选，随后通过生物信息学分析，对获得的药物识别信息及蛋白质上药物结合位点的注释进行定量评估。...

基于生物传感器的高通量生物筛选与生物信息学分析策略用于药物-蛋白质相互作用的全局验证

介绍了生成可经由MRGPRX2受体激活肥大细胞的短肽文库的技术。相关技术操作简便、成本低廉，且可拓展应用于其他细胞受体。...

利用基因工程HEK细胞筛选激活MRGPRX2的多肽

泛素化是一种关键的蛋白质翻译后修饰，其失调与多种人类疾病相关。本方案详细介绍了如何利用噬菌体展示技术分离新型泛素变体，这些变体能够结合并调控E3连接酶的活性，从而控制泛素化的特异性、效率和修饰模式。...

利用噬菌体展示技术开发针对E3泛素连接酶的泛素变体调节剂

学习使用噬菌体展示肽库筛选针对FGFR2的小肽，并通过等温滴定量热法分析其亲和力与细胞增殖抑制活性。该方法高效经济，适用于发现受体调节剂。

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