Name: siRNA 电穿孔以在单纯疱疹病毒类型 1-感染单细胞衍生的丹突细胞中调制自噬 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 了解利用siRNA电穿孔技术在单纯疱疹病毒1型感染的树突状细胞中调控自噬的方法。该技术可特异性阻断自噬流而不影响细胞成熟，为研究病毒免疫逃逸机制提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由德国研究基金会（DFG）通过授予AS的项目STE 432/11-1以及由埃尔朗根-纽伦堡大学医学院ELAN计划通过授予LG的项目18-12-21-1资助。

单核细胞来源的树突状细胞（DC）由健康供体的白细胞分离产品制备。本研究已获得当地伦理委员会的批准（批准编号 4556）。本研究中的实验均遵循埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学（&#34;Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg）伦理委员会的建议（批准编号 4556）。所有供体均签署了书面知情同意书，同意书内容符合《赫尔辛基宣言》的要求。
1. 不成熟树突状细胞（iDCs）和成熟树突状细胞（mDCs）的制备与处理
<ol>
	<li>按照先前所述方法，从白细胞减少系统腔室（LRSCs）中分离人外周血单个核细胞（PBMCs）27。避免对PBMCs进行冷冻保存，应在分离后直接使用，以获得更高的树突状细胞（DC）产量。</li>
	<li>如先前所述10,27，在T175细胞培养瓶中利用不同健康供体的PBMCs生成人树突状细胞（DCs）。简言之，每个细胞培养瓶中加入3.5–4亿个PBMCs，置于30 mL DC培养基（RPMI 1640不含L-谷氨酰胺，1% (v/v) AB血清，100 U/mL青霉素，100 mg/mL链霉素，0.4 mM L-谷氨酰胺，10 mM HEPES）中，通过贴壁法分离单核细胞。1小时后，用RPMI 1640洗去非贴壁细胞组分。加入新鲜DC培养基，并补充800 U/mL GM-CSF和250 U/mL IL-4，培养3天。
	<ol>
		<li>贴壁后第3天，每瓶加入5 mL新鲜DC培养基，其中含GM-CSF和IL-4，终浓度分别为400 U/mL和250 U/mL，用于DC的分化。</li>
		<li>在贴壁后第4天，轻轻冲洗细胞培养瓶底部松散贴壁的未成熟树突状细胞（iDCs），以收获iDCs。重复此步骤2次。为生成成熟树突状细胞（mDCs），加入成熟诱导混合液，其成分为：GM-CSF（终浓度：40 U/mL），IL-4（终浓度：250 U/mL），IL-6（终浓度：1000 U/mL），IL-1β（终浓度：200&#160;U/mL），TNF-α（终浓度：10 ng/mL），前列腺素E2（PGE2；终浓度：1 μg/mL）。</li>
		<li>贴壁后第6天（即使用细胞因子混合液诱导成熟后的第2天），冲洗细胞培养瓶底部的mDCs。重复此步骤两次。 
		注：未成熟和成熟DCs可从同一供体在同一个细胞培养瓶中依次生成。具体操作为：(i) 分离出所需数量的iDCs；(ii) 使用步骤1.2.2中列出的细胞因子混合液诱导瓶中剩余细胞成熟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将iDCs或mDCs连同相应的细胞培养基转移至50 mL离心管中。在300 × g条件下离心5分钟，收集细胞。
	<ol>
		<li>每个细胞培养瓶用5–10 mL RPMI 1640轻柔重悬（即洗涤）DCs，并将相应的DC悬液合并至同一管中。</li>
		<li>使用细胞计数板或其他方法确定细胞数量。处理iDCs时应避免温度变化，以降低表型改变的风险。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过流式细胞术分析监测表型成熟状态
<ol>
	<li>将步骤 1.3.1 中的 iDCs 或 mDCs（0.5 × 106）转移至 1.5 mL 离心管中。在 3390 × g 条件下离心 1.5 分钟收集细胞。用 FACS 缓冲液（含 2% 胎牛血清（FCS）的 PBS）洗涤细胞一次。</li>
	<li>将细胞重悬于 100 µL 抗体染色液（FACS 缓冲液）中，该溶液含有针对特定表面分子的荧光染料标记抗体。
	<ol>
		<li>使用以下抗体验证细胞纯度（CD3-FITC、CD14-PE）以及 DCs 的成熟状态（CD80-PacBlue/-PE-Cy5、CD11c-PE-Cy5、CCR7-PE-Cy7、CD83-APC、CD86-PE、MHCII-APC-Cy7）。</li>
		<li>在 100 µL FACS 缓冲液中准备一份未染色样本作为对照。</li>
		<li>将细胞在冰上避光孵育 30 分钟进行染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>随后用 1 mL FACS 缓冲液洗涤细胞两次，每次在 3390 × g 条件下离心 1.5&#160;分钟。</li>
	<li>最后，将细胞重悬于 200 µL 含 2% 多聚甲醛（PFA）的 FACS 缓冲液中，并通过流式细胞术分析细胞。固定后的细胞可在 4°C 避光保存最多 2 天。</li>
</ol>
3. 树突状细胞感染单纯疱疹病毒1型（HSV-1）及通过spautin-1或bafilomycin-A1干扰HSV-1诱导的自噬流
注意：本研究中使用的 HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43（HSV-1 EGFP）毒株源自实验室毒株 HSV-1 17+。HSV-1 EGFP 毒株在 CMV 启动子调控下，于 UL43 基因位点插入了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，从而表达 EGFP。EGFP 可作为 HSV-1 感染的标记物。此外，树突状细胞（DC）感染研究中使用了 HSV1-RFPVP26 毒株（先前在 Turan 等人，2019 年中已有描述）。该病毒表达与单体红色荧光蛋白（mRFP）融合的衣壳表面蛋白 VP26。
<ol>
	<li>将步骤1.3中的iDCs或mDCs（2 × 106）转移至2 mL离心管中。随后在3390 × g条件下离心1.5分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>用感染培养基（含20 mM HEPES的RPMI 1640）轻轻重悬细胞。
	<ol>
		<li>为抑制自噬溶酶体降解通路，在感染前1小时用spautin-1或bafilomycin-A1预处理树突状细胞。向感染培养基中加入10 µM spautin-1或1 µM BA1，或加入DMSO作为未处理对照。将细胞置于37 °C、300 rpm振荡的恒温金属浴中孵育1小时。</li>
		<li>进行感染实验时，以感染复数（MOI）为2的HSV-1病毒颗粒接种细胞。以相应体积的MNT缓冲液（30 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）、100 mM NaCl、20 mM Tris）作为模拟感染对照。将细胞置于37 °C、300 rpm振荡的恒温金属浴中孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染后1小时（hpi），在3390 × g条件下离心1.5分钟收集细胞。吸除接种液，用含有40 U/mL GM-CSF、250 U/mL IL-4以及10 µM spautin-1、1 µM BA1或DMSO（对照）的DC培养基轻轻重悬细胞。将模拟处理和HSV-1感染的细胞以终浓度1 × 106/mL接种至6孔板中。</li>
	<li>在感染后16–24小时（hpi），通过冲洗（mDCs）或使用细胞刮刀（iDCs）收集细胞。将细胞转移至1.5 mL防脱管中。
	<ol>
		<li>在3390 × g条件下离心1.5分钟收集细胞，加入1 mL PBS洗涤沉淀一次。</li>
		<li>在裂解液中剧烈重悬细胞，裂解液包含29 µL 2× Roti-Load、1 µL 100&#160;mM MgCl2和12.5 U/mL benzonase。</li>
		<li>为实现细胞裂解及DNA消化，将样品在37 °C孵育10分钟。随后在95 °C变性蛋白质10分钟。</li>
		<li>进行SDS-PAGE和Western blot分析，检测LC3BI/II、p62、ICP0/5和GAPDH的蛋白水平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过电穿孔将 FIP200-siRNA 转入未成熟树突状细胞以干扰 HSV-1 诱导的自噬流
注意：本实验中siRNA电穿孔方案经Prechtel等（2007年）和Gerer等（2017年）文献修改而来。
<ol>
	<li>在贴壁后第3.5天，将iDCs（12 × 106）转移至50 mL离心管中。随后在300 × g条件下离心5分钟，并弃去上清液。同时，按照步骤2所述进行流式细胞术分析以监测细胞成熟状态（使用Life/Dead violet染料替代CD80-PacBlue）。</li>
	<li>用5 mL不含酚红的OptiMEM轻柔洗涤iDCs，并在300 × g条件下离心5分钟。弃去上清液后，将iDCs轻柔重悬于200 µL不含酚红的OptiMEM中，调整细胞浓度至6 × 106/100 µL。切勿将细胞置于冰上，避免温度变化。操作应迅速进行，避免iDCs在不含酚红的OptiMEM中长时间孵育。</li>
	<li>将75&#160;pmol FIP200特异性siRNA或作为对照的75 pmol随机序列siRNA加入4 mm电穿孔杯中，随后加入100 µL细胞悬液（含6×106个细胞）。&#160;立即使用电穿孔仪I进行电穿孔，设置参数为：500 V，持续1 ms。
	<ol>
		<li>实验前按照制造商说明配制siRNA悬液，分装后储存于-20 °C。使用时冰上解冻并保持低温。在对样品进行电穿孔前，需先进行测试脉冲。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电穿孔后，立即将iDCs转移至6孔板中，加入新鲜预热的DC培养基（含40 U/mL GM-CSF和250 U/mL IL-4）。将细胞接种至终浓度为1 × 106/mL，并放入培养箱中。切勿用水冲洗电穿孔杯中的细胞。</li>
	<li>48小时后，首先在显微镜下观察电穿孔后iDCs的形态。然后使用细胞刮刀收集细胞并转移至15 mL离心管中。用含0.01% EDTA的1 mL PBS冲洗培养孔，并将冲洗液转移至相应离心管中。</li>
	<li>随后，按照以下步骤将每种siRNA处理条件下的6 × 106个iDCs进行分组。
	<ol>
		<li>取0.5 × 106个细胞，按照步骤2所述评估细胞成熟状态和细胞活力。使用以下抗体：CD11c-PE-Cy5、CCR7-PE-Cy7、CD83-APC、MHCII-APC-Cy7以及Life/Dead violet。</li>
		<li>取1 × 106个细胞用于Western blot分析，以验证FIP200特异性敲低效率。通过在3390 × g条件下离心1.5分钟，将细胞转移并收集至1.5 mL安全锁离心管中。按照步骤3.4所述制备细胞裂解液，并进行Western blot分析。</li>
		<li>将剩余细胞（4.5 × 106）用于HSV-1感染实验。针对每种实验条件，将2.25 × 106个iDCs转移至2 mL离心管中，分别以MOI为2的HSV-1进行感染，或加入MNT缓冲液作为模拟对照。感染操作按照步骤3.3所述进行。</li>
		<li>感染后20小时（20 hpi），使用细胞刮刀收集细胞，并按照步骤3.4所述制备细胞裂解液用于Western blot分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 利用KIF1B/2A-siRNA电穿孔技术调控HSV-1感染的mDCs中自噬小体-溶酶体通路
<ol>
	<li>在贴壁后第4天，将24 × 106个iDC转移至50 mL离心管中。随后在300 × g条件下离心5分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>用8 mL PBS轻柔重悬（即洗涤）iDC，调整最终细胞浓度为3 × 106/mL。将3 × 106个细胞转移至1.5 mL离心管中，在3390 × g条件下离心1.5分钟以收集细胞。</li>
	<li>将iDC重悬于100 µL含有补充剂混合物的P3缓冲液中（按照生产商说明书操作；电穿孔试剂盒装置II），并分别加入：(i) 75&#160;pmol KIF1B特异性siRNA，(ii) 75 pmol KIF2A特异性siRNA，或(iii) 两者同时加入。使用(iv)等量的乱序siRNA作为对照。每种siRNA条件准备两个离心管（共6 × 106个细胞），并将悬液分别转移至独立的电穿孔杯中。使用电穿孔装置II直接对iDC施加&#34;EH-100"脉冲。
	<ol>
		<li>实验前按照生产商说明书配制siRNA悬液，分装后于-20 °C保存。使用时冰上解冻并保持低温。切勿将iDC置于冰上，避免温度变化。操作应迅速，避免iDC在PBS或P3缓冲液中长时间孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电穿孔后立即向电穿孔杯中加入500 µL预热的RPMI 1640培养基。将细胞在培养箱中孵育5–10分钟。将iDC转移至6孔板中，加入新鲜预热的DC培养基（含40 U/mL GM-CSF和250 U/mL IL-4）。将相同处理条件的细胞合并至同一孔中，以最终浓度1·106/mL接种，并放入培养箱中培养。</li>
	<li>孵育4小时后，加入含有步骤1.2.2中所列细胞因子的成熟诱导混合液。 
	注意：在电穿孔后第2天，准备一份未进行电穿孔的DC样本（1 × 106个细胞）作为对照，用于流式细胞术分析。对照组细胞的处理方式应与电穿孔样本一致。</li>
	<li>电穿孔后第2天，通过吹打重悬收集细胞并转移至15 mL离心管中。用1 mL PBS冲洗各孔，将冲洗液转移至相应离心管中。按以下步骤将每种siRNA条件下的6·106个DC进行分组：
	<ol>
		<li>取0.25 × 106个DC（电穿孔与未电穿孔）用于检测成熟状态和细胞活力，方法见步骤2。使用以下抗体：CD80-PE-Cy5、CD83-APC、CD86-PE、MHCII-APC-Cy7和Life/Dead violet。</li>
		<li>取0.75 × 106个细胞用于Western blot分析，以评估KIF1B/2A特异性敲低效率。在3390 × g条件下离心1.5分钟，将细胞收集至1.5 mL安全锁离心管中。按照步骤3.4所述方法制备细胞裂解液，并进行Western blot分析。</li>
		<li>取每种siRNA条件下剩余的细胞（5 × 106个）进行HSV-1感染实验。每种实验条件将2.5 × 106个iDC转移至2 mL离心管中，分别以MOI为2的HSV-1感染，或加入MNT缓冲液作为模拟对照。感染操作参照步骤3.3进行。</li>
		<li>感染后20小时，通过吹打重悬收集细胞，并按照上述步骤3.4所述方法制备细胞裂解液，进行Western blot分析，以验证HSV-1诱导的自噬周转是否被激活。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chapuis, F., Rosenzwajg, M., Yagello, M., Ekman, M., Biberfeld, P., Gluckman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+dendritic+cells+from+monocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro.</a> European Journal of Immunology. 27 (2), 431-441 (1997).</li>
<li>Kummer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+induces+CD83+degradation+in+mature+dendritic+cells+with+immediate-early+kinetics+via+the+cellular+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 induces CD83 degradation in mature dendritic cells with immediate-early kinetics via the cellular proteasome.</a> Journal of Virology. 81 (12), 6326-6338 (2007).</li>
<li>Kruse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+dendritic+cells+infected+with+herpes+simplex+virus+type+1+exhibit+inhibited+T-cell+stimulatory+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Mature dendritic cells infected with herpes simplex virus type 1 exhibit inhibited T-cell stimulatory capacity.</a> Journal of Virology. 74 (15), 7127-7136 (2000).</li>
<li>Salio, M., Cella, M., Suter, M., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+dendritic+cell+maturation+by+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of dendritic cell maturation by herpes simplex virus.</a> European Journal of Immunology. 29 (10), 3245-3253 (1999).</li>
<li>Prechtel, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+mature+dendritic+cells+with+herpes+simplex+virus+type+1+dramatically+reduces+lymphoid+chemokine-mediated+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Infection of mature dendritic cells with herpes simplex virus type 1 dramatically reduces lymphoid chemokine-mediated migration.</a> Journal of General Virology. 86, Pt 6 1645-1657 (2005).</li>
<li>Theodoridis, A. A., Eich, C., Figdor, C. G., Steinkasserer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+dendritic+cells+with+herpes+simplex+virus+type+1+induces+rapid+degradation+of+CYTIP%2C+thereby+modulating+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Infection of dendritic cells with herpes simplex virus type 1 induces rapid degradation of CYTIP, thereby modulating adhesion and migration.</a> Blood. 118 (1), 107-115 (2011).</li>
<li>Cohrs, R. J., Gilden, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+herpesvirus+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Human herpesvirus latency.</a> Brain Pathology. 11 (4), 465-474 (2001).</li>
<li>Grinde, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses%3A+latency+and+reactivation+-+viral+strategies+and+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses: latency and reactivation - viral strategies and host response.</a> Journal of Oral Microbiology. 5, (2013).</li>
<li>Whitley, R. J., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus infections.</a> The Lancet. 357 (9267), 1513-1518 (2001).</li>
<li>Turan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+degradation+of+lamins+facilitates+the+nuclear+egress+of+herpes+simplex+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagic degradation of lamins facilitates the nuclear egress of herpes simplex virus type 1.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (2), 508-523 (2019).</li>
<li>Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+yeast+demonstrated+with+proteinase-deficient+mutants+and+conditions+for+its+induction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction.</a> The Journal of Cell Biology. 119 (2), 301-311 (1992).</li>
<li>Yin, Z., Pascual, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+machinery+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy: machinery and regulation.</a> Microbial Cell. 3 (12), 588-596 (2016).</li>
<li>Bodemann, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RalB+and+the+exocyst+mediate+the+cellular+starvation+response+by+direct+activation+of+autophagosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RalB and the exocyst mediate the cellular starvation response by direct activation of autophagosome assembly.</a> Cell. 144 (2), 253-267 (2011).</li>
<li>Bjorkoy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p62%2FSQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (4), 603-614 (2005).</li>
<li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p%2C+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> The EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li>
<li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Yamamoto, A., Oshitani-Okamoto, S., Ohsumi, Y., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+GABARAP+and+GATE16+localize+to+autophagosomal+membrane+depending+on+form-II+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">LC3, GABARAP and GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formation.</a> Journal of Cell Science. 117, Pt 13 2805-2812 (2004).</li>
<li>Pankiv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p62%2FSQSTM1+binds+directly+to+Atg8%2FLC3+to+facilitate+degradation+of+ubiquitinated+protein+aggregates+by+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 24131-24145 (2007).</li>
<li>Korolchuk, V. I., Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+autophagy+by+lysosomal+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Regulation of autophagy by lysosomal positioning.</a> Autophagy. 7 (8), 927-928 (2011).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+quantitative+high-throughput+image+screening+identified+novel+autophagy+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">A cell-based quantitative high-throughput image screening identified novel autophagy modulators.</a> Pharmacological Research. 110, 35-49 (2016).</li>
<li>Pampaloni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Cellular+Spheroid-Based+Autophagy+Screen+Applying+Live+Fluorescence+Microscopy+Identifies+Nonactin+as+a+Strong+Inducer+of+Autophagosomal+Turnover%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Novel Cellular Spheroid-Based Autophagy Screen Applying Live Fluorescence Microscopy Identifies Nonactin as a Strong Inducer of Autophagosomal Turnover.</a> SLAS Discovery. 22 (5), 558-570 (2017).</li>
<li>Deng, Y., Zhu, L., Cai, H., Wang, G., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+compound+database%3A+A+resource+connecting+autophagy-modulating+compounds%2C+their+potential+targets+and+relevant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Autophagic compound database: A resource connecting autophagy-modulating compounds, their potential targets and relevant diseases.</a> Cell Proliferation. 51 (3), 12403(2018).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beclin1+controls+the+levels+of+p53+by+regulating+the+deubiquitination+activity+of+USP10+and+USP13%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13.</a> Cell. 147 (1), 223-234 (2011).</li>
<li>Mauvezin, C., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+disrupts+autophagic+flux+by+inhibiting+both+V-ATPase-dependent+acidification+and+Ca-P60A%2FSERCA-dependent+autophagosome-lysosome+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 disrupts autophagic flux by inhibiting both V-ATPase-dependent acidification and Ca-P60A/SERCA-dependent autophagosome-lysosome fusion.</a> Autophagy. 11 (8), 1437-1438 (2015).</li>
<li>Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1%2C+a+specific+inhibitor+of+vacuolar-type+H%28%2B%29-ATPase%2C+inhibits+acidification+and+protein+degradation+in+lysosomes+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (26), 17707-17712 (1991).</li>
<li>Gerer, K. F., Hoyer, S., Dorrie, J., Schaft, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mRNA+as+Universal+Technology+Platform+to+Transfect+a+Variety+of+Primary+Cells+with+Antigens+and+Functional+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mRNA as Universal Technology Platform to Transfect a Variety of Primary Cells with Antigens and Functional Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1499, 165-178 (2017).</li>
<li>Prechtel, A. T., Turza, N. M., Theodoridis, A. A., Steinkasserer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD83+knockdown+in+monocyte-derived+dendritic+cells+by+small+interfering+RNA+leads+to+a+diminished+T+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD83 knockdown in monocyte-derived dendritic cells by small interfering RNA leads to a diminished T cell stimulation.</a> The Journal of Immunology. 178 (9), 5454-5464 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukoreduction+system+chambers+are+an+efficient%2C+valid%2C+and+economic+source+of+functional+monocyte-derived+dendritic+cells+and+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Leukoreduction system chambers are an efficient, valid, and economic source of functional monocyte-derived dendritic cells and lymphocytes.</a> Immunobiology. 218 (11), 1392-1401 (2013).</li>
<li>Villadangos, J. A., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle%2C+migration+and+antigen+presenting+functions+of+spleen+and+lymph+node+dendritic+cells%3A+limitations+of+the+Langerhans+cells+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Life cycle, migration and antigen presenting functions of spleen and lymph node dendritic cells: limitations of the Langerhans cells paradigm.</a> Seminars in Immunology. 17 (4), 262-272 (2005).</li>
<li>Lechmann, M., Berchtold, S., Hauber, J., Steinkasserer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD83+on+dendritic+cells%3A+more+than+just+a+marker+for+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD83 on dendritic cells: more than just a marker for maturation.</a> Trends in Immunology. 23 (6), 273-275 (2002).</li>
<li>Yang, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+and+interpretation+of+current+autophagy+inhibitors+and+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Application and interpretation of current autophagy inhibitors and activators.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34 (5), 625-635 (2013).</li>
<li>Redmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+autophagy+with+bafilomycin+and+chloroquine+decreases+mitochondrial+quality+and+bioenergetic+function+in+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons.</a> Redox Biology. 11, 73-81 (2017).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+induces+caspase-independent+cell+death+in+hepatocellular+carcinoma+cells+via+targeting+of+autophagy+and+MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 induces caspase-independent cell death in hepatocellular carcinoma cells via targeting of autophagy and MAPK pathways.</a> Scientific Reports. 6, 37052(2016).</li>
<li>Hale, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+modulators+of+autophagic+flux+in+an+image-based+high+content+siRNA+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Identification of modulators of autophagic flux in an image-based high content siRNA screen.</a> Autophagy. 12 (4), 713-726 (2016).</li>
<li>Lipinski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+siRNA+screen+reveals+multiple+mTORC1+independent+signaling+pathways+regulating+autophagy+under+normal+nutritional+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-wide siRNA screen reveals multiple mTORC1 independent signaling pathways regulating autophagy under normal nutritional conditions.</a> Developmental Cell. 18 (6), 1041-1052 (2010).</li>
<li>Orvedahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+genome-wide+siRNA+screen+identifies+selective+autophagy+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Image-based genome-wide siRNA screen identifies selective autophagy factors.</a> Nature. 480 (7375), 113-117 (2011).</li>
<li>Staskiewicz, L., Thorburn, J., Morgan, M. J., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+autophagy+by+shRNA+knockdown%3A+cautions+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Inhibiting autophagy by shRNA knockdown: cautions and recommendations.</a> Autophagy. 9 (10), 1449-1450 (2013).</li>
<li>Lee, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg7+modulates+p53+activity+to+regulate+cell+cycle+and+survival+during+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Atg7 modulates p53 activity to regulate cell cycle and survival during metabolic stress.</a> Science. 336 (6078), 225-228 (2012).</li>
<li>Fremont, S., Gerard, A., Galloux, M., Janvier, K., Karess, R. E., Berlioz-Torrent, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beclin-1+is+required+for+chromosome+congression+and+proper+outer+kinetochore+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Beclin-1 is required for chromosome congression and proper outer kinetochore assembly.</a> EMBO Reports. 14 (4), 364-372 (2013).</li>
<li>Bestebroer, J., V'kovski, P., Mauthe, M., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+behind+autophagy%3A+the+unconventional+roles+of+ATG+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Hidden behind autophagy: the unconventional roles of ATG proteins.</a> Traffic. 14 (10), 1029-1041 (2013).</li>
<li>Galluzzi, L., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+and+divergent+functions+of+Beclin+1+and+Beclin+2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Common and divergent functions of Beclin 1 and Beclin 2.</a> Cell Research. 23 (12), 1341-1342 (2013).</li>
</ol>

作者无任何披露信息。

本实验方案的范围包括：（i）人单核细胞来源的未成熟树突状细胞（iDCs）以及成熟树突状细胞（mDCs）的培养与处理，（ii）用HSV-1病毒感染这些细胞，（iii）使用已知可抑制自噬的化合物处理细胞，以及（iv）采用两种不同的技术设置对细胞进行siRNA电穿孔转染。通过本实验方案，可在HSV-1感染的iDCs中阻断自噬流，或在HSV-1感染的mDCs中诱导自噬流。
由于树突状细胞（DCs），尤其是未成熟树突状细胞（iDCs），属于非常脆弱的细胞，因此操作这些细胞时需要格外精细。在DC的制备过程中，我们建议使用 freshly isolated PBMCs，并避免对其进行冷冻保存，以获得更高的细胞得率。此外，在实验过程中处理iDCs时（包括后续培养阶段），应避免剧烈或长时间的温度变化。否则，iDCs可能发生表型改变，因此有必要通过流式细胞术验证其未成熟表型。需要注意的是，与成熟的DC相比，iDCs缺乏明显的标志物，例如CD80、CD83和CD8628,29。利用HSV-1感染iDCs和mDCs是一种已被广泛建立的方法2,3,4,5,6,10。我们及其他研究者已证实，当使用1或2的感染复数（MOI）时，DCs对HSV-1感染具有高度易感性（图2）。在我们的实验条件下，将感染体系的体积保持在较低水平（250–350 µL中含1–3 × 106个细胞），可获得更高的感染效率。
干扰特定细胞通路的经典方法是使用特异性化合物。目前已有多种不同的自噬调节剂，即 自噬激活剂和抑制剂可供使用30。关于树突状细胞（DCs）中HSV-1诱导的自噬，Turan等（2019年）近期研究表明，spautin-1和bafilomycin-A1（BA1）可抑制iDCs中的自噬体降解过程10。该自噬抑制技术适用于与后续HSV-1感染联合使用，因为其既不影响感染率，也不影响DCs（尤其是iDCs）的成熟状态。在未来的应用中，这种基于抑制剂的方法还可与其他病原体感染、应激条件（如营养剥夺）以及不同细胞类型联合使用。然而，在使用抑制剂时，确定能够有效抑制自噬而又不严重损害细胞活力的合适浓度存在困难。使用抑制剂的主要局限性在于可能出现潜在的脱靶效应或不良效应，从而导致误导性的实验结果31,32。
本方案中涉及的第二种干扰自噬的方法是使用siRNA进行特异性敲低33,34,35。一方面，我们使用电穿孔仪I特异性消除FIP200的表达，从而抑制HSV-1诱导的iDCs中的自噬降解。另一方面，我们使用电穿孔仪II沉默两种不同的KIF蛋白（即KIF1B和KIF2A），以促进HSV-1感染的mDCs中的自噬流。两种电穿孔方案均几乎完全消除了iDCs中的FIP200以及mDCs中的KIF1B/KIF2A，该结果通过Western blot分析得到验证（图4A，图5A）。与不影响DCs存活率的电穿孔仪I相比，使用电穿孔仪II对mDCs进行电穿孔会导致死亡细胞比例略有升高（图4B，图5B）。因此，在未来的应用中，应优先将电穿孔仪I用于iDCs和mDCs。值得注意的是，这两种基于siRNA调控自噬流的技术均适用于后续对iDCs或mDCs的HSV-1感染实验。此外，电穿孔后iDCs的未成熟表型和mDCs的成熟表型均未发生改变。
使用FIP200特异性siRNA对iDCs进行电穿孔是一种高效且高度特异的基因敲低方法，可在HSV-1感染期间有效抑制自噬流。除特异性沉默FIP200外，本方案还可适用于沉默自噬级联反应不同阶段参与的其他自噬相关组分。然而，确定siRNA介导自噬抑制的合适靶点时需考虑多个方面。首先，自噬相关基因（ATG）的敲低效率并不一定与自噬抑制效率呈正相关，且该效果高度依赖于被沉默的具体ATG蛋白36其次，不同的ATG蛋白还参与了除自噬以外的其他通路，因此其缺失也可能导致不良副作用37,38,39第三，不同的自噬相关基因（ATGs）可能存在功能冗余，因此仅敲低其中一个组分可能不足以抑制自噬（例如., beclin-1 和 beclin-240.
此外，基于电穿孔仪 I 的树突状细胞电穿孔方案也适用于 mRNA，并可用于多种其他原代细胞类型，例如外周血单个核细胞（PBMCs）25。因此，该系统提供了一种通用策略，可将不同类型的 RNA 递送至多种原代细胞中。总之，我们提出了两种抑制自噬流的方案，分别是通过使用抑制剂或 siRNA 方法，并结合后续对诱导型树突状细胞（iDCs）进行单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）感染。此外，我们还描述了一种在 HSV-1 感染后通过 siRNA 电穿孔诱导成熟树突状细胞（mDCs）自噬流的方法。

人单核细胞来源的树突状细胞（DCs）的制备是一种合适的体外模型，可用于研究这种重要免疫细胞类型的生物学功能。近年来，单核细胞的分离及其向树突状细胞的分化技术已较为成熟1,2。利用α-疱疹病毒单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染DCs，可作为研究HSV-1对DC生物学功能调控作用的模型系统2,3,4,5,6。这对于阐明疱疹病毒如何抑制或削弱宿主强大的抗病毒免疫应答，从而在宿主免疫豁免部位建立潜伏感染具有重要意义7,8。在这方面，疱疹病毒是极为成功的病原体，在人群中广泛传播，根据地理区域的不同，血清流行率可高达90&#160;%9。为了理解甚至可能阻止这一过程，需要进一步深入了解HSV-1对宿主免疫系统、特别是对树突状细胞等免疫细胞的调控机制。
Turan 等人最近发表了一项关于树突状细胞（DCs）与 HSV-1 相互作用的全新发现10。作者证明，HSV-1 的复制完成严格依赖于 DCs 的成熟状态。在未成熟 DCs（iDCs）中，HSV-1 的完整复制由自噬依赖性机制促进。尽管 HSV-1 在 iDCs 和成熟 DCs（mDCs）中均可诱导自噬，但自噬流仅在 iDCs 中被观察到。这进而通过自噬介导的核纤层蛋白降解，促进病毒衣壳在 iDCs 中的核输出。为了深入理解 HSV-1 在 iDCs 与 mDCs 中诱导的这一降解通路的分子机制，开发新的、高效的研究策略以检测自噬流至关重要。
巨自噬（自噬）是一种高度保守的多步骤过程，可将细胞内蛋白质或完整细胞器靶向输送至溶酶体进行降解11。简而言之，自噬可分为以下阶段：(i) 起始、(ii) 膜成核、(iii) 囊泡扩张以及 (iv) 自噬溶酶体融合阶段12。在起始阶段 (i)，诸如包含200 kD黏着斑激酶家族相互作用蛋白（FIP200）的活化ULK1/2激酶复合物等组分，对于激活beclin-1-Vps34-AMBRA1复合物至关重要。随后，在膜成核阶段 (ii) 启动吞噬泡的形成13，该结构可包裹由p62等分子标记的胞质货物14。在囊泡扩张与自噬体成熟阶段 (iii)，微管相关蛋白轻链3（LC3-I）被转化为其脂化形式LC3-II，并插入自噬体膜中。因此，LC3-I向LC3-II的转化速率可反映成熟自噬体的形成，是衡量自噬诱导的指标15,16。在自噬体与溶酶体融合后 (iv)，不仅自噬货物，连同相关的p62和LC3-II蛋白也会被降解（例如通过水解作用）。因此，p62和LC3-II的减少可作为自噬流的标志物17。自噬体与溶酶体的融合，以及随之而来的自噬周转，高度依赖于细胞内溶酶体的定位。这一过程部分由驱动蛋白家族成员KIF1B和KIF2A调控，研究表明它们对自噬体-溶酶体融合具有负向调节作用18。有趣的是，KIF1B和KIF2A的蛋白表达在树突状细胞（DC）成熟过程中被诱导上调，从而导致HSV-1感染的成熟树突状细胞（mDCs）中自噬流效率低下，进而抑制HSV-1的完整复制10。
调节自噬的实验尝试包括使用已知可诱导或抑制该特定通路的化合物19,20,21在本研究中，我们描述了两种基于抑制剂的策略，用于阻断HSV-1感染的iDCs中的自噬降解过程。我们在实验中使用的第一个化合物是特异性且高效的自噬抑制剂-1（spautin-1），该化合物被报道可在自噬起始阶段促进beclin-1-Vps34-AMBRA1复合物的降解。22本研究中使用的第二种化合物是巴佛洛霉素-A1（BA1），一种V-ATPase抑制剂，可阻断晚期自噬事件（即., 自噬小体-溶酶体融合以及自噬溶酶体的酸化23,24使用这两种抑制剂中的任意一种在HSV-1感染iDC之前处理，均可强烈抑制自噬，但不会干扰病毒基因的有效表达。因此，在HSV-1感染前采用这种基于抑制剂的策略，为抑制HSV-1诱导的自噬流提供了一种强有力的工具，且该方法可轻松拓展应用于多种不同细胞类型和同样可能诱导自噬的其他病毒。
为克服基于抑制剂的方法的一个主要缺点（即., 非特异性脱靶效应），我们开发了一种基于siRNA的方法，用于阻断（HSV-1感染的）iDCs中的自噬流。siRNA电穿孔技术提供了一种强有力的替代策略，可通过选择性敲低特定蛋白（即自噬相关组分）的表达实现功能抑制。在我们的实验中，iDCs使用电穿孔仪I转染FIP200特异性siRNA（参见 材料表）以及 Gerer 等人（2017）和 Prechtel 等人（2007）描述的改进方案，以在自噬起始阶段抑制自噬25,26该技术使我们能够特异性敲低iDCs中的FIP200表达，且在电穿孔后两天内不影响细胞活力及其未成熟表型。值得注意的是，电穿孔后的iDCs仍可有效建立HSV-1感染，表现为病毒蛋白的高效表达。这种基于siRNA的技术具有独特优势，即可特异性靶向多种不同的自噬相关组分（甚至联合靶向），以实现其表达的消除。
本研究进一步描述了一种基于siRNA的方法，可在HSV-1感染的成熟树突状细胞（mDCs）中诱导自噬流。在此方法中，未成熟树突状细胞（iDCs）在通过电穿孔仪II（见材料表）诱导其成熟之前，先经靶向KIF1B和KIF2A的siRNA进行电穿孔转染。由于这两种蛋白在树突状细胞成熟过程中表达上调，且已知可负向调控自噬体与溶酶体的融合10,18，因此在HSV-1感染后，敲低这些蛋白可显著诱导mDCs中的自噬流。因此，该基于siRNA的技术使我们能够通过干扰mDCs中KIF蛋白的表达，特异性地诱导自噬周转，从而模拟其在iDCs中的表达水平。
总之，我们提出了两种不同的方法来抑制 HSV-1 感染的 iDCs 中的自噬流。第一种基于抑制剂的方法操作简便、成本低且速度快，可有效干扰自噬降解过程；而第二种基于 siRNA 的技术更具特异性，是支持和验证抑制剂实验结果的非常合适的方法。此外，我们还描述了一种通过 siRNA 介导敲低两种 KIF 蛋白来在 HSV-1 感染的 mDCs 中诱导自噬流的方法。

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector 核心单元（电穿孔仪 II）</td><td>Lonza (Basel, Switzerland)</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>AB-血清</td><td>Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td><td>H4522</td><td>树突状细胞培养</td></tr><tr><td>ACD-A</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td><td>9007281</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa P3 原代细胞 4D-Nucleofector X 试剂盒 L（电穿孔试剂盒装置 II）</td><td>Lonza (Basel, Switzerland)</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL Prime 蛋白印迹检测试剂</td><td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td><td>RPN2232</td><td>蛋白印迹检测</td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG（小鼠，多克隆，HRP）</td><td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td><td>7076</td><td>蛋白印迹检测</td></tr><tr><td>抗兔 IgG（山羊，多克隆，HRP）</td><td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td><td>7074</td><td>蛋白印迹检测</td></tr><tr><td>巴佛洛霉素 A1</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td><td>tlrl-baf1</td><td>自噬和溶酶体降解的抑制</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td><td>338962</td><td></td></tr><tr><td>苯并核酸酶</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Blotting Chamber Fastblot B44</td><td>Biometra (G&amp;ouml;ttingen, Germany)</td><td>846-015-100</td><td></td></tr><tr><td>CCR7（小鼠，Pe-Cy7）</td><td>BioLegend (Fell, Germany)</td><td>557648</td><td>流式细胞术&lt;br/&gt; 稀释比例：1:100&lt;br/&gt; 克隆：G043H7</td></tr><tr><td>CD11c（小鼠，Pe-Cy5）</td><td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td><td>561692</td><td>流式细胞术&lt;br/&gt; 稀释比例：1:100&lt;br/&gt; 克隆：B-ly6</td></tr><tr><td>CD14（小鼠，PE）</td><td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td><td>555398</td><td>流式细胞术&lt;br/&gt; 稀释比例：1:100&lt;br/&gt; 克隆：M5E2</td></tr><tr><td>CD3（小鼠，FITC）</td><td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td><td>555332</td><td>流式细胞术&lt;br/&gt; 稀释比例：1:100&lt;br/&gt; 克隆：UCHT1</td></tr><tr><td>CD80（小鼠，V450）</td><td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td><td>560442</td><td>流式细胞术&lt;br/&gt; 稀释比例：1:100&lt;br/&gt; 克隆：L307.4</td></tr><tr><td>CD83（小鼠，APC）</td><td>eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)</td><td>17-0839-41</td><td>流式细胞术&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200&lt;br/&gt; 克隆：HB15e</td></tr><tr><td>CD86（小鼠，PE）</td><td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td><td>553692</td><td>流式细胞术&lt;br/&gt; 稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>EVOS FL 细胞成像系统</td><td>System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>AMF4300</td><td></td></tr><tr><td>FIP200（兔）</td><td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td><td>12436</td><td>蛋白印迹检测&lt;br/&gt; 稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 克隆：D10D11</td></tr><tr><td>GAPDH（小鼠）</td><td>Merck Millipore (Massachusetts, USA)</td><td>AB2302</td><td>蛋白印迹检测&lt;br/&gt; 稀释比例：1:5000&lt;br/&gt; 克隆：MAB374</td></tr><tr><td>Gene Pulser II 装置（电穿孔仪 I）</td><td>BioRad Laboratories GmbH (M&amp;uuml;nchen, Germany)</td><td>165-2112</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF（4×10&lt;sup&gt;4&lt;/sup&gt; U/mL）</td><td>Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)</td><td>130-093-868</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR（小鼠，APC-Cy7）</td><td>BioLegend (Fell, Germany)</td><td>307618</td><td>流式细胞术&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200&lt;br/&gt; 克隆：L243</td></tr><tr><td>HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43</td><td>BioVex</td><td></td><td>树突状细胞感染&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ICP0（小鼠）</td><td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td><td>sc-53070</td><td>蛋白印迹检测&lt;br/&gt; 稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 克隆：11060</td></tr><tr><td>ICP5（小鼠）</td><td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td><td>sc-56989</td><td>蛋白印迹检测&lt;br/&gt; 稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 克隆：3B6</td></tr><tr><td>IL-1&amp;beta;（0.1×10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; U/mL）</td><td>Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)</td><td>1411-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-4（1×10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; U/mL）</td><td>Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)</td><td>130-093-924</td><td></td></tr><tr><td>IL-6（1×10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; U/mL）</td><td>Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)</td><td>1404-050</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000</td><td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td><td>28955810</td><td></td></tr><tr><td>KIF1B（小鼠）</td><td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td><td>sc-376246</td><td>蛋白印迹检测&lt;br/&gt; 稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 克隆：E-12</td></tr><tr><td>KIF2A（小鼠）</td><td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td><td>sc-271471</td><td>蛋白印迹检测&lt;br/&gt; 稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 克隆：D-7</td></tr><tr><td>LC3B（兔）</td><td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td><td>3868</td><td>蛋白印迹检测&lt;br/&gt; 稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 克隆：D11</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Lonza (Basel, Switzerland)</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定紫红色死细胞染色试剂盒</td><td>Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)</td><td>L34964</td><td>流式细胞术中的活/死染色</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies AS (Oslo, Norway)</td><td>04-03-9391/01</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td><td>A537.1</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 2.0 RS</td><td>Heraeus (Hanau, Germany)</td><td>75015505</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 计数板</td><td>Brand (Wertheim, Germany)</td><td>717805</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 细胞培养瓶（175.0 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;）</td><td>Thermo Scientific (Rockford, USA)</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>p62（兔）</td><td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td><td>88588</td><td>蛋白印迹检测&lt;br/&gt; 稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 克隆：D5L7G</td></tr><tr><td>PageRuler 预染蛋白 Marker</td><td>Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>16% 戊二醛</td><td>Alfa Aesar, Haverhill, USA</td><td>43368.9M</td><td></td></tr><tr><td>PerfectSpin 24 Plus</td><td>Peqlab (Erlangen, Germany)</td><td>C2500-R-PL</td><td></td></tr><tr><td>PGE&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（1 mg/mL）</td><td>Pfizer (Berlin, Germany)</td><td>BE130681</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Lonza (Basel, Switzerland)</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Protein gel system MiniProtean II</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH (M&amp;uuml;nchen, Germany)</td><td>1652960</td><td></td></tr><tr><td>RestoreTM 蛋白印迹 stripping 缓冲液</td><td>Thermo Scientific, Rockford, USA</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Rocking Platform wt 15</td><td>Biometra (G&amp;ouml;ttingen, Germany)</td><td>042-590</td><td></td></tr><tr><td>RotiBlock</td><td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td><td>A151.4</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Load 1（4×）</td><td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td><td>K929.3</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese Gel 30（37.5:1）</td><td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza (Basel, Switzerland)</td><td>12-167F</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf (Hamburg, Germany)</td><td>5355 000.011</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;（10 &amp;mu;g/mL）</td><td>Peprotech (Hamburg, Germany)</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液（0.4%）</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 &amp;mu;m 硝酸纤维素膜</td><td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td><td>10600001</td><td></td></tr><tr><td>WhatmanTM 色谱纸 3 mm Chr</td><td>Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany)</td><td>3030917</td><td></td></tr></tbody></table>

利用sirna电穿孔技术调控单纯疱疹病毒1型感染的单核细胞来源树突状细胞中的自噬

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）可在未成熟树突状细胞（iDCs）和成熟树突状细胞（mDCs）中均诱导自噬，但自噬流仅在iDCs中被观察到。为了获得机制上的深入理解，我们开发了高效的策略以干扰HSV-1诱导的自噬降解过程。基于抑制剂的策略是调控HSV-1诱导自噬的首选方法，因其操作简便且快速。为避免此类化合物可能产生的非特异性脱靶效应，我们开发了一种基于siRNA的替代策略，用于调控HSV-1感染后iDCs中的自噬降解。事实上，在HSV-1感染前通过电穿孔将靶向FIP200的siRNA导入iDCs，是一种非常特异且有效的方法，可完全消除FIP200蛋白的表达，从而抑制自噬流。上述两种方法均可高效抑制HSV-1在iDCs中诱导的自噬降解，其中基于siRNA的技术具有更高的靶向特异性。此外，我们还开发了另一种基于siRNA的方法，可选择性沉默KIF1B和KIF2A蛋白的表达，从而促进mDCs中HSV-1感染后的自噬降解。综上所述，siRNA电穿孔技术是一种极具前景的策略，可用于选择性敲低特定蛋白的表达，并分析其在HSV-1感染过程中的作用。

在本论文中，我们描述了干扰树突状细胞中 HSV-1 诱导自噬的方法。该方法包括人单核细胞来源的不成熟树突状细胞（iDCs）和成熟树突状细胞（mDCs）的制备，并通过流式细胞术对表型进行分析（图1）。贴壁后第4天，树突状细胞呈现未成熟表型，其特征为 CD80、CCR7 和 CD83 表达较弱，CD11c 表达较高，MHCII 表达处于中等水平。由于 CD3 和 CD14 信号缺失，可排除T细胞和单核细胞污染。贴壁后第6天（即诱导成熟后第2天），树突状细胞呈现成熟表型，表现为 CD80、CCR7、CD83 和 MHC-II 表面表达显著升高。使用表达 eGFP 的 HSV-1 毒株感染（图2）可实现对 iDCs（图2A 上图）或 mDCs（图2A 下图，图2B）几乎完全的感染，这通过荧光显微镜和流式细胞术检测到的强GFP信号得以证实。
正如我们最近的报告所示，HSV-1 可在未成熟树突状细胞（iDCs）和成熟树突状细胞（mDCs）中均诱导自噬，但自噬体的降解仅发生在 iDCs 中10。在初步实验中，我们使用 spautin-1（图 3A）处理 iDCs 和 mDCs 以阻断自噬起始，或使用巴佛洛霉素 A1（BA1；图 3B）以抑制自噬体与溶酶体的最终融合。在未使用 spautin-1 和 BA1 的情况下，HSV-1 感染 iDCs 后，自噬流通过 p62 和 LC3B 表达水平的下降得以体现。相比之下，在未使用 spautin-1 的情况下，HSV-1 感染 mDCs 对 p62 表达无明显影响，而 spautin-1 和 BA1 处理则导致 LC3B-II 的积累。这反映了 mDCs 中自噬的启动，但自噬体降解过程受阻。在 iDCs 中，使用 spautin-1 预处理可显著恢复 HSV-1 感染后 p62 的自噬性降解，这是由于在自噬起始阶段抑制了自噬过程。经 BA1 预处理后，模拟感染（mock）和 HSV-1 感染的 iDCs 均表现出 LC3B-II 蛋白水平的显著积累，表明通过阻断晚期自噬体-溶酶体融合成功抑制了自噬体降解。与此一致的是，mDCs 经 spautin-1 和 BA1 预处理后，p62 蛋白水平保持稳定，同时 LC3B-II 蛋白水平升高。
在第二种抑制自噬流的方法中，通过电穿孔将靶向 FIP200 的 siRNA 导入细胞，检测其在 HSV-1 感染的不成熟树突状细胞（iDCs）中阻断自噬流的能力。如图 4A所示，与对照 siRNA 组相比，电穿孔后 48 小时的 iDCs 中 FIP200 蛋白水平显著降低。在此时间点，iDCs 未表现出任何细胞死亡的迹象（图 4B），并保持其未成熟表型（图 4C）。在 FIP200 沉默的 iDCs 中感染 HSV-1 后，与对照 siRNA 处理的细胞相比，自噬流显著减少（图 4D）。同时，在 HSV-1 感染的 iDCs 中沉默 FIP200 会导致 LC3B 和 p62 蛋白水平升高。
作为反向验证，我们研究了通过siRNA介导的KIF1B和KIF2A蛋白表达敲低是否能够在HSV-1感染的mDCs中实现自噬小体-溶酶体的降解更新。因此，使用靶向其中一种或两种蛋白的特异性siRNA对iDCs进行电穿孔转染，随后诱导细胞成熟（图5）。电穿孔后2天，当使用特异性siRNA时，mDCs中KIF1B和/或KIF2A的蛋白表达显著降低（图5A）。该方法既未引起明显的细胞死亡（图5B），也未改变其表型成熟状态（图5C）。支持KIF1B和KIF2A在自噬小体-溶酶体降解过程中的重要作用的是，在HSV-1感染前敲低这两种蛋白可促进mDCs中自噬流的增强。这一点体现在p62蛋白残留水平较相应对照组明显降低（图5D）。
<img alt="流式细胞术直方图；染色/未染色的免疫标志物：CD3、CD14、CD11c、CD80、CCR7、CD83、MHCII。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：利用流式细胞术对人单核细胞来源的未成熟树突状细胞（iDCs）和成熟树突状细胞（mDCs）进行表型鉴定。通过体外诱导生成树突状细胞，并使用特异性抗体染色以验证其纯度：（A）CD3用于排除T细胞污染，（B）CD14用于排除单核细胞污染，以及（C）CD11c作为树突状细胞的标志物。为评估其表型成熟状态，使用了以下抗体：（D）CD80，（E）CCR7，（F）CD83，以及（G）MHCII。这些分子在成熟树突状细胞（mDCs）上高表达，因此可用于区分未成熟与成熟树突状细胞的表型。数据采用FCS express 5.0软件进行分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="HSV-1 感染分析；iDCs/mDCs 中的透射光与 GFP 荧光；流式细胞术图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图2：HSV-1 感染的 iDCs 和 mDCs 的显微镜及流式细胞术分析。iDCs 和 mDCs 用表达 EGFP 的 HSV-1 毒株（HSV-1 EGFP）进行感染，以便基于 GFP 信号定量感染率。（A）在感染后 24 小时，以 MOI 为 2 感染的 GFP 阳性 HSV-1 感染 iDCs 和 mDCs 与其未感染对照组的显微镜分析结果。为观察感染细胞，检测 GFP 荧光信号。比例尺代表 400 µm。（B）模拟感染或 HSV-1 感染 mDCs 在感染动力学过程中的流式细胞术检测结果。上排图（黑色线框直方图）显示模拟感染条件，下排图（黑色填充直方图）显示感染后指定时间点的 HSV-1 感染细胞。数据使用 FCS express 5.0 进行分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DMSO、Spautin-1 和 BA1 条件下 HSV-1 感染 iDC/mDC 的蛋白质表达的 Western 印迹分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：Spautin-1 和巴佛洛霉素-A1 调节 HSV-1 感染的 iDC 中的自噬流。iDC 和 mDC 在感染前 1 小时分别用 (A) Spautin-1 或 (B) 巴佛洛霉素-A1 (BA1) 处理。随后，细胞进行模拟感染或 HSV-1 感染（HSV1-RFPVP26），感染复数（MOI）为 2。感染后 16–18 小时，收集树突状细胞（DC），制备蛋白裂解液，并通过 Western 印迹检测自噬标志物 p62 和 LC3B-I/-II 的表达，以 ICP0 作为感染对照，GAPDH 作为上样对照。使用 Bio1D 软件（光密度）对 LC3B-I 和 LC3B-II 蛋白水平进行定量，并归一化至参照蛋白 GAPDH。图中显示了归一化的 LC3B-II 信号与归一化的 LC3B-I 信号的比值。本图经修改和改编自 ©2019 Turan 等，最初发表于 JCB。https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="siRNA对FIP200作用的Western印迹分析、CD标志物流式细胞术数据、HSV-1感染研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：FIP200-siRNA电穿孔后HSV-1感染iDCs中自噬流的分析。iDCs使用电穿孔仪I通过对照siRNA或FIP200特异性siRNA进行电穿孔。（A）通过Western印迹分析，在电穿孔后48小时检测FIP200敲低效率以评估DCs。（B）细胞活力以及（C）成熟状态在电穿孔前（浅蓝色直方图）和电穿孔后48小时（深蓝色和灰色直方图）通过流式细胞术进行分析。展示了三位不同供体的中位数值。在确认FIP200高效敲低及未成熟表型后，用MOI为2的HSV-1（HSV-1 EGFP）感染细胞。数据使用FCS express 5.0进行分析。（D）感染后20小时，进行Western印迹分析以检测LC3B-I/-II和p62的表达，作为自噬标志物。ICP5用于感染对照，GAPDH作为上样对照。图A和图D经修改和改编自©2019 Turan等，最初发表于JCB。https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="siRNA对KIF2A、KIF1B蛋白及CD标志物影响的Western印迹和流式细胞术分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：通过siRNA介导的KIF1B和/或KIF2A敲除调控HSV-1感染的mDCs中的自噬周转。 iDCs使用电穿孔装置II转染特异性靶向KIF1B和/或KIF2A的siRNA，以及对照siRNA。电穿孔后4小时，通过添加成熟化混合物诱导细胞成熟。电穿孔后48小时，通过（A）Western印迹法检测KIF基因敲降效率，（B）细胞活力，以及（C）通过流式细胞术分析其表型成熟状态（展示两个不同供体的数据）。“w/o EP”表示未进行电穿孔但进行了成熟化诱导；“post control EP”表示使用对照siRNA进行电穿孔后；“post KIF1B, KIF2A, KIF1B/2A EP”表示使用KIF1B和/或KIF2A特异性siRNA进行电穿孔后。在确认KIF1B和/或KIF2A高效敲降及细胞成熟表型后，用HSV-1（HSV-1 EGFP）以MOI为2感染细胞。数据使用FCS express 5.0软件进行分析。（D）感染后20小时对细胞进行Western印迹分析，以评估自噬标志物p62的表达。ICP5作为感染对照，GAPDH作为上样对照。图A和图D经修改并改编自©2019 Turan 等人，最初发表于JCB。https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本研究中，我们介绍了基于抑制剂和小干扰RNA的策略，用于干扰单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染的单核细胞来源树突状细胞中的自噬流。

利用siRNA电穿孔技术调控单纯疱疹病毒1型感染的单核细胞来源树突状细胞中的自噬

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）可诱导未成熟树突状细胞（iDCs）和成熟树突状细胞（mDCs）发生自噬，而……

本方案描述了高效干扰树突状细胞中 HSV-1 诱导的自噬降解过程的方法。特别是，我们比较了在感染前使用抑制剂和 siRNA 两种策略来阻断自噬。尽管基于抑制剂的自噬干扰可能存在潜在的特异性脱靶效应，但我们建立的基于 siRNA 的策略具有更高的靶向特异性。重要的是，这两种展示的技术均不影响疾病的发展成熟阶段。演示该实验操作的是来自我实验室的技术员 Petra Muhl-Zurbes 和研究生 Alexandra Duthorn。首先，在细胞贴壁后的第四天，通过轻轻冲洗细胞培养瓶底部，收集松散贴附的未成熟树突状细胞（iDCs）。加入成熟诱导剂混合物以生成成熟的树突状细胞（mDCs）。诱导成熟两天后，用培养基冲洗细胞培养瓶底部的mDCs。重复冲洗两次，然后将iDCs和mDCs分别转移至含有各自培养基的50毫升离心管中。通过离心收集细胞，300 × g 离心5分钟。根据细胞培养瓶的数量，每瓶用5至10毫升RPMI 1640培养基轻柔重悬细胞，并将相应的树突状细胞（DC）悬液合并至同一管中。随后使用计数板对细胞进行定量，操作过程中需注意避免温度变化对DC的影响。将两百万个iDC或mDC转移至一个2毫升离心管中，在3,390 × g条件下离心1.5分钟，弃去上清液。用感染培养基轻柔重悬细胞。在感染前一小时，向感染培养基中加入10微摩尔的spautin-1或1微摩尔的bafilomycin A1，以抑制自噬溶酶体降解通路。向未处理对照组加入DMSO，并将细胞置于37°C加热块上，以300 RPM振荡孵育。进行感染实验时，用HSV-1病毒颗粒以感染复数为2的剂量接种细胞。加入相应体积的MNT缓冲液作为模拟对照，并将细胞置于37°C加热块上，振荡孵育1小时。感染后一小时，以3,390 × g离心1.5分钟收集细胞，然后轻轻吸除接种液，并将细胞重悬于DC培养基中。将模拟处理和HSV-1感染的细胞以每毫升一百万个细胞的终浓度接种至6孔板中。感染后16至24小时，使用细胞刮刀收集iDCs，或通过冲洗收集mDCs，将细胞转移至1.5毫升带锁扣的离心管中，并以3,390 × g离心1.5分钟收集细胞。对孔中剩余的细胞重复进行收集和离心，然后用一毫升磷酸盐缓冲液洗涤沉淀物一次，并在裂解液中剧烈重悬细胞。将样品在37摄氏度孵育10分钟，随后在95摄氏度加热10分钟。进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，以检测LC3B1和LC3B2、P62、ICP0和ICP5以及GAPDH的蛋白水平。贴附后第3.5天，将1200万个未成熟树突状细胞（iDCs）转移至一个50毫升离心管中，在300 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。同时，进行流式细胞术分析以监测细胞成熟状态。用5毫升不含酚红的Opti-MEM培养基轻柔洗涤iDCs，然后在300 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于200微升Opti-MEM中，调整细胞浓度至每100微升含600万个细胞。向四个毫米电穿孔杯中分别加入75皮摩尔的FIP200特异性siRNA或乱序siRNA，并向每个电穿孔杯中转移100微升细胞悬液。使用电穿孔仪直接对iDCs进行脉冲处理。电穿孔后，将iDCs转移至六孔板中，加入新鲜预热的DC培养基，使细胞终浓度为每毫升一百万个细胞，并将六孔板放入培养箱中。48小时后，显微镜下观察电穿孔后的iDCs形态，然后用细胞刮收集细胞，并转移至15毫升离心管中。用含0.1% EDTA的1毫升PBS冲洗各孔，将冲洗液转移至相应的离心管中。随后按照文稿中所述方法对每种siRNA条件的细胞进行分组。取500,000个细胞用于评估成熟状态和细胞活力，取100万个细胞用于蛋白质印迹分析以验证FIP200特异性敲低效率，剩余细胞用于HSV-1感染实验。通过流式细胞术对生成的iDCs和mDCs进行表型分析，以排除其他细胞类型的污染并验证其成熟状态。使用CD3和CD14抗体对细胞进行染色，以分别排除T细胞和单核细胞的污染。对CD11c进行染色，因其是树突状细胞（DCs）高表达的通用标志物。为评估细胞成熟状态，使用CD80、CCR7、CD83和MHCII抗体，因为这些分子在成熟树突状细胞上高表达。采用荧光显微镜和流式细胞术检测表达EGFP的HSV-1感染情况。强烈的GFP信号表明iDCs和mDCs几乎完全被感染。通过蛋白质印迹分析确定spautin-1或bafilomycin A1是否抑制HSV-1感染细胞中的自噬流。在iDCs中，自噬流通过P62和LC3B的表达量下降得以体现，分别在未使用spautin-1和bafilomycin A1的情况下观察到该现象。相反，在未使用spautin-1的情况下，HSV-1感染mDCs并不影响P62的表达，而spautin-1与BA1处理则导致LC3B-II的积累，这反映了mDCs中自噬的诱导，但自噬降解过程受阻。通过siRNA电穿孔降低FIP200蛋白水平，也会导致HSV-1感染的iDCs中自噬流显著减少。这种基于siRNA的电穿孔抑制自噬的实验方案不会影响iDCs中的细胞活力、成像表型或HSV-1蛋白表达的建立。我们的电穿孔方案可用于将不同类型的DNA或RNA导入疾病相关细胞及其他原代细胞类型中。随后可进行多种分子、功能及感染性分析。基于siRNA的疾病中基因表达沉默策略为研究任何目标蛋白的功能提供了途径，也可与后续的功能检测相结合。

sirna-electroporation-to-modulate-autophagy-herpes-simplex-virus-type

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

siRNA 电穿孔以在单纯疱疹病毒类型 1-感染单细胞衍生的丹突细胞中调制自噬

一种快速、简便且经济高效的方案，用于制备供体来源的多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（rCTL），以输注给存在CMV、Adv或EBV感染风险的异基因造血干细胞移植（HSCT）受者。该制备工艺符合GMP标准，有助于推动T细胞免疫治疗在专科中心以外的更广泛应用。...

多病毒特异性T细胞的制备用于预防和治疗异基因造血干细胞移植后病毒感染

我们提出了一种优化的高通量核转染方案，可高效转染人原代单核细胞来源的树突状细胞，导入质粒DNA或siRNA，且不会诱导细胞成熟。我们进一步提供了成功沉默靶基因RIG-I的证据，其mRNA水平和蛋白水平均显著下调。...

高效转染树突状细胞且不诱导细胞成熟的优化方案

本方案描述了一种高效且可重复的模型系统，用于研究单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的潜伏感染与再激活。该检测方法采用均一的交感神经元培养体系，可利用多种工具（包括RNA干扰和重组蛋白表达）对病毒与神经元之间的相互作用进行分子层面的解析。...

一种用于研究单纯疱疹病毒潜伏与再激活的原代神经元培养系统

来源：Tagliafierro, L.，等．用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台．J. Vis. Exp.

慢病毒转导神经前体细胞以调控α-突触核蛋白表达的表观遗传机制

本视频展示了一种基于小干扰RNA（siRNA）的技术，用于干扰自噬流。通过电穿孔法将靶向FIP200 mRNA的siRNA导入单核细胞来源的未成熟树突状细胞（iDCs），导致FIP200表达下调，从而抑制核纤层蛋白的破坏。 通过 自噬。加入单纯疱疹病毒（HSV）后，由于缺乏核纤层蛋白的破坏，病毒子代的核输出受到抑制 通过...

基于siRNA的单纯疱疹病毒感染未成熟树突状细胞中自噬的抑制

在神经生物学和神经病毒学研究中，拥有可靠且可重复的方法至关重要 体外 作为所发生事件的转化研究模型的系统 体内 在人类神经元中。本方案描述了如何培养并诱导SH-SY5Y人类神经母细胞瘤细胞分化为具有活性的神经元，以用于后续实验研究。 体外 应用。...

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系的分化

本文展示了如何通过密度梯度离心法从人抗凝全血中分离外周血单个核细胞，再利用磁珠分选技术从中分离单核细胞。经过5天的培养后，人单核细胞可分化为未成熟树突状细胞，可用于非临床实验操作。...

从全血中生成人单核细胞来源的树突状细胞

靶向DNA表观基因组编辑是一种强大的治疗策略。本方案描述了用于人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源神经元表观基因组编辑的、携带CRISPR-dCas9-DNMT3A转基因的一体化慢病毒载体的制备、纯化与浓缩过程。...

用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台

在本研究中，使用特异性的shRNA敲低了PERK通路的两个下游信号组分——具有细胞保护作用的钙调磷酸酶以及促凋亡的CHOP。这两种组分以相反的方式调控原代皮层神经元在内质网应激诱导后发生神经突萎缩的易感性。...

慢病毒递送特异性shRNA对内质网应激神经元的分子调控

免疫荧光染色过程中使用酪胺信号放大技术，可灵敏地检测 HSV-1 感染后 ZBP1 介导的坏死性凋亡过程中磷酸化的 RIPK3 和...

酪胺信号放大法用于人细胞中HSV-1感染后ZBP1依赖性RIPK3和MLKL磷酸化的免疫荧光染色

本文介绍了一种工程化化学重编程干细胞的方案，通过将这些细胞分化为多巴胺能前体细胞，移植到帕金森病小鼠模型中，并评估其行为学和电生理学结果，以验证移植细胞的成功整合及其功能有效性。...

化学遗传学调控重编程干细胞来源的前体细胞在治疗神经退行性疾病中的应用

了解利用siRNA电穿孔技术在单纯疱疹病毒1型感染的树突状细胞中调控自噬的方法。该技术可特异性阻断自噬流而不影响细胞成熟，为研究病毒免疫逃逸机制提供重要工具。

利用siRNA电穿孔技术调控单纯疱疹病毒1型感染的单核细胞来源树突状细胞中的自噬

探索更多视频