Name: 通过心肌毒素损伤和在 Vivo 中注射自传递 siRNA 在骨骼肌再生过程中的卫星细胞功能分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学习利用心肌毒素损伤和自传递siRNA注射技术，在骨骼肌再生过程中分析卫星细胞基因功能。该方法无需转基因动物即可实现高效的肌肉再生研究。

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作者声明不存在竞争性财务利益。

所有动物实验程序均经德国图林根州食品安全部与消费者保护局动物福利部门批准（批准编号：03-048/16；TLV；巴特兰根萨尔察，德国）。
1. 心肌毒素诱导的肌肉损伤
注意：所有涉及活体小鼠的实验均须依照国家《动物福利法》并在适当的无菌条件下进行。此外，动物的安乐死必须符合国家《动物福利法》的规定。
<ol>
	<li>用70%乙醇对用于吸入麻醉的吸入盒及手术区域进行消毒。在将要进行手术的加热垫上放置无菌手术布。</li>
	<li>打开加热垫，设置温度为 37 °C。</li>
	<li>手术开始前15分钟给予镇痛药（例如，皮下注射美洛昔康，1 mg/kg体重）。 
	注意： 对于典型的实验，应使用至少6周龄、性别匹配且总体健康状况良好的小鼠。</li>
	<li>制备心肌毒素溶液（20 µM，溶于0.9 % NaCl），将溶液于-20 °C保存。</li>
	<li>让心脏毒素溶液达到室温（RT）。</li>
	<li>将小鼠放入吸入麻醉盒中，使用异氟烷（以纯氧为载体，起始浓度3.5–5%）诱导麻醉。通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉深度。</li>
	<li>将小鼠置于干净的纸巾上，通过鼻罩维持麻醉（1.5–3% 异氟烷，纯氧）。剃除颅侧小腿部位（从膝部至足垫）的注射区域毛发， 图1A）。去除所有多余的松散毛发。 
	注意： 在房间内将剃毛区域与注射区域进行物理分隔，可为注射操作提供更无菌的环境。</li>
	<li>将小鼠置于侧卧位&#160;将动物置于覆盖无菌手术布的加热垫上，并通过鼻罩维持麻醉（纯氧中含1.5–3%异氟烷）。</li>
	<li>用70%乙醇对小腿下部（从膝盖到足部）的注射区域进行消毒。</li>
	<li>在开始肌内注射前进行足趾捏压，以确认麻醉深度是否充分。</li>
	<li>使用胰岛素注射器（29号针头）将50 µL 心脏毒素（20 µM，溶于0.9% NaCl）注射至胫骨前肌。首先，从膝关节远端稍下方刺穿皮肤。</li>
	<li>将针头完全插入肌肉内（沿肌纤维方向/与胫骨平行），在缓慢注射毒素（10–20 秒）的同时来回移动针头，使毒素沿肌肉全长均匀分布，从而损伤整个胫骨前肌。图1B，C). 
	注意： 仅损伤一侧后肢的胫骨前肌，对侧的胫骨前肌可作为内部对照，以确定在注射心脏毒素前骨骼肌未发生病理性改变。</li>
	<li>将小鼠放回置于加热垫上的笼子中，并监测其恢复过程，直至动物恢复意识并能够自主活动。 
	注意： 小鼠仅会表现出轻微跛行。若小鼠严重跛行且完全无法负重于患肢，则应实施安乐死。</li>
	<li>在接下来的2天内给予镇痛药（例如，按1 mg/kg体重剂量皮下注射美洛昔康，每24小时一次），并每周进行监测。</li>
</ol>
2. 将自递送siRNA注射至再生腓肠肌（在心脏毒素损伤后第3天）
<ol>
	<li>根据制造商说明书，将siRNA（例如siRNA smart pool）重悬于0.9% NaCl中，配制siRNA溶液（终浓度为2 µg/µL）。 
	注意：siRNA经过化学修饰，可促进细胞被动摄取并防止核酸酶降解。无需使用转染试剂，从而降低毒性。使用针对同一基因的四种独立siRNA序列组成的smart pool可提高基因敲低效率。</li>
	<li>将siRNA储存于-20 °C，并在冰上转移至手术室。</li>
	<li>使用70%乙醇对用于吸入麻醉的麻醉盒及手术区域进行消毒。在将进行手术的加热垫上放置无菌手术布。</li>
	<li>将加热垫开启并设定温度为37 °C。</li>
	<li>将小鼠放入麻醉盒中，使用异氟烷（在纯氧中起始浓度为3.5–5%）诱导麻醉。通过脚趾夹捏无反应来判断麻醉深度。</li>
	<li>将小鼠置于覆盖有无菌手术布的加热垫上，呈侧卧位&#160;，并通过鼻罩维持麻醉（在纯氧中含1.5–3%异氟烷）。</li>
	<li>对颅侧小腿部位（从膝盖至足爪）进行消毒。</li>
	<li>在开始肌内注射前实施脚趾夹捏，以确认麻醉深度足够。</li>
	<li>使用带有29 G针头的胰岛素注射器，向受损的胫骨前肌内注射最多50 µL siRNA溶液（总量不超过100 µg，溶于0.9% NaCl中；靶向目标基因；以乱序siRNA作为对照）。</li>
	<li>将针头完全插入肌肉（沿肌纤维方向/与胫骨平行），并在缓慢注射siRNA溶液（持续10–20秒）的同时前后移动针头，使溶液沿整个胫骨前肌均匀分布。</li>
	<li>将小鼠转移回放置于加热垫上的笼子中，并监测其恢复过程，直至动物恢复意识并能自主活动。 
	注意：注射siRNA后不一定需要给予镇痛处理。</li>
</ol>
3. 胫骨前肌的解剖
<ol>
	<li>至少在使用前12小时配制冷冻液（2份OCT包埋剂与1份30%蔗糖水溶液），以避免产生气泡。</li>
	<li>用铝箔包裹铅笔并用胶带密封，制备冷冻模具。模具底部必须平整且完全封闭。 
	注意： 较小的冷冻模具可加快肌肉组织的冷冻速度，避免冷冻伪影的产生。</li>
	<li>处死小鼠，例如通过 CO2 在再生的相应时间点进行吸入麻醉，并用70%乙醇喷洒整个小鼠及解剖工具。 
	注意： 颈椎脱位还可用于在分离胫骨前肌时避免腿部过度出血。</li>
	<li>使用超精细锋利剪刀（刀刃长度：13）在踝关节处剪开皮肤，去除受伤后肢的毛发和皮肤&#160;毫米）并用镊子将皮肤向膝盖方向提起。</li>
	<li>为了暴露踝部的胫骨前肌腱，将剩余的皮肤向足部方向牵拉，或用锐利的剪刀剪开。 
	注意： 可将小鼠固定于支撑板上，以实现更稳固的固定。</li>
	<li>在收获胫骨前肌之前，使用精细镊子（Dumont 5 或 7，直头或弯头）去除筋膜。将闭合的镊子从受伤腿踝部胫骨旁的筋膜处轻轻夹住并分离图2A）。将镊子向膝关节方向移动，从而撕开筋膜，暴露胫骨前肌（图2B).</li>
	<li>为分离胫骨前肌，暴露其远端肌腱，并用精细镊子（Dumont 7，弯曲型）夹住肌腱。使用弹簧剪刀（刀刃长度：5&#160;毫米，尖端直径：0.35&#160;毫米）并牵拉肌肉（在肌腱处固定）向膝关节方向。</li>
	<li>为了收获胫骨前肌，使用锋利的剪刀尽可能靠近膝关节处将其剪下。</li>
	<li>冷冻前，用直剪刀在胫骨前肌肌腹中部将其切成大小相等的两半，以便分析肌腹中部区域（图2C，D).</li>
	<li>将冷冻液注入冷冻模具至其一半容量处。</li>
	<li>将胫骨前肌的两部分肌腹朝下放入冷冻模具中，使中段肌腹区域朝向模具底部（图2E确保胫骨前肌的两半部分垂直插入冷冻模具壁边，以防止肌肉倾倒。 
	注意： 模具中的冷冻液越多，冷冻所需时间就越长，从而增加产生冷冻伪影的风险。</li>
	<li>使用镊子夹住冷冻模具，并将其半浸入液氮中（图2F确保在冷冻过程中无液氮进入冷冻模具。</li>
	<li>观察冷冻过程，冷冻介质会从透明变为白色并逐渐凝固。将冷冻模具浸入液氮中数秒钟，然后转移至-80 °C超低温冰箱或干冰中，以备后续处理。</li>
	<li>将冷冻的肌肉组织连同冷冻模具一起在 -80 °C 下保存，直至后续使用。 
	注意： 冷冻模具可很好地适配24孔板或1.5 mL反应管，便于标记和有序保存。</li>
	<li>在干冰上操作冷冻模具中的肌肉样本，以供后续使用。</li>
</ol>
4. 胫骨前肌再生过程中的冷冻切片
<ol>
	<li>开始切片前，将冷冻切片机的舱室温度设置为 -21 °C，样品温度设置为 -20 °C，切片厚度设置为 10、12 或 14 µm（根据后续应用需求而定）（图 3A）。</li>
	<li>将含有肌肉样品的冷冻模具转移至冷冻切片机中，静置数分钟使其适应温度。在此期间，对显微镜载玻片进行标记。</li>
	<li>在冷冻切片机内使用预冷的镊子去除包埋肌肉周围的铝箔。避免触碰样品，以防包埋剂开始融化。</li>
	<li>用包埋剂将样品固定在冷冻切片机的金属样品头之上，使胫骨前肌的肌腹中段朝上。这样可确保肌肉的切面位置（模具底部）朝向操作者。</li>
	<li>将固定好样品的样品头插入切片装置。 
	注意：为确保样品顺利切片，开始前应使用新刀片。</li>
	<li>首先修块（30 µm），以获得平整的切面，并到达肌肉的相应区域（图 3B）。</li>
	<li>修块完成后，连续切取相应厚度的切片（例如 14 µm）。</li>
	<li>通过将载玻片倒扣在切片上方的方式将切片收集到玻璃载玻片上。切片会附着在载玻片上（图 3C）。</li>
	<li>将切片储存于 -80 °C 或 -20 °C，直至后续使用，或直接用于免疫荧光或免疫组织化学实验。</li>
</ol>
5. 再生标志物的免疫染色
<ol>
	<li>所有后续步骤均需在湿盒中进行。</li>
	<li>简要地，将切片在室温下平衡。</li>
	<li>每张载玻片加入 1 mL 2% PFA（溶于 PBS，pH 7.4）固定 5 分钟，室温操作。</li>
	<li>将 2% PFA 溶液倒入相应的废液容器中弃去。</li>
	<li>用 1 mL PBS（pH 7.4）洗涤 3 次，每次 5 分钟，室温操作。</li>
	<li>将 PBS 倒入废液容器中弃去。</li>
	<li>每张载玻片加入 1 mL 透化液（0.1% Triton X-100，0.1 M 甘氨酸溶于 PBS，pH 7.4），作用 10 分钟。</li>
	<li>将透化液倒入废液容器中弃去。</li>
	<li>每张载玻片加入 150 µL 封闭液（M.O.M. 1:40 溶于 PBS，pH 7.4），加盖盖玻片，室温孵育 1 小时。</li>
	<li>移除盖玻片和封闭液，每张载玻片加入 100 µL 一抗溶液 [PAX7，DSHB，小鼠 IgG1，未稀释；或 devMHC，DSHB，未稀释，小鼠 IgG1；以及层粘连蛋白（兔源，1:1,000）]，加盖盖玻片，4 °C 过夜孵育。 
	注意：通过省略一抗进行对照染色，改用封闭液孵育切片。</li>
	<li>用 1 mL PBS（pH 7.4）洗涤 3 次，每次 5 分钟，室温操作。</li>
	<li>将 PBS 倒入废液容器中弃去。</li>
	<li>每张载玻片加入 100 µL 二抗溶液（Alexa Fluor 546 山羊抗小鼠 IgG1 和 Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG，按 1:1,000 比例溶于封闭液），加盖盖玻片，室温孵育 1 小时。</li>
	<li>将载玻片置于避光环境中孵育，例如用铝箔包裹或使用黑色湿盒。 
	注意：此后所有步骤均应在避光条件下操作，因为某些二抗对光敏感。</li>
	<li>移除盖玻片和二抗溶液。</li>
	<li>用 1 mL PBS（pH 7.4）洗涤 3 次，每次 5 分钟，室温操作。</li>
	<li>将 PBS 倒入废液容器中弃去。</li>
	<li>进行 DAPI 染色：每张载玻片加入 1 mL 染色液，终浓度为 10 µg/mL，室温作用 5 分钟。</li>
	<li>将 DAPI 染色液倒入废液容器中弃去。</li>
	<li>用 1 mL PBS（pH 7.4）洗涤 3 次，每次 5 分钟，室温操作。</li>
	<li>彻底移除用于洗涤的 PBS。</li>
	<li>加入 2–3 滴水性封片剂，立即用新的盖玻片封片。</li>
	<li>将载玻片置于暗处室温下干燥 1 小时。</li>
	<li>将染色后的切片于 4 °C 避光保存，直至使用荧光显微镜进行进一步分析。</li>
</ol>
6. 苏木精和伊红染色
<ol>
	<li>所有后续步骤均需在湿盒中进行。</li>
	<li>每张载玻片加入 1 mL 2% 多聚甲醛（溶于 PBS，pH 7.4）固定 5 分钟，室温。</li>
	<li>将 2% 多聚甲醛溶液倒入相应的废液容器中。</li>
	<li>将载玻片转移至 Coplin 染色缸中。</li>
	<li>用自来水轻轻冲洗载玻片。 
	注意：勿将水龙头开得过大，以免损伤组织切片。</li>
	<li>将载玻片转移回湿盒中，吸去液体。</li>
	<li>每张载玻片加入 1 mL 伊红-苏木精染色液（Gill No 3），染色 2 分钟。</li>
	<li>将载玻片转移至 Coplin 染色缸中。</li>
	<li>用自来水轻轻冲洗载玻片，直至细胞核呈现蓝色。 
	注意：勿将水龙头开得过大，以免损伤组织切片。</li>
	<li>将载玻片转移回湿盒中，吸去液体。</li>
	<li>每张载玻片加入 1 mL 伊红 Y 溶液，孵育 2 分钟。</li>
	<li>将载玻片转移至 Coplin 染色缸中。</li>
	<li>用自来水轻轻冲洗载玻片，直至流下的水清澈透明。</li>
	<li>去除所有液体，让载玻片干燥 2 分钟。</li>
	<li>使用适用于免疫组织化学的封片剂封片。</li>
</ol>

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</ol>

我们感谢Christina Picker和Christine Poser提供的出色技术协助，以及Saskia Steiner在siRNA转染效率测定方面的帮助。感谢核心组织学服务部门提供的大力支持，特别是Sabine Landmann和Linda Rothenburger。同时感谢FLI动物设施小鼠部门提供的卓越支持。本工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目号：MA-3975/2-1）和德国癌症援助基金会（Deutsche Krebshilfe，项目号：DKH-JvM-861005）对J.v.M.的资助。

本文介绍了一种无需转基因动物即可研究特定基因在骨骼肌再生过程中功能的方法。该方法通过在损伤后第3天将自递送型siRNA注射到再生的骨骼肌中，结合由心脏毒素诱导的肌肉损伤来实现。我们详细描述了心脏毒素诱导肌肉损伤的操作步骤、自递送型siRNA的注射以及收获肌肉后的处理流程，以分析再生进程。我们证明，将蛇毒心脏毒素注射至骨骼肌可有效造成整个肌肉的损伤，且在注射后两天，自递送型siRNA可在再生骨骼肌中约75%的卫星细胞及其他细胞类型中被检测到（图4，图5）。
应特别注意胫骨前肌损伤的均一性，因为不同程度的损伤会影响肌肉再生结果，进而可能影响siRNA的作用效果。此外，至关重要的是，必须将自递送siRNA注射至整个再生区域。在分析再生过程时，建议始终比较骨骼肌再生区域中相似的部位，因此应将胫骨前肌从中间切开，以便始终比较肌肉的中腹部区域。在分析肌肉时，需对整个冷冻切片进行分析，因为胫骨前肌中的肌纤维组成存在差异，可能导致其再生情况不同。
可通过多种实验方法研究卫星细胞的功能，包括在分离的单个肌纤维上进行培养17、通过移植实验，以及分析骨骼肌在诱导损伤后的再生能力18,19。利用体内诱导损伤模型（例如注射心脏毒素）来研究卫星细胞功能，可进一步分析卫星细胞与其他细胞类型（如巨噬细胞）之间的相互作用，以及系统性因素对卫星细胞的影响2。骨骼肌损伤可通过多种方式实现，例如离心运动、冷冻损伤、注射BaCl2或注射蛇毒（如心脏毒素或notexin）18。尽管离心运动可能是最接近生理状态的损伤方法，但其对特定肌肉造成的损伤程度有限20。当研究目的为观察卫星细胞向损伤部位迁移，或仅需损伤肌肉的特定区域时，可采用冷冻损伤方法。然而，实验上冷冻损伤的缺点在于需要通过开放手术将预冷的金属探针接触肌肉组织。注射BaCl2或蛇毒是造成最显著损伤的方法，因而对卫星细胞功能的挑战最大。此外，该方法具有微创性，手术时间通常少于五分钟，且无需缝合等操作，从而显著降低了感染风险。
肌肉损伤模型常用于研究基因功能缺失所导致的功能性后果，例如Pax7缺失7,21。特别是当研究问题聚焦于老年小鼠时，通常难以实现转基因小鼠的构建或使用。此时，注射靶向特定基因的自递送siRNA是一种可行的替代方法，并已被成功应用22。简而言之，通过向小鼠胫骨前肌注射心脏毒素以诱导肌肉损伤，并在损伤后第3天注射靶向纤连蛋白（FN）的自递送siRNA。在损伤后第10天分析肌肉组织，结果显示，与随机序列siRNA对照组相比，siFN组卫星细胞数量显著减少。在siRNA注射后2天，通过定量实时PCR检测全肌肉裂解液中的基因表达水平，发现FN表达水平降低了58%，表明siRNA递送和基因沉默效率足以满足功能性分析的需求22。检测基因沉默效率的其他方法包括免疫印迹或使用靶向目标基因的抗体进行免疫荧光分析。用于体内注射的siRNA的效率和特异性应在注射至小鼠前预先确定，例如可在分离的卫星细胞或原代成肌细胞中进行测试。使用由4种不同siRNA组成的智能混合物（smart pool）相较于单一siRNA可提高沉默效率，但同时也增加了非特异性靶向的风险。所有使用的siRNA序列均应在细胞培养体系中进行特异性验证，以避免脱靶效应。作为对照，应使用非靶向性随机序列siRNA，因为siRNA本身的注射操作可能因注射过程造成额外肌肉损伤，从而影响再生过程。siRNA注射的时间点应根据具体科学问题及目标基因的表达模式来确定。通常情况下，在心脏毒素损伤后第3天注射自递送siRNA，可有效靶向大多数在卫星细胞增殖过程中起关键作用的基因，因为卫星细胞的增殖高峰出现在损伤后约第3天。首次siRNA注射时间不应早于心脏毒素损伤后48小时，原因是心脏毒素注射体积较大，需等待液体基本被重吸收后，再向肌肉内注射其他溶液。总体而言，可进行多次siRNA注射或联合使用多种siRNA，但需注意每次对再生中肌肉的注射都会造成额外损伤。
所述方法的一个局限性在于，所观察到的效果并不一定仅仅取决于卫星细胞中靶基因的敲低，还可能与其他细胞类型（如免疫细胞或纤维-脂肪生成祖细胞）有关。因此，有必要将这些实验与针对纯化卫星细胞群体的研究相结合。可以通过两种方式实现：一种是利用漂浮的肌纤维培养进行实验，其中卫星细胞在其相邻的肌纤维上培养；另一种是利用分离的卫星细胞进行移植实验17。
除了注射自递送siRNA外，还可根据科学问题选择注射小分子抑制剂或重组蛋白。例如，已有研究成功在老年小鼠中注射细胞外基质蛋白纤连蛋白（fibronectin）或JAK/STAT信号通路的小分子抑制剂15,16。若需在骨骼肌再生过程中针对特定细胞类型（如卫星细胞）研究某一基因的功能，则必须使用可诱导的遗传学小鼠模型。而注射自递送siRNA、重组蛋白或小分子抑制剂可能会影响再生骨骼肌中的多种细胞类型。

骨骼肌是人体最大的组织，约占体重的40%，负责实现自主运动。骨骼肌的组织结构主要由终末分化的、无分裂能力的多核肌纤维以及来自周围神经系统、血管系统和间质的多种其他细胞组成1。重要的是，骨骼肌在受到损伤后具有强大的再生能力，可恢复其功能2。这一过程依赖于组织驻留的肌肉干细胞，也称为卫星细胞3,4。卫星细胞位于肌纤维与基底膜之间，其特征是表达转录因子Pax75,6,7。在稳态条件下，卫星细胞处于静息状态，但当发生创伤性损伤时（例如通过离心运动）或通过实验性注射蛇毒心脏毒素，可激活这些细胞6,8。一旦被激活，表达Pax7的卫星细胞会同时表达MyoD和Myf5，促使干细胞进入肌源性分化路径。那些未上调分化决定因子的卫星细胞则保留其干性潜能，并返回静息状态，以补充干细胞库，应对未来的再生需求。在肌源性前体细胞扩增后，分化因子（如Myogenin）激活转录网络，促使细胞退出细胞周期并进行终末分化。这些肌前体细胞随后相互融合，或与现有肌纤维融合，为其提供新的肌核，以维持肌核域的大小。肌纤维表达终末肌肉分化基因，如肌球蛋白重链（Myosin Heavy Chain）。最终，新生的肌纤维生长并成熟，形成骨骼肌的功能单位9,10。
骨骼肌的再生可能受到多种因素的影响，包括肌肉疾病或衰老11,12，其严重程度从轻度功能障碍到危及生命的状况不等，例如杜氏肌营养不良症13,14。因此，再生医学旨在通过靶向卫星细胞功能，利用骨骼肌自身固有的再生能力来修复受损或功能异常的骨骼肌组织15,16。为了充分挖掘这一潜力，必须全面了解卫星细胞在其内源性微环境中的作用，特别是在骨骼肌再生过程中的行为。尽管已有实验方法可用于分离附着于肌纤维周围的卫星细胞17，但卫星细胞与其周围环境之间复杂的细胞和系统性相互作用，只有在体内才能被完整重现。在这方面，研究人员已通过小鼠损伤模型获得了大量关于骨骼肌再生的知识2,18。
本文介绍了一种特定的实验性小鼠损伤模型，用于在体内研究干细胞介导的胫骨前肌心肌毒素损伤后的再生过程。将一种来源于蛇毒的细胞溶解性毒素——心肌毒素注射至胫骨前肌中，该毒素可导致肌纤维去极化和坏死，进而引发组织退变，随后启动再生过程。为了分析基因在急性再生阶段的功能，于损伤后第3天（即卫星细胞扩增的高峰期）注射自递送siRNA。在不同时间点处死实验动物并采集胫骨前肌。分离后的肌肉组织经冷冻处理，用于后续冷冻切片。随后采用免疫荧光显微镜检测再生相关标志物。该方法可利用野生型小鼠研究单个基因在卫星细胞驱动的骨骼肌再生过程中的功能。

<table><tbody><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein</td><td>Isothesia</td><td>吸入性麻醉药</td></tr><tr><td>热板仪 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>麻醉系统（Tec 7）配吸入盒 + 鼻罩</td><td>Tem Sega</td><td>Minihub</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物剃毛器</td><td>isis</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>心脏毒素</td><td>Latoxan</td><td>L8102</td><td>诱导肌肉损伤所需的蛇毒</td></tr><tr><td>Accell siRNA smart pool</td><td>Dharmacon</td><td>根据目标基因而定</td><td>自递送siRNA</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21206</td><td>二抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 山羊抗小鼠 IgG1</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21123</td><td>二抗</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-1574</td><td></td></tr><tr><td>CV Mount</td><td>Leica</td><td>14046430011</td><td>免疫组织化学封片介质</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>细胞核染色</td></tr><tr><td>devMHC 抗体</td><td>DHSB</td><td>F.1652</td><td></td></tr><tr><td>伊红 Y</td><td>Thermo Fisher</td><td>73104</td><td></td></tr><tr><td>Gill 3号苏木精</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS316-500ML</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器（29G）</td><td>Terumo</td><td>3SS05M2813</td><td>用于肌肉注射的注射器</td></tr><tr><td>层粘连蛋白抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>M.O.M 封闭试剂</td><td>Vector labs</td><td>MKB-2213</td><td>免疫荧光染色封闭用</td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>Metacam</td><td>镇痛药</td></tr><tr><td>OCT包埋剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>6502</td><td>组织包埋</td></tr><tr><td>Pax7 抗体</td><td>DSHB</td><td>PAX7</td><td>卫星细胞特异性抗体</td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36934</td><td>水性封片介质</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td>组织包埋</td></tr><tr><td>Superfrost plus 载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1830AMNZ</td><td>显微镜载玻片</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td>通透化试剂</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;解剖工具&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont 5号，直头</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 7号，弯头</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>超精细Bonn剪刀（刃长：13&amp;nbsp;mm）</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>窄头镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-16</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪刀（刃长：5&amp;nbsp;mm，尖端直径：0.35&amp;nbsp;mm）</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

通过心脏毒素损伤及体内自递送sirna注射分析卫星细胞在骨骼肌再生过程中的功能

Analyzing Satellite Cell Function During Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injury and Injection of Self-delivering siRNA In Vivo

骨骼肌在损伤后具有极强的再生能力。这一过程主要由肌肉干细胞（也称为卫星细胞）驱动。卫星细胞的特征是表达转录因子Pax7，并位于静息状态骨骼肌的基底膜下方。当肌肉受损时，卫星细胞被激活，通过自我更新或分化，形成新的肌纤维或与受损肌纤维融合。体内卫星细胞的功能可通过基于心脏毒素的骨骼肌损伤模型进行研究。为了研究某一基因在骨骼肌再生过程中的功能，通常使用转基因小鼠模型。本文介绍一种替代转基因小鼠的方法，用于研究基因在卫星细胞再生过程中的功能，例如在无法获得相应转基因小鼠的情况下。我们将特定骨骼肌的心脏毒素介导损伤与自递送siRNA注射相结合，将siRNA注入正在再生的肌肉中，使其被卫星细胞及其他细胞摄取。由此，我们提供了一种在生理条件下研究卫星细胞基因功能的方法，无需依赖转基因小鼠。

苏木精-伊红（H&E）染色的典型结果&amp;E) 展示了胫骨前肌在注射心脏毒素造成损伤前后的染色结果 图4A，B在对照肌肉中，肌纤维周围细胞核位于肌纤维周边，间质区域无单核细胞聚集，表明肌肉结构保持完整图 4A）。在心脏毒素介导的损伤后7天，形成新的肌纤维，其特征是细胞核位于中央。图4B此外，可观察到单核细胞的聚集，这些细胞主要由卫星细胞组成，但也包括免疫细胞等非肌源性细胞。整个肌肉均应出现损伤，其特征是肌纤维核全部位于中央，且在整个肌肉切片上均可见单核细胞的聚集。
为了表征再生过程的进展和成功程度，可使用多种再生标志物进行免疫荧光染色。通过Pax7染色可评估卫星细胞的数量，Pax7是卫星细胞的经典标志物（图4C,D）。损伤后三天，卫星细胞数量增加（图4D），此时卫星细胞不再位于基底膜下方。为进一步分析再生过程，可使用针对发育型肌球蛋白的抗体对新生肌纤维进行染色（图4E）。新生肌纤维表现出中央定位的细胞核，并强烈表达发育型肌球蛋白。随着肌纤维的成熟，发育型肌球蛋白的表达逐渐减弱，肌纤维直径增大，细胞核则向肌纤维周边迁移。
通过使用转基因小鼠或如本实验所示的自递送siRNA注射，可研究单个基因在再生过程中的作用。在损伤后第3天（即卫星细胞增殖达到峰值的时间点），将荧光标记的自递送阴性对照siRNA注射至正在再生的胫骨前肌中。在注射siRNA两天后，分析卫星细胞中是否存在荧光标记的siRNA（图4F）。我们分析了在向再生肌肉注射siRNA两天后，有多少卫星细胞摄取了荧光标记的siRNA（图5）。结果显示，再生肌肉中约75%的卫星细胞呈荧光标记siRNA阳性。此外，我们发现约74%的再生肌纤维呈荧光标记siRNA阳性，这表明要么是74%的再生肌纤维直接摄取了siRNA，要么是siRNA阳性的卫星细胞彼此融合形成了新的肌纤维，或与已存在的再生肌纤维发生了融合（图5）。上述结果提示，卫星细胞能够摄取自递送siRNA，并且该siRNA在卫星细胞中至少可存留两天。
<img alt="小鼠模型：皮肤超声与注射，实验性药物递送过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60194/60194fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：将心脏毒素注射至胫骨前肌。（A）小鼠通过吸入异氟烷进行麻醉，并剃除下肢毛发。（B）使用29 G针头将针插入胫骨前肌（C），并在注射心脏毒素溶液过程中沿胫骨移动针头。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60194/60194fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠肌肉提取过程；用于分析的组织制备科学实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60194/60194fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：损伤胫骨前肌解剖与冷冻过程的步骤。（A）暴露后肢肌肉（B），撕开包绕胫骨前肌的筋膜以暴露该肌肉。（C）取出肌肉后，使用锋利的直剪刀在肌腹中部将其剪成大小相似的两半（D）。（E）将解剖所得的两半肌肉置于装有冷冻液的铝箔模具中，并在液氮中速冻（F）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60194/60194fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="切片机操作流程示意图：A）切片机设置；B）样品夹持；C）载玻片制备，组织学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60194/60194fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：胫骨前肌冷冻切片所用设备及操作步骤。（A）将冷冻切片机的腔室温度设定为 -21 °C。（B）将含有胫骨前肌的冷冻包埋液固定于样品夹持器上。（C）将厚度为 14 µm 的切片贴附于玻璃载玻片上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60194/60194fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肌肉组织的组织学与免疫荧光图像；肌纤维结构与蛋白质表达分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60194/60194fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：胫骨前肌再生过程的代表性图像。 胫骨前肌在注射 cardiotoxin 前（A）和注射后 7 天（B）的 H&amp;E 染色结果。（C）在未受伤的肌肉中，Pax7 阳性细胞（红色）位于基底膜下方，基底膜由层粘连蛋白标记（绿色）。细胞核经 DAPI 复染（蓝色）。Pax7 阳性细胞由箭头标示。（D）再生 10 天后，肌纤维表现为细胞核居中（蓝色），Pax7 显示为红色，层粘连蛋白为绿色。Pax7 阳性细胞由箭头标示。（E）新生肌纤维表达发育型肌球蛋白（红色），层粘连蛋白为绿色，细胞核经 DAPI 复染（蓝色）。（F）在向 cardiotoxin 损伤后第 3 天的再生胫骨前肌注射自递送 siRNA（siRED，红色显示）后 2 天，荧光标记的自递送 siRNA（红色）仍可在卫星细胞（Pax7 阳性，绿色，插图中箭头所示）中检测到。层粘连蛋白显示为白色，细胞核经 DAPI 复染（蓝色）。比例尺 = 100 µm（A 和 B），50 µm（C–E），25 µm（F）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60194/60194fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="siRNA 效应图；Pax7+ 细胞与再生肌纤维的比较；包含数据表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60194/60194fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：荧光标记 siRNA 摄取量的定量分析。（A）在心脏毒素诱导损伤后第 3 天注射，于再生骨骼肌中注射后 2 天对卫星细胞（Pax7+ 细胞）和再生肌纤维的 siRNA 摄取量进行定量分析。n = 3，误差线表示标准误（SEM）。（B）图（A）中所示图表的原始数据定量结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60194/60194fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

我们介绍了一种体内方法，通过结合心脏毒素介导的骨骼肌损伤和自递送siRNA注射，研究卫星细胞中特定基因功能的丧失。

通过心脏毒素损伤及体内自递送siRNA注射分析卫星细胞在骨骼肌再生过程中的功能

骨骼肌在损伤后具有极强的再生能力。这一过程主要由肌肉干细胞驱动，这些细胞也被称为卫星细胞……

该技术可结合使用蛇毒心脏毒素的肌肉注射与自递送siRNA的肌肉注射，从而实现对骨骼肌再生过程的分析。应用自递送siRNA是一种研究单个基因在肌肉再生过程中功能缺失的巧妙方法，可避免使用转基因动物。在确认动物对足趾夹捏无反应后，剃除从膝关节至足掌的前肢下段注射区域的毛发，并清除所有松散的毛发。将小鼠仰卧置于覆盖无菌手术布的头部垫上，使用70%乙醇消毒颅侧小腿的注射区域。随后，用胰岛素注射器（配备29号针头）吸取50 µL 20 µmol的肌毒素，将针头完全刺入膝盖远端的肌肉内。针头到位后，在10至20秒的给药时间内，边缓慢前后移动针头边沿肌肉全长注射肌毒素，以确保肌毒素均匀分布，从而损伤整块胫骨前肌。然后将小鼠放回垫有加热垫的笼子中，并进行监测，直至其完全恢复仰卧状态。手术后第3天，按上述方法对注射区域进行消毒。按照上述方法，向麻醉小鼠的胫骨前肌注射不超过50 µL的针对目标基因的siRNA。然后将小鼠放回笼中，并监测直至完全仰卧。在采集受损肌肉组织前，用铝箔包裹一支铅笔，并用胶带密封铅笔，使模具底部形成平整且封闭的表面。模具准备好后，用70%乙醇对整个动物体表进行消毒，并使用超锐利剪刀去除踝部皮肤。在取材肌肉之前，用精细镊子夹住受伤腿踝部胫骨旁的筋膜处已闭合的镊子，向膝关节方向移动镊子以撕开筋膜，暴露胫骨前肌。为分离胫骨前肌，需先暴露其远端肌腱，并用精细镊子夹住该肌腱。使用弹簧剪剪断肌腱，然后在肌腱处夹住肌肉，将肌肉向膝关节方向牵拉。为了便于分析肌腹区域，使用直剪刀在胫骨前肌的肌腹部位将其切成大小相等的两半，并用冷冻液将铅笔模具填充至一半。将胫骨前肌的两半组织垂直放入冷冻模具中，使肌腹区域朝向模具底部。用镊子将装有组织的冷冻模具半浸入液氮中。当冷冻介质由透明变为白色并完全凝固后，将冷冻模具转移至-80摄氏度冰箱或干冰中，以备后续处理。在对照肌肉组织中，组织结构保持完整，表现为细胞核位于肌纤维周边，间质区域无单核细胞聚集。心脏毒素介导损伤7天后，出现新的肌纤维，其特征是细胞核位于中央，同时伴有单核细胞聚集，这些细胞主要为卫星细胞，也包括免疫细胞等非肌源性细胞。在静息状态下，以红色标记的 Pax7 染色所示，卫星细胞位于绿色显示的基底膜下方。损伤后 3 天，卫星细胞数量增加，且卫星细胞不再位于基底膜下方。损伤后第 10 天，卫星细胞数量仍然增加。为了进一步分析再生过程，可使用针对发育型肌球蛋白的抗体对新形成的肌纤维进行染色。在注射siRNA后两天，可检测卫星细胞中是否存在荧光标记的siRNA。在此项代表性实验中，再生肌肉中约75%的卫星细胞对荧光标记的siRNA呈阳性反应。此外，约74%的再生肌纤维也对荧光标记的siRNA呈阳性，这表明要么是74%的再生肌纤维摄取了siRNA，要么是siRNA阳性的卫星细胞相互融合形成了新的肌纤维，或者与已存在的再生肌纤维发生了融合。最关键的步骤是实现胫骨前肌的完全损伤。除了组织学分析外，还可记录如肌肉产生的力量等参数，以功能性方式分析骨骼肌的再生情况。

analyzing-satellite-cell-function-during-skeletal-muscle-regeneration

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

通过心肌毒素损伤和在 Vivo 中注射自传递 siRNA 在骨骼肌再生过程中的卫星细胞功能分析

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