分离的月毛心室肌细胞的光学成像

心力衰竭是世界男性和女性的主要死因。新的证据表明，心脏和系统代谢的改变有助于心力衰竭的病理学。快速识别哪些代谢物影响激励-收缩耦合仍然是一个挑战。

将心肌细胞与成年小鼠隔离的传统方法是一个耗时且具有挑战性的过程。本文中的创新方法使严格的流程更加高效且更易于执行。此外，使用荧光探针，我们可以对化学物质如何诱导细胞水平的心脏毒性或功能障碍进行许多表型评估。

通过确定哪些分子改变菌细胞功能，可以确定治疗心力衰竭的新疗法。使用转基因小鼠，我们可以探索不同的基因，以确定哪些可以防止和促成心力衰竭。这些信息对于未来治疗心力衰竭至关重要。

演示程序将是马修· 克洛斯和一个学生什雷亚斯 · 苏雷什。首先，在冰上解冻工作层压素溶液。使用 P1000 移液器，吸气 200 微升层明，并沿着灭菌盖玻片的一侧边缘轻轻拖动移液器尖端，使毛细管动作拉出少量层压素，以方便盖玻片附着到六孔板。

然后以圆周运动排出盖玻片中心的剩余层压素。将层压液滴铺在盖玻片上。将盖玻片放在 37 摄氏度的培养箱中至少一小时，并在隔离前 24 小时。

要将菌细胞与感冒 KHB-HB 中准备好的心脏分离，请将样品置于立体显微镜下。为了防止余烬，将主管淹没在 KHB - HB 溶液中，并使用 20 毫升注射器迫使溶液通过，从而对主管进行。确保心脏被淹没，在心脏切除前，管管被修复。

用 5 钳子，可以拉心脏。通过将管尖的尖端可视化到心室中大约一毫米高，确认管的正确定位。然后通过旋转兰根多夫上的塞子启动 KHB-HB 的流。

将管与兰根多夫连接，使心脏跳动五分钟。接下来，旋转止损器，将灌注从 KHB-HB 储液罐切换到消化缓冲储液罐。一旦消化缓冲液到达心脏，设置一个计时器。

在无菌的100毫升烧杯中收集香水。根据需要用香水重新填充消化缓冲储液罐，直到消化时间过期。消化后，在无菌的100毫升烧杯中，用钳子和虹膜剪刀分离心脏的腔室。

将每个腔室放入一个六井板的单独井中。将五毫升胶原酶溶液倒入每井中。立即用剪刀将心脏组织切成大约一立方米的块状。

使用无菌转移移液器，用消化缓冲液轻轻三叶草缝合切碎的心脏组织。一旦组织块变白和羽毛，将板放在倒置显微镜下检查细胞。如果可行细胞的数量大于80%，则使用100微米细胞过滤器将细胞应变成50毫升的圆锥管。

如果可行细胞的数量小于 80%，请检查其凝固时间。如果凝固时间超过五分钟，试试另一颗心。如果没有，通过胶原酶采样程序检测新的胶原酶槽。

接下来，在215次g下离心两分钟，使细胞产生颗粒。颗粒应紧凑且不松动。如果颗粒松动，制备中含有许多死细胞。

在组织培养罩中，将紧凑型颗粒重新在 10 毫升的停止缓冲液中重新暂停。在215倍g下离心两分钟，再次使细胞分裂。将细胞重新用五毫升电镀缓冲液中重新填充。

在细胞计数器上执行细胞计数，并调整电镀缓冲液的体积，以达到最终的菌细胞浓度为每毫升四个细胞的二倍10。现在，从培养箱中取出层压涂层的盖玻片。如果存在，吸气层压液滴。

每个盖玻片上 200 微升的菌细胞悬浮液。将盖玻片放在 37 摄氏度的培养箱中，用 21% 氧气和 5% 二氧化碳放置两个小时，以便进行附件。两小时后，拿出盖玻片，吸走未连接的细胞。

在37摄氏度的孵化器中加入两毫升的培养媒体和文化，长达四天。首先，从膜电位套件中卸下组件 A 和组件 B。在15毫升锥形管中，组合50微升组件B和5微升组件的组件B，形成电压染料混合物。

漩涡混合。将 10 毫升电镀介质加入含有电压染料混合物的 15 毫升圆锥管中，形成膜电位染料混合物。再次，漩涡混合。

然后从培养箱中取出一个六井盘的菌细胞。吸气媒体。在每个孔中加入800微升膜电位染料混合物。

用铝箔盖住板，在室温下离开板 15 分钟。之后，从每一井中吸出染料介质混合物，并在每井中加入一毫升经过改良的Tyrode溶液。用铝箔盖住。

按显微镜、电弧灯、超开关、荧光接口系统、MyoCam 电源、现场刺激器和计算机的顺序打开设备。确保激发发射滤光片组适用于成像染料。例如，fura-2 在 340 纳米和 380 纳米的光下兴奋。

它在510纳米的光下发出。Fluo-4 和电压膜染料在 485 纳米的光下兴奋，在 520 纳米的光下发出。通过打开真空，完全打开软管夹，用泰洛德的溶液轻轻将每个 60 毫升注射器放入歧管中，为记录系统提供总理。

对于钙录音，请使用标准泰洛德的解决方案。对于电压记录，请使用经过修改的泰洛德解决方案。打开在线加热器。

保持温度，使室内的香水温度在36°或1°C以上，至少15分钟。接下来，打开采集软件。确保为正确的成像染料设置了参数。

关闭刺激器。在黑暗中，从六井板上取下铝箔，并在起搏室中放置盖玻片。将板放在显微镜下，并使用 10 倍目标聚焦在菌细胞上。

一旦对焦，开始起搏，以一赫兹和0.2伏特的场刺激。逐渐增加电压，直到获得一对一起搏。然后提高电压，直到达到阈值的1.5倍。

从 10 倍目标切换到 40 倍目标。专注于遵循一对一起搏的单元格。调整塑料色调，使视野中只有一个单元格。

使用该软件，将兴趣区框放在定义良好的沙科梅上。启动采集软件以启动激发光。使用中性密度滤波器，相应地调整强度设置，以获得足够的信噪比。

在这里，显示了使用fura-2从C57BL/6小鼠菌细胞中记录的代表性钙和沙康缩短痕迹。从C57BL/6小鼠及其转基因垃圾伴侣获得的合奏平均数据的定量显示，除了10赫兹起搏的放松时间外，各组之间没有区别。从 C57BL/6 鼠标菌组以 10 赫兹的步调记录的电压跟踪被后处理，以获得可用信号。

在低通巴特沃思或萨维茨基-戈莱数字滤波器被应用后，合奏的平均动作潜力显示了动作电位形状的细微差别。从以一赫兹步步为步的大鼠菌细胞记录的痕迹显示，除了电压信号低于钙信号外，收缩动力学也不同。这是因为钙染料缓冲钙，而电压染料不缓冲钙。

与钙瞬态一样，菌细胞在光学作用潜能持续时间上表现出与起搏相关的变化。药物引起的行动潜力的延长也证明了这一点。20秒记录的最后11秒表明，长期暴露于蓝光导致活动触发。

尝试此过程时，要记住的最重要的事情是尽可能使用最强强度的光，这样您就不要损坏菌体。使用我们的方法分离的菌细胞也可用于免疫组织化学或进行西方印迹分析。这种技术之美，使研究人员能够快速评估分子和基因的多样性如何利用单一系统帮助激发-收缩耦合。