使用微流体芯片以确定性方式建立基于单细胞的共培养物

有效结合捕获效率与动态活细胞图像观察，了解细胞-细胞相互作用对细胞行为的影响至关重要。该管可以高效捕获较大腔室中的多个单细胞，并提供足够的培养基，用于动态跟踪多个单细胞相互作用行为。首先准备 PDMS 设备。

将晶圆模具放在称重盘中，在干燥器中加100微升三氯硅烷，并吸尘15分钟。在 37 摄氏度下停止真空，将干燥器中的晶圆模具盐化至少一小时。将 PDMS 基座和 PDMS 固化剂以 10 比 1 的比例混合，然后在 15 厘米的培养皿中将总共 20 克混合物倒入晶圆模具上。

将 15 厘米的盘子放入干燥器中，并吸尘一分半钟。然后从干燥器中去除盘子，用氮气消除 PDMS 中的残余气泡。将盘子放在65摄氏度的烤箱中，加热PDMS两到四个小时。

完成后，从晶圆模具中取出 PDMS 副本，并在 PDMS 上打孔 1.5 毫米入口和 0.5 毫米出口。使用可拆卸胶带清洁 PDMS 副本和滑动表面。用氧等离子体处理表面。

然后，手动将 PDMS 副本与幻灯片对齐，并使其相互接触。将 PDMS 幻灯片放在 65 摄氏度的烤箱中一天。第二天，将 PDMS 设备浸入装满 PBS 的容器中。

将其放入干燥器中，并吸尘 15 分钟。将设备移动到细胞培养罩，用紫外线消毒 30 分钟。将 PDMS 设备缓冲器更换为介质，并在 4 摄氏度下孵育一天。

当细胞达到70至80%的汇合时，去除培养培养，用五毫升PBS轻轻洗涤三次。将含有一微摩尔荧光染料的一毫升DMEM/F-12介质加入WNT5B sh4和pLKO-GFP细胞，并在室温下孵育30分钟。孵育后，用五毫升无菌PBS轻轻清洗细胞三次，取出PBS，并加入两毫升0.25%的三辛-EDTA。

在室温下孵育细胞四分钟，然后轻轻敲击培养皿，促进细胞分离。加入4毫升DMEM/F-12基基，分散WNT5B sh4和pLKO-GFP细胞，将细胞转移到15毫升管中，以300xg离心3分钟。取出上一提液，轻轻将细胞颗粒重新悬浮在一毫升DMEM/F-12培养基中。

以每毫升三倍十至五细胞的浓度准备一毫升细胞悬浮液，并放在冰上以防止细胞聚集。在设备出口和注射器泵之间连接聚四氟乙烯管。取出介质，并将准备好的电池悬浮液的一微升添加到 PDMS 设备的入口中。

接下来，使用注射器泵以每分钟 0.3 微升的流量将细胞悬浮液加载到设备中。将一微升 DMEM/F-12 介质添加到设备的入口中，然后使用注射器泵将介质加载到设备中。使用注射器泵将 0.3 微升 DMEM/F12 介质加载到设备中，流量为每分钟 10 微升。

装入电池后，取出管子，用聚烯烃胶带密封入口和出口，以创建封闭的培养系统。将 PDMS 设备移动到 10 厘米培养皿中，并在设备周围添加 10 毫升无菌 PBS，以避免介质蒸发。将培养皿转移到三个单细胞培养的孵化器。

PDMS 设备具有三层结构，具有连接到培养室和旁路通道的捕获站点。培养室和旁路通道之间的流量电阻差异允许单元流入捕获位置，这会导致以下单元通过旁通通道进入下一个捕获站点。回流步骤用于从捕获站点释放单元格并将其发送到培养室。

在三种不同的细胞类型上评估了此协议的细胞捕获效率。人类淋巴内皮细胞，或LEC，人类口腔鳞状细胞癌T2.6细胞表达WNT5B特异性短发夹RNA，和pLKO-GFP病媒控制细胞。三个示范细胞的单细胞捕获效率为LEC的71%，WNT5B sh4细胞的74%，pLKO-GFP细胞的78%。

三个单细胞捕获效率为48%该方法可用于淋巴内皮细胞和鳞状癌细胞的多个单细胞共培养，在显微镜下观察细胞的增殖和形态。确保准备好的细胞悬浮液具有最小的细胞聚合非常重要，因为细胞聚合不仅会降低单对对效率，而且会堵塞微通道。单个细胞之间的细胞相互作用在控制细胞行为方面起着重要作用。

我们的方法可以提供一个有效的工具，帮助研究人员研究细胞-细胞在单个细胞水平，这可能会导致新的机制的发现，这是不容易获得基于人群的研究。