通过心肌毒素损伤和在 Vivo 中注射自传递 siRNA 在骨骼肌再生过程中的卫星细胞功能分析

该技术允许蛇毒心毒素的肌肉注射结合，肌肉内注射自送siRNA，从而允许分析骨骼肌的再生。应用自送siRNA是研究肌肉再生过程中单个基因功能丧失的优雅方法，从而避免转基因动物。在确认对手趾捏没有反应后，将颅小腿的注射区域从膝盖剃到爪子，并去除任何松动的头发。

将鼠标放在用无菌手术布覆盖的带头垫上，并使用 70% 乙醇对颅小腿的注射区域进行消毒。接下来，加载一个装有29规格针头的胰岛素注射器，用50微升20微摩尔心毒素，将皮肤完全刺穿肌肉，只是对膝盖的侧身。当针头就位时，沿肌肉全长注射心毒素在10到20秒的分娩周期内，同时来回移动针头，使心毒的均匀分布，从而伤害整个头骨前肌。

然后将鼠标返回到加热垫上的保持架，并监控直至完全恢复。手术后三天，消毒注射区域，正如刚刚证明的。如刚刚证明的，将多达50微升的siRNA注射到麻醉小鼠前肌的头骨上，

然后将鼠标返回到其保持架，并监控直至完全保持。在收集受伤的肌肉组织之前，将铝箔缠绕在铅笔上，用胶带封住铅笔，使模具底部提供均匀、封闭的表面。当模具准备好时，用70%乙醇对整个动物进行消毒，并使用额外的锋利的剪刀去除脚踝的皮肤。

在收获肌肉之前，使用细钳子通过受伤腿部脚踝的头骨旁边的筋膜捏紧钳子，然后向膝盖移动钳子以撕裂筋膜，露出头骨前肌。要分离头骨前肌，暴露侧肌腱，并抓住肌腱与精细的钳子。用弹簧剪刀剪肌腱，抓住肌腱的肌肉，将肌肉拉向膝盖。

为了分析中腹区域，使用直剪刀将中腹区域的头骨前肌肉切成两半大小相等，并用冷冻溶液填充铅笔模具的一半。将头骨前肌肉的两半插入冷冻模具中，直立位置，中间区域朝向模具底部。使用钳子将冷冻模具中途转移到液氮中。

当冷冻介质从透明变为白色并变成固体时，将冷冻模具转移到 80 摄氏度的冰柜中，或干燥冰进行未来处理。在控制肌肉中，组织结构保持不变，如肌黄体边缘核的定位，以及在间层空间中缺乏单核细胞的积累。心毒素中枢损伤七天后，新的肌黄细胞以位于中央的核形成，并积累单核细胞，主要由卫星细胞组成，但也包括免疫细胞等非肌细胞。

在休息条件下，以Pax7为标志的红色染色的卫星细胞位于基底层下，以绿色显示。受伤三天后，卫星细胞的数量增加，卫星细胞不再位于基底层下。受伤后第10天，卫星数量仍在增加。

为了进一步分析再生过程，新形成的米奥菲斯可以染色的抗体针对发育性米奥辛。使用siRNA注射两天后，可以分析卫星细胞是否存在荧光标记的siRNA。在这个具有代表性的实验中，再生肌肉中大约75%的卫星细胞对荧光标记的siRNA呈阳性反应。

此外，大约74%的再生的 myofibers 也对荧光标记的siRNA呈阳性反应，这表明74%的再生的 myofibers 接受了 siRNA，siRNA 阳性卫星细胞融合在一起形成新的 myofibers，或者与已经存在的再生 myofibers 发生了融合。最关键的一步是实现头骨前肌肉的完全损伤。除了组织学分析外，还可以记录产生的力等参数，以功能方式分析骨骼肌的再生。