Name: 通过电形成和微移液器测量其机械性能，对巨型Unilamellar混合囊泡的吸收 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学习使用微吸管抽吸技术测量巨型单层囊泡的膜机械性能，包括弯曲模量和面积压缩模量。该方法可准确评估合成与真实聚合物脂质囊泡的柔韧性与稳定性。

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作者衷心感谢法国国家研究局（ANR）的财政支持（ANR Sysa）。

1. 制备微移液管
注意：此处需要内径范围为 6 到 12 µm、锥形长度约为 3–4 mm 的微移液管。以下将详细介绍微移液管的制备方法。
<ol>
	<li>将硼硅酸盐玻璃毛细管放入拉制仪的拉杆中，并通过拧紧旋钮固定一端。</li>
	<li>小心地将玻璃管穿过加热室侧面的孔洞。</li>
	<li>拧紧另一端的夹紧旋钮。</li>
	<li>控制尖端尺寸和锥形长度以达到所需规格。为此，需优化加热温度、拉力、速度、延迟和压力等技术参数。以下是一个所用程序的示例： 
	加热：550 °C 
	拉力：10（仪器范围：0–255，任意单位） 
	速度：30（范围：0–255，任意单位） 
	延迟：1（范围：0–255，任意单位） 
	压力：500（范围：0–999，任意单位）</li>
	<li>点击 PULL 以执行程序定义的操作。毛细管随后被分离成两根微电极，其尺寸需使用显微操作仪进行调整。</li>
	<li>将微电极插入显微操作仪的金属电极夹持器中（见图1）。使用10倍物镜，调节显微镜载物台和电极操作器（垂直和水平移动），使电极尖端接近玻璃珠表面。</li>
	<li>踩下脚踏开关以熔化玻璃珠。降低尖端并使其接触熔融的玻璃珠，熔融玻璃将通过毛细作用流入电极内。等待数秒，直至熔融玻璃上升至如图1插图所示的适当高度。</li>
	<li>松开脚踏开关停止加热，并迅速使用垂直电极操作器将尖端拉开，使其形成锐利的断裂。</li>
	<li>重复步骤1.7和1.8，直至获得所需直径（6至12 µm）。 
	注意：为提高直径测量的准确性，在最后一步应使用配备目镜测微尺的32倍物镜。</li>
</ol>
2. 用BSA（牛血清白蛋白）包被移液器吸头
<ol>
	<li>配制含有1%（质量分数）BSA的0.1 M葡萄糖水溶液。
	<ol>
		<li>称取180 mg葡萄糖粉末，置于15 mL聚丙烯圆锥形离心管中，加入纯水定容至10 mL。</li>
		<li>加入0.1 g BSA粉末，使用试管旋转混合器轻轻振荡，直至完全溶解（约4小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用一支10 mL一次性鲁尔接头注射器（带针头）吸取上述溶液。充满后取下针头，安装0.22 μm醋酸纤维素滤器，将溶液过滤至多个聚丙烯微量离心管（1.5 mL）中，用于浸没移液吸头。</li>
	<li>将毛细管垂直放入支架中。将支架下降，使管尖浸入葡萄糖/BSA溶液中过夜。溶液应通过毛细作用上升约1 cm高度。</li>
	<li>将移液吸头从葡萄糖/BSA溶液中取出。配制5 mL 0.1 M葡萄糖溶液（将90 mg葡萄糖粉末溶于5 mL纯水中），并通过0.22 μm醋酸纤维素滤器过滤。</li>
	<li>使用配备柔性熔融石英毛细管的500 µL玻璃注射器将葡萄糖溶液吸入移液吸头内，然后通过回吸将全部葡萄糖溶液吸出并弃去（图2）。重复此步骤数次，以去除未结合的BSA。</li>
</ol>
3. 通过电形成法制备GUV和GHUV
注意：电形成法是一种由 Angelova 开发的常用技术9。以下将介绍制备电形成腔室、沉积脂质或聚合物薄膜（或同时沉积以制备GHUVs，即巨型杂化单层囊泡）的方法，以及在交变电场下对薄膜进行水合的步骤。此外，还描述了收集所获得的巨型单层囊泡（GUV）的操作流程。
<ol>
	<li>两亲分子、蔗糖和葡萄糖溶液的配制
	<ol>
		<li>配制浓度为1 mg/mL的两亲性分子溶液。称取10 mg两亲性分子，溶于10 mL氯仿中。将溶液置于密封小瓶中，以避免溶剂挥发。</li>
		<li>制备1,2-二油酰基-sn氯仿中浓度为1 mg/mL的-glycero-3-磷酸乙醇胺-N-（丽丝胺罗丹明B磺酰基）（DOPE-Rhod）</li>
		<li>添加 10 µL 将荧光脂质溶液加入两亲性分子溶液中。将溶液置于密封小瓶中，以避免溶剂挥发。</li>
		<li>配制浓度为 0.1 M 的蔗糖和葡萄糖溶液。分别称取 342 mg 蔗糖和 180 mg 葡萄糖，溶于 10 mL 纯水中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电极形成室的制备 
	注意：可使用不同的导电材料制作电穿孔装置（例如铂丝10，不锈钢针11）。电形成室由两片ITO载玻片组成，中间用一个O形橡胶垫片隔开，垫片一侧被切割形成开口。通过两根导线将载玻片连接至电压发生器（图3 和 图4A).
	<ol>
		<li>用有机溶剂（如氯仿）清洗ITO载玻片，使用欧姆表识别导电表面。</li>
		<li>使用胶带将电线连接到导电面。</li>
		<li>两亲分子溶液沉积
		<ol>
			<li>将毛细管浸入溶液中，直至液面通过毛细作用上升，并收集约 5 μL 溶液的</li>
			<li>将毛细管与ITO玻璃片中心接触，轻轻铺展溶液。等待10秒，以确保溶剂完全挥发（图4A).</li>
			<li>每侧重复此步骤 3 次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在打开的无O形圈垫片两侧涂上一层无硅润滑脂。将其放置在沉积区域周围。将第二块ITO玻璃片的导电面朝下放在垫片上方。</li>
		<li>将电形成室置于真空环境中3小时，以去除任何有机溶剂残留。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电穿孔形成程序
	<ol>
		<li>将电线连接到发电机上。</li>
		<li>使用以下设置用于发生器： 
		交替正弦张力 
		频率：10 Hz 
		振幅：2 V峰峰值 
		注意：每种系统必须确定最佳的电压频率和持续时间。</li>
		<li>确保在向腔室注入溶液之前先施加电压。</li>
		<li>使用内径为0.8 mm针头的注射器注入1 mL溶液以填充腔室，去除可能存在的气泡。</li>
		<li>在施加电压/频率的条件下孵育75分钟（图4B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GUVs 收获
	<ol>
		<li>关闭发生器。</li>
		<li>使用内径为0.8 mm的1 mL注射器，吸取少量溶液以在腔室内产生一个气泡。轻微倾斜腔室，使气泡在腔室内移动。这有助于GUVs从ITO表面脱离图4C).</li>
		<li>吸出所有溶液并转移至1 mL塑料管中。</li>
		<li>移除导线，并用有机溶剂（甲苯，然后氯仿）清洗ITO载玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 显微操作装置的设置
注意：微管吸吮法的原理是通过施加负压，将单个囊泡吸入玻璃微管中。通过测量囊泡在微管内形成的舌状突起长度随负压的变化来获取数据。如前所述，微管表面用牛血清白蛋白（BSA）进行包被，这对于防止或尽量减少囊泡膜与微管之间的黏附至关重要。
以下展示了该实验方案。
<ol>
	<li>移液管与注水储液槽连接 
	注意：装满水的水箱和千分尺固定在一块滑动板上。带有千分尺读头的数字计数器可使装置实现0至2.5 cm范围内的垂直位移，精度为 1 µm. 可沿长度最长为1米的铝制光学导轨进行位移。硅胶管将储液槽与毛细管支架相连（图5A).
	<ol>
		<li>用纯水注满水箱。将一次性5 mL注射器连接到毛细金属支架上 通过 硅胶管并抽吸以产生从水箱到固定装置的水流。</li>
		<li>轻轻触碰管壁以消除气泡。同时抬高水箱以产生正压。5 mL 注射器仍固定在支架上。</li>
		<li>在完成前述的包被和清洗步骤后（见步骤2），用葡萄糖溶液填充毛细管，直至其末端形成一滴液滴。将注射器管路从金属支架上取下，使其末端产生轻微的水流。</li>
		<li>将毛细管倒置，使葡萄糖液滴与来自支架的水流相连接。通过拧紧将毛细管和支架固定在一起。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>放置移液器 
	注意：在此操作过程中，水箱仍需置于铝制导轨上，以维持正压。
	<ol>
		<li>取自制的铝制载物台，其两侧各粘附一块经乙醇清洁的玻璃盖玻片，并用真空润滑脂固定。将该装置安装在显微镜载物台上，使用含有 0.1 M 葡萄糖的 1 mL 注射器在两块盖玻片之间形成弯月面，如图所示 图5B，C.</li>
		<li>将移液管及其支架放置在显微操作仪的电机单元上，并拧紧夹紧旋钮。</li>
		<li>使用控制面板操纵杆在粗调模式下将微移液管降至葡萄糖弯月面附近。切换至微调模式，调节尖端位置至弯月面中心。</li>
		<li>将尖端浸入葡萄糖溶液中数分钟，以清洗其外表面和内表面（由于保持正压，水流将冲洗移液管内表面，去除未结合的BSA）。</li>
		<li>在显微操作器键盘上保存尖端位置，并将其从弯月面撤出。</li>
		<li>移除葡萄糖弯月面，并更换为新的。吸取 2 μL 在0.1 M蔗糖溶液中制备GUVs的方法 20 μL 微量移液器，并将其置于新鲜的葡萄糖弯月面中。在微分干涉差（DIC）模式下观察由于蔗糖（主要位于GUVs内部）与葡萄糖（主要位于GUVs外部）之间密度差异而沉降在底部的GUVs。</li>
		<li>当囊泡略微收缩时，重新插入吸液移液管并聚焦于其尖端。设定高度 H0 利用溶液中自然存在的微小囊泡或颗粒，调整水箱高度，直至这些颗粒的运动几乎停止，此时水箱的压力接近于0。</li>
		<li>此时，用矿物油包围弯月面以防止水分蒸发，参见 图5D. 
		注意：室温应控制在20-22 °C 通过使用空调。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微吸管抽吸实验
	<ol>
		<li>降低移液器吸头（6-12 µm 直径）并产生微弱负压（-1 cm）以吸取囊泡（15-30 µm 直径）。所选囊泡的膜应出现轻微波动，且不得有任何可见缺陷（无出芽或丝状结构）（图6).</li>
		<li>使用显微操作器将移液管提升至更高位置，以使吸持的囊泡与其他囊泡分离，并在整个实验过程中保持该位置。</li>
		<li>通过将装水的水箱降至约 -10 cm 对囊泡进行预加压，然后降低压力使其恢复至初始值（-1 cm）。重复此步骤数次，以去除膜上的多余部分及微小缺陷。</li>
		<li>从由水箱位置定义的-0.5 cm高度处，通过千分尺缓慢降低吸力压力，使膜进入波动状态。随后增加压力，以清晰观察到尖端处出现具有显著伸展长度（数微米）的舌状结构。 
		注意：所施加的最低压力（P0）以吸走最短的膜突起长度（L0) 将定义参考点 α0 (图7A）。曲线上所有数据点的测量均以此为参考（ΔL = L-L0 和 ΔP = P-P0).</li>
		<li>逐步调节微米计以增加吸力压力，直至达到 0.5–0.8 mN/m。每一步骤保持 5 秒，并拍摄舌部图像。该低张力条件下的操作程序可用于测定弯曲模量。</li>
		<li>通过调节轨道上装水滑块的高度（范围从 -2 到 -50 cm），逐步将吸力从 0.5 mN/m 增加至破裂张力图7B-D在高张力状态下的本实验中，将测量面积压缩模量、溶血张力和溶血应变。</li>
		<li>拉伸约15–20个囊泡以获得具有统计学意义的数据。每次微管吸吮实验耗时7至10分钟。使用LASAF软件进行图像分析，测量舌状突起长度、囊泡直径及毛细管半径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量弯曲模量、面积压缩模量、溶血张力和溶血应变
	<ol>
		<li>要获取这些参数，请使用 E. Evans 建立的理论方法。12. 根据公式1计算施加在膜上的吸力压力： 
		Δ P = ρwg (h−h₀) (1) 
		其中 g 为重力加速度（9.8 m·s⁻²）−2），ρw 是水的密度（ρ = 1 g∙cm−3），h 为水箱的位置，h0 是压力等于零的初始位置。</li>
		<li>根据拉普拉斯方程计算膜张力： 
		<img alt="流体稳定性方程，σ = ΔP/2 [RP/(1-(RP/Rv))]；用于平衡分析的公式。" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> (2) 
		其中，ΔP 为微管吸液压力，Rp 和 Rv 分别为移液管和囊泡的半径（移液管外部）。膜的表面积应变（α）定义为： 
		<img alt="吸收系数公式，α=(A-A0)/A0，用于科学分析情境。" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"> (3) 
		<img alt="静力平衡示意图，包含 ΣFx=0、MA=0 方程，用于演示力的平衡原理。" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 3"> 为囊泡在较低负压下的膜面积。</li>
		<li>根据公式4，由囊泡在毛细管尖端内投影长度的增加量ΔL计算α12: 
		<img alt="静力平衡公式，α=1/2(Rp/Rv)^2(1-Rp/Rv)ΔL/Rp，用于表示物理概念的符号方程。" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 4"> (4)</li>
		<li>在极低张力条件下，热弯曲涨落的平滑化主导了表观膨胀。绘制 ln(σ) 与 α. 在低σ值情况下（通常为0.001–0.5 mN.m）−1 13），这会得到一条直线，其斜率与弯曲模量K相关b （方程5的第一项）14: 
		<img alt="静力平衡方程；α = kT/8πKb ln(1 + A0σ/24πKb) + σ/Kσ；物理公式" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 5"> (5) 
		注意：在高张力条件下（&gt; 0.5 mN·m−1），膜的起伏完全被抑制，膜面积因分子间距增大而增加。在此状态下，公式5的第二项占主导地位，可用于获得面积压缩模量Ka (图8 和 图9).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

微移液管的包被是获得可靠测量结果的关键之一。必须防止囊泡黏附于微移液管，文献中通常采用BSA、β-酪蛋白或Surfasil进行包被17,18,19,20,21，但很少提及包被步骤的具体细节。
为实现良好的溶解，BSA 应在搅拌条件下至少溶解 4 小时。然而，仍需进行过滤步骤，以去除可能堵塞微量移液器吸头的任何聚集体。如果 BSA 未充分溶解，大部分将被过滤去除，导致包被效果不佳。理想的浓度和溶解时间分别为 0.8–1 wt. % 和 4 小时。
另一个关键点是在测量过程中确保囊泡内外渗透压恒定。实验过程中由于水分蒸发导致葡萄糖浓度升高，可能引起囊泡收缩，从而干扰测量结果（例如，导致Ka</sub...

自20世纪70年代以来，由磷脂（脂质体）制备的巨型囊泡被广泛用作基本的细胞膜模型1。20世纪90年代末，嵌段共聚物通过自组装形成的囊泡结构（称为聚合物囊泡，以类比其脂质类似物）2,3迅速成为脂质体的一种有吸引力的替代方案，因为脂质体机械稳定性较差且化学功能可调性有限。然而，与由细胞膜主要成分——磷脂构成的脂质体相比，聚合物囊泡的细胞仿生特性相对有限。此外，在某些应用（如药物递送）中，其较低的膜通透性可能成为问题，因为这些应用需要物质通过膜的可控扩散。近年来，将磷脂与嵌段共聚物结合以构建杂化聚合物-脂质囊泡和膜的研究日益增多4,5。其主要思路是设计出能够协同结合各组分优势的结构（即脂质双分子层的生物功能性和通透性，以及聚合物膜的机械稳定性和化学多样性），这些结构可应用于多个领域：可控且靶向的药物递送、用于诊断的生物传感器中的生物分子识别、人工细胞的功能性膜、以及仿生微/纳米反应器的开发。
如今，不同的科学领域（生物化学家、化学家、生物物理学家、物理化学家、生物学家）对开发更先进的细胞膜模型日益关注。本文旨在尽可能详细地介绍现有方法（电形成法、微管吸吮法），以获取和表征巨囊泡的力学性质，以及近期的相关进展 &#34;高级&#34; 杂合聚合物-脂质巨型囊泡的细胞膜模型4,5.
这些方法的目的是可靠地测量膜的面积压缩模量和弯曲模量，以及其破裂应力和应变。目前测量巨囊泡弯曲刚度的最常用技术之一是基于直接视频显微观察的涨落分析法6,7；但该方法需要膜具有明显的可见涨落，而在较厚的膜（如聚合物囊泡）上通常难以系统获得。面积压缩模量可通过朗缪尔-布洛杰特（Langmuir Blodgett）技术在实验中测定，但通常限于单分子层8。微管吸吮技术则可在一次实验中对形成巨单层囊泡（GUV）的双分子层同时测量这两个模量。
以下方法适用于所有能够通过电形成法形成双层膜并进而形成囊泡的两亲性分子或大分子。这要求双层膜在电形成温度下具有流动性。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;微移液管设计所需的设备与材料&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td>外径和内径分别为1 mm和0.58 mm。</td></tr><tr><td>纤维已安装</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>FB255B</td><td>2.5 mm × 2.5 mm 盒式灯丝</td></tr><tr><td>火焰/布朗微管拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>NARISHGE 公司</td><td>MF-900</td><td>配备两个物镜（10x 和 32x）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;用于BSA包被移液管尖端的材料&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白第五组分（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>一次性1 ml鲁尔接头注射器</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>一次性10 ml鲁尔接头注射器</td><td>科丹</td><td>626616</td><td></td></tr><tr><td>一次性5 ml鲁尔接头注射器</td><td>科丹</td><td>62.5607</td><td></td></tr><tr><td>一次性醋酸纤维素滤膜</td><td>Cluzeau Info Labo</td><td>L5003SPA</td><td>孔径：0.22&amp;micro;m，直径：25 mm</td></tr><tr><td>柔性熔融石英毛细管管材</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP530660</td><td>内径 536&amp;micro;m，外径 660&amp;micro;米，</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>注射器 500 &amp;micro;L luer Lock GASTIGHT</td><td>Hamilton 注射器公司</td><td>1750</td><td></td></tr><tr><td>试管旋转混匀仪</td><td>Labinco</td><td>28210109</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;显微操作装置搭建&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝制光学导轨，1000 mm 长度，M4 螺纹，X48 系列</td><td>纽波特</td><td></td><td></td></tr><tr><td>减震光学平台</td><td>纽波特</td><td></td><td>用作显微镜的支撑，以防止外部振动。</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP 2</td><td>模块单元（X、Y 和 Z 方向移动的电机单元）通过适配器安装在倒置显微镜上。</td></tr><tr><td>微米</td><td>Mitutoyo Corporation</td><td>350-354-10</td><td>数显液晶千分表头 25.4 mm 量程 0.001 mm</td></tr><tr><td>有机玻璃水储液罐（100 ml）</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 倒置共聚焦显微镜（DMI6000），配备共振扫描仪和水浸物镜（HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I）。</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X48 轨道载具，80 mm 长度，带 1/4-20、8-32 和 4-40 螺纹</td><td>纽波特</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;蔗糖与两亲性分子溶液制备所需材料&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611&quot; 目标=&quot;空白&quot;&gt;2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR</td><td>22711.244</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-磷脂酰乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810146C</td><td>罗丹明标记脂质</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;电极形成装置&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L型玻璃毛细管封口环</td><td>Hirschmann</td><td>9600110</td><td></td></tr><tr><td>一次性1 ml鲁尔接头注射器</td><td>科丹</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>H 润滑脂</td><td>Apiezon</td><td>阿皮松 H 润滑脂</td><td>无硅润滑脂</td></tr><tr><td>镀有氧化铟锡的玻璃载片</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>703184</td><td></td></tr><tr><td>针</td><td>Terumo</td><td>AN2138R1</td><td>0.8 × 38 mm</td></tr><tr><td>欧姆表（万用表）</td><td>Voltcraft</td><td>VC140</td><td></td></tr><tr><td>甲苯</td><td>VWR</td><td>28676.297</td><td></td></tr><tr><td>电压发生器</td><td>Keysight</td><td>33210A</td><td></td></tr></tbody></table>

通过电形成法制备巨型单层杂化囊泡及利用微管吸吮法测量其力学性质

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

由磷脂和嵌段共聚物制备的巨型囊泡可应用于多个领域：可控且靶向的药物递送、用于诊断的生物传感器中的生物分子识别、人工细胞的功能性膜结构，以及仿生微/纳米反应器的开发。在所有这些应用中，对其膜特性的表征具有根本性的重要意义。在现有的表征技术中，由 E. Evans 首创的微管吸吮法（micropipette aspiration）能够测量膜的力学性质，例如面积压缩模量、弯曲模量以及破裂应力和应变。本文介绍了从脂质或嵌段共聚物（或两者）的薄膜制备巨型囊泡的全部方法与详细步骤、微管的制备与表面处理，以及实现上述各项参数测量的吸吮操作流程。

通过上述方案，我们研究了不同类型的合成巨型单层囊泡（GUV），这些囊泡来源于磷脂：2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）、三嵌段共聚物：聚环氧乙烷-b-聚二甲基硅氧烷-b-聚环氧乙烷（PEO12-b-PDMS43-b-PEO12）（该共聚物在先前的研究中合成13）以及二嵌段共聚物聚二甲基硅氧烷-b-聚环氧乙烷（PDMS27-b-PEO17）。我们课题组此前已证实，三嵌段共聚物PEO8-b-PDMS22-b-PEO8与磷脂POPC结合所形成的巨型杂化单层囊泡（GHUVs）的膜韧性显著降低15。本研究重复了该测量，并进一步扩展...

本实验方案的目的是通过微管吸吮法可靠地测量巨囊泡的膜力学性质。

由磷脂和共聚物制备的巨型囊泡可应用于多种领域：可控与靶向药物递送、生物分子检测……

本方案利用微管吸吮技术，可对合成及真实聚合物脂质囊泡的膜力学特性进行可靠测量。该技术是唯一能够在单次实验中评估膜柔韧性及延展不稳定性的方法。本方案包含从囊泡制备到力学性能评估的一系列操作步骤。保持耐心并在出现问题时及时解决技术难题至关重要。这些技术的可视化对于理解如何正确处理毛细管表面以及如何执行必要的预应力步骤非常关键。展示出无缺陷的囊泡。演示该实验操作的是来自实验室的博士研究生 Martin Fauquignon，他致力于杂化聚合物-脂质囊泡的开发研究。在开始实验前，将冰冷的玻璃微量移液毛细管垂直插入支架中，并将支架下移，使毛细管尖端浸入 freshly prepared 葡萄糖-牛血清白蛋白溶液中，过夜孵育。到第二天早晨，溶液应通过毛细作用上升至尖端约一厘米处。使用配备柔性熔融石英毛细管的500微升玻璃注射器，将每个移液管充满葡萄糖溶液。然后从每个移液管中抽吸溶液，并多次用新鲜的葡萄糖溶液重新填充移液管，直至完全去除所有血清。制备电穿孔室时，首先使用适当的有机溶剂清洁ITO载玻片，并用欧姆表识别导电面。用胶带将导线固定在每片载玻片的导电面上。将一根毛细管插入安瓿溶液中，通过毛细作用吸取约5 µL溶液。将装有溶液的毛细管接触一块玻璃ITO片的中心位置，并轻轻将溶液在载玻片表面铺展开。待溶剂完全挥发后，按上述方法再重复涂覆溶液两次。随后，在开口O形环垫片周围沉积区域的两侧均匀涂抹一层无硅润滑脂。接下来，将第二片ITO玻璃片的导电面朝下放置在隔片上方，并将电形成室置于真空环境中3小时，以去除任何有机溶剂残留。进行巨大单层囊泡的电形成时，将电极导线连接至信号发生器，将发生器的频率设置为10赫兹，输出幅度设置为2伏特（峰峰值）。设定电压后，使用装有内径为0.8毫米针头的注射器向腔室内注入1毫升0.1摩尔的蔗糖溶液，并在设定的电压和频率下静置75分钟。电泳成膜结束后，关闭信号发生器，并用1毫升注射器吸取少量溶液，直至腔室内产生一个气泡。将样品室略微倾斜，使气泡进入样品室，并帮助囊泡从载玻片表面脱离。然后用注射器吸取全部溶液。接着，将囊泡溶液转移至一个1毫升的塑料管中。为准备显微操作材料，通过抽吸产生水流，将纯水储液罐连接至一个支架上。在抬高储液罐的同时轻轻敲击，以排除任何气泡，并建立正压。用新鲜的葡萄糖溶液填充经血清包被的毛细管，直至管尖形成一滴溶液。将注射器管路从金属支架上取下，使支架末端产生轻微的水流，然后将毛细管倒置，使葡萄糖液滴与水流接触。接着，将毛细管和支架拧紧连接。为固定移液管，使用真空脂将定制铝制载台上的两片玻璃盖玻片粘合在一起。将载玻片安装到显微镜载物台上。使用1毫升移液器，用0.1摩尔葡萄糖在两片载玻片之间形成弯月面。将移液器及其支架放置在显微操作仪的电机单元上。拧紧夹紧旋钮，使用控制面板操纵杆在粗调模式下将微移液管降至葡萄糖弯月面附近。切换至微调模式，调节管尖位置，使其对准弯月面中心。将吸头浸入葡萄糖溶液中，以清洁其外表面和内表面。数分钟后，将毛细管从弯月面中取出，并用新鲜的弯月面替换葡萄糖溶液。用20微升微量移液吸头吸取2微升含有0.1摩尔蔗糖的巨型单层脂质体。将囊泡引入弯月面。使用显微镜观察载玻片腔室底部的囊泡。当囊泡略微塌陷时，重新插入吸管，并聚焦于吸管尖端。然后将水箱的基线高度调节至颗粒运动停止时的压力。用矿物油包围弯月面，以防止蒸发。进行微管吸吮实验时，将移液管尖端降至弯月面中。施加轻微的负压以吸住囊泡。所选囊泡的膜应出现轻微波动，且不应有任何可见的缺陷。使用显微操作仪将移液管抬升至更高位置，以将吸住的囊泡与其他囊泡分离。将水箱降低至约10厘米，以在升高水箱恢复至初始压力前对囊泡进行预应力处理。从0.5厘米高度开始，缓慢降低吸力压力，直至达到膜发生波动的压力值。随后增加压力，以清晰观察到尖端处出现几微米长的舌状突起。为测定弯曲模量，以每步一微米的幅度逐步增加吸力压力，直至达到 0.5 至 0.8 毫牛顿每米。每步之间等待五秒，并在每次加压后拍摄舌部图像。为了测定面积压缩模量以及破裂张力和应变，需从0.5毫牛顿每米开始持续增加吸力压力，直至达到破裂张力。在此代表性实验中，POPC的面积压缩模量和破裂应变与文献报道的预期值完全一致。在此表格中可观察到所获得的聚合物囊泡的典型数值。需要注意的是，由嵌段共聚物制备的膜的韧性远高于由三嵌段共聚物制备的膜。有趣的是，使用二嵌段共聚物可以制备出巨型杂合单层脂质-聚合物囊泡，其韧性显著强于脂质体所测得的韧性。本方案有助于使用移液管对囊泡进行操作，例如通过渗透休克法测定膜的通透性。务必严格且精确地完成每个步骤，尤其是在建立三联连接时。该技术已用于通过测量修饰囊泡主要边界处的线张力，来理解膜裂变的物理起源。

obtention-giant-unilamellar-hybrid-vesicles-electroformation

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

通过电形成和微移液器测量其机械性能，对巨型Unilamellar混合囊泡的吸收

将功能性膜蛋白重构到特定组分的巨型脂质体中，结合膜片钳电生理技术，是一种强大的研究方法。然而，传统的巨型脂质体制备方法可能不利于蛋白质的稳定性。本文描述了从纯脂质或含有离子通道的小型脂质体制备巨型脂质体的实验方案。...

用于成像和膜片钳电生理学研究的巨型脂质体的制备

通过微流控喷射技术作用于液滴界面脂双层，可可靠地生成具有可控膜不对称性、跨膜蛋白整合及物质包封能力的囊泡。该技术可用于研究多种需要区室化生物分子的生物系统。...

利用微流控喷射技术生成脂质双层囊泡

展示了两种脱水-再水化方法——电形成法和凝胶辅助溶胀法，将跨膜蛋白KvAP重组到巨大单层囊泡（GUVs）中的过程。在这两种方法中，含有该蛋白的小区单层囊泡融合形成GUVs，随后可通过荧光显微镜和膜片钳电生理技术进行研究。...

将跨膜蛋白——电压门控离子通道KvAP——重组入巨大单层囊泡，用于显微镜与膜片钳研究

我们介绍一种制备支撑脂双层的方案，并利用原子力显微镜和力谱技术对其进行表征。...

原子力显微镜成像与支持性脂双层的力谱分析

关于相分离巨型单层囊泡（GUVs）的实验常常忽略了生理溶液条件。本研究提出了一种方法，用于探究高盐缓冲液对带电多组分GUVs中液-液相分离的影响，该影响随跨膜溶液不对称性和温度的变化而变化。...

对称与非对称溶液条件下带电囊泡相行为的荧光显微镜监测

细胞中有许多蛋白质能够感知并诱导膜曲率。本文介绍一种从脂质囊泡中拉取膜纳米管的方法，用于研究蛋白质或任何具有曲率活性的分子与弯曲膜之间的相互作用 体外.

从巨大单层囊泡中拉取膜纳米管

我们介绍一种利用局部钙离子梯度对囊泡进行非接触式微操作的技术。通过在巨型脂质囊泡附近微注射钙离子溶液，可重塑脂质膜，从而形成膜管状突起。...

响应局部钙离子梯度的巨型囊泡膜重塑

本方案描述了模拟细胞的单脂质和多脂质囊泡、支撑脂双层以及悬浮脂双层的制备方法。这些 体外 模型可进行调整以包含多种脂质类型，并可用于研究各种分子和大分子间的相互作用。...

用于研究分子相互作用的模拟细胞支撑及悬浮脂双层模型的构建

本文介绍了一种制备具有囊泡内嵌囊泡结构的复合型巨大单层囊泡（cGUVs）的方法，可定制其内层、环形间隙及外层区域的电导率。通过电形成法合成简单的GUVs，再经渗透冲击将其转化为口形体和cGUVs，为研究有核细胞的生物物理特性提供了有价值的模型。...

合成复合型巨大单层囊泡：一种模拟有核细胞的生物仿生模型

本初学者指南介绍了一种通过液滴转移法制备巨大单层囊泡（GUVs）的通用实验方案，讨论了其中的关键步骤，并提供了相关见解，以帮助针对不同应用（包括合成生物学和微机器人技术）进行可能的调整。...

使用液滴转移法制备巨型单层囊泡的可靠方法

学习使用微吸管抽吸技术测量巨型单层囊泡的膜机械性能，包括弯曲模量和面积压缩模量。该方法可准确评估合成与真实聚合物脂质囊泡的柔韧性与稳定性。

通过电形成法制备巨型单层杂化囊泡及利用微管吸吮法测量其力学性质

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