Name: 受控自动脱氧过程中与氧梯度压质测定的病带特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学习氧梯度激光衍射法测定镰状细胞病患者红细胞变形能力的技术。该方法可在受控脱氧和再氧合条件下评估镰状行为，为疾病严重程度和治疗效果提供生物标志物。

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本工作部分得到了Eurostars基金（项目编号estar18105）以及RR Mechatronics公司提供的无限制资助的支持。作者感谢Sisto Hendriks和Jan de Zoeten提供的技术支持。

所有操作均经乌得勒支大学医学中心（UMCU）伦理委员会批准，并遵循《赫尔辛基宣言》。在德克萨斯儿童血液学中心（TCHC）入组的患者经当地机构审查委员会批准，并符合《赫尔辛基宣言》的规定。
1. 一般注意事项
<ol>
	<li>首先进行一次测试测量，以预热转子和样品杯。确保转子和样品杯的温度为 37 ˚C。这对于获得良好的重复性至关重要。</li>
	<li>确保黏性聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液在室温（22 ˚C）下符合严格的渗透压（282–286 mOsm/kg）、pH 值（7.35–7.45）和黏度（27.5–32.5 MPa）范围。 
	注意：PVP 必须在室温下使用。若储存温度较低，务必在测量前使其恢复至室温。</li>
</ol>
2. 启动变形红细胞计
<ol>
	<li>打开计算机和ektacytometer背面的电源开关，启动软件程序（材料表）在计算机上。</li>
	<li>打开氮气钢瓶，确保氮气可供使用，以对样品进行脱氧处理。</li>
	<li>将转子放入杯中，并确保杯子能够自由转动。用软布和蒸馏水清洁杯的内壁和外壁，因为残留物可能影响弹性成像（EI）测量结果。</li>
	<li>当软件程序运行时，检查屏幕上是否出现以下消息： &#34;确保气体阀门已打开&#34;&#160;并单击 好的.</li>
	<li>确保ektacytometer开始pO2 屏幕上将显示自检流程。请选择 开始 (进入）。如果失败，请通过点击重新运行自检 硬件检查 | pO2 | 自检. 
	注意：如果自检再次失败，请考虑更换 O2-点。O2用指尖从杯内轻轻将旧的样本点推出以替换；通过从杯外轻轻将新的样本点推入杯内来放置新样本。</li>
	<li>选择 pO2 扫描 从左侧列出的不同测试中选择 设置 屏幕右侧，并确保其设置符合所列参数要求 表1每次测量时保持相同的设置。</li>
	<li>为了保存这些设置，请按 好的 | 好的. 
	注意：首选设置列于 表1 但可根据用户偏好和研究目的进行调整。例如，为更深入地研究镰状行为，可改变脱氧速度和持续时间。</li>
</ol>
3. 样品采集与制备
注意：为验证该技术，使用了来自乌得勒支大学医学中心或德克萨斯儿童血液中心的38名镰状细胞病（SCD）患者和5名健康对照者的乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝血液样本，这些样本来自不同的临床研究（荷兰试验注册库[NTR]编号：NTR 6779 和 NTR 6462），同时也使用了门诊或住院患者就诊后匿名的剩余血液样本。
<ol>
	<li>通过静脉穿刺采集血液样本（每份样本至少300 µL），使用含EDTA的采血管。确保血液在4 °C下保存至少30分钟，但不超过24小时。 
	注意：也可使用枸橼酸盐磷酸盐右旋糖酐腺嘌呤（CPDA）或肝素，但这些试剂对样本保存在氧梯度变形红细胞测定中的影响尚不明确。</li>
	<li>轻轻颠倒混匀样品。切勿振荡样品。测量前将样品置于滚轴摇床上，使其升至室温。 
	注意：容量为9–10 mL的样本管若在4 ˚C下保存超过1小时，需复温15分钟；若在4 ˚C下保存不足1小时，需复温10分钟。容量为2–6 mL的样本管若在4 ˚C下保存超过1小时，需复温10分钟；若在4 ˚C下保存不足1小时，需复温5分钟。</li>
	<li>使用血细胞分析仪检测全血细胞计数。操作时，取20–200 µL全血置于含EDTA的试管中。将血细胞分析仪的吸样针插入试管，按下吸样针后方的按钮，启动检测。 
	注意：在全血细胞计数中，红细胞数量（RBC）被测定，这是标准化氧梯度变形红细胞测定测量的重要因素。红细胞计数通过流式细胞术的前向散射和侧向散射计算得出。健康对照组的正常红细胞计数为 3.7–5.0 x 1012/升（女性）以及 4.2–5.5 × 1012/L（男性）。镰状细胞病（SCD）患者的红细胞计数通常降低。部分血液分析仪还可检测红细胞密度百分比（% DRBC），该指标在解读个体氧梯度变形性测定曲线时具有附加价值。</li>
	<li>将全血样本标准化为红细胞计数 200 x 106 5 mL PVP 中的红细胞（200 × 106 通过调整将要加入的样本体积来控制每瓶红细胞数量（RBCs/vial）。如果总红细胞计数低于 200 x 106衍射图样和EI将会受到影响。
	<ol>
		<li>使用以下公式进行计数。 
		4.0/xx（x 1012/L) × 50 = yy µL 全血/瓶 PVP 
		其中xx为步骤3.3中计算得到的红细胞计数，yy为实际测量所需的全血量。根据贫血程度及其他影响红细胞计数的因素，所需全血量为40–90 µL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 氧梯度变形红细胞测量法检测
<ol>
	<li>用移液器将计算好的样品体积（yy µL 血液）加入 PVP 中，使总体积达到 5 mL。通过轻轻重悬血液 3 次来预润湿枪头。使用开口较宽的移液器吸头，以避免对红细胞造成额外应力。手动轻柔颠倒混匀样品，直至均匀。 
	注意：打开 PVP 管的时间应尽可能短，以避免与空气接触。</li>
	<li>将 2.0 mL 血液/PVP 混合液缓慢吸入一个无针的 3 mL 注射器中。推动活塞，排除任何可见气泡和过量液体，直至注射器中剩余 1.5–1.8 mL（根据杯体体积而定）。</li>
	<li>通过连接器将全部样品体积缓慢且均匀地注入转子中。确保样品液面高于氧传感器（粉红色斑点）以及小的吸液孔。注射器中不得残留任何样品溶液。</li>
	<li>点击 新建，填写样品编号、备注、捐献日期和 PVP 黏度。点击 确定 |吸液。60 秒后，杯体将旋转并吸样 15 秒。当旋转停止后，点击 确定。关闭仪器盖子。点击 继续 | 立即开始，因为氧梯度变形红细胞测定采用固定增益。测量过程约需 28 分钟。</li>
	<li>测量完成后，打印报告，报告中包含由软件自动计算的曲线和参数。确保原始数据已自动保存至 设置 中指定的文件夹。最大伸长指数（EImax）、最小伸长指数（EImin）、95% EI 时的氧分压（pO2@95%EI，PoS）以及曲线下面积（area under the curve）将由软件自动计算，并添加到打印报告和原始数据中。</li>
	<li>通过计算 EImax 与 EImin 之间的差值，手动获得 ΔEI。通过计算去氧前（pO2 100–120 mmHg）平均 EI 与再氧合期间（100–120 mmHg）平均 EI 值的差值，计算百分比回复率。</li>
</ol>
5. 变形红细胞计的清洗
<ol>
	<li>取下样品注射器，更换为装有蒸馏水或去离子水的注射器。</li>
	<li>按下清洗，在冲洗过程中缓慢推动活塞，确保双向冲洗。</li>
	<li>取下注射器并提起转子，用软布彻底擦干转子、外筒和连接头。</li>
	<li>使用大容量注射器（10–50 mL）冲洗连接头，以清除管路和转子中残留的水分。堵住转子的下部进出口，使管路内产生反向压力，从而排出残留水分。</li>
	<li>将转子降入外筒中。仪器现在已准备好进行下一次测量。</li>
</ol>
6. 机器关闭
<ol>
	<li>按照上述方法，在上次测量后确保仪器已正确冲洗，并确认清洁液连接的管路正确无误。</li>
	<li>关闭软件，点击 关闭，然后按下 启动 以开始每日结束时的清洁程序。</li>
	<li>完成整个清洁程序后，取下注射器并提起转子。使用大号注射器冲洗连接器。</li>
	<li>清空废液瓶，并用软布擦干转子和测量杯。冲洗连接器以清除管路和转子中残留的水分。堵住转子的下部进/出口，使管路中产生回压，从而排出任何残留的水分。</li>
	<li>关闭仪器盖板。关闭氮气钢瓶。关闭计算机和仪器电源。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性经济利益。

本文介绍了氧梯度变形性测量法，该方法可用于研究镰状细胞病（SCD）患者红细胞在不同氧浓度下的镰变行为（图4 和 图5）。为了获得可重复的结果，必须明确影响实验结果的各种因素。例如，温度对红细胞（RBC）变形性具有显著影响，这主要归因于其对黏性溶液（PVP）黏度的影响。我们建议在每天实验开始前进行一次测试性测量，以确保仪器充分预热至 37 ˚C，从而提高结果的可重复性。黏性溶液的渗透压应控制在较窄范围内（PVP 为 282–286 mOsm/kg），因为渗透压会影响细胞的水合状态，进而影响红细胞的变形性。PVP 溶液的 pH 值和黏度也必须严格控制。pH 值和温度的差异可能对测量曲线产生显著影响22。此外，样品杯、转子及管路中残留的水分可能导致红细胞溶血，从而造成数据错误，因为样品杯中完整红细胞数量减少，将影响测量结果。
为进行氧梯度变形指数测定，可调整实验条件以解决特定的研究问题。推荐的设置参数见表1。选择1,300秒的去氧时间，是基于观察发现，延长去氧时间并未使大多数患者的最小变形指数（EImin）进一步降低。相反，缩短去氧时间会削弱氧梯度变形指数测定的分辨能力。复氧时间设定为280秒，原因是复氧过程中血红蛋白S（HbS）聚合物迅速解聚，同时变形指数随之恢复至去氧前的测量值。剪切应力设定为30 Pa，该值与渗透梯度变形指数测定所用参数相当。降低此参数可能削弱检测的分辨能力。若对所有患者样本采用相同的去氧速率，则可启用去氧控制功能。在我们推荐的设置中，该选项被关闭，因为去氧速率因患者而异，取决于其独特的血红蛋白解离曲线。因此，开启去氧控制将消除该检测中的个体化特征。然而，氧梯度变形指数测定中这一功能的优化仍在研究之中。
若干已知因素会影响氧梯度变形图参数，即 pH、温度和渗透压。变形图，尤其是 PoS，受 2,3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG）的影响22。此外，%HbF 与 EImin 之间存在明显相关性，与 PoS 的相关性较弱（图 5A–D）。EImax 与常氧条件下的镰状红细胞相关，这可以解释为何在血管闭塞危象（VOC）发生后不久，常氧条件下红细胞的变形能力（EImax）会升高。后者是由于在 VOC 期间最严重镰变的红细胞被破坏，从而导致变形能力最差的红细胞减少所致16。如 图 5F 所示，高比例的致密红细胞（定义为血红蛋白浓度 &#62;1.11 mg/mL 的红细胞）与较低的 EImax 显著相关。这表明致密红细胞是影响常氧条件下红细胞变形能力的重要因素，与先前报道的结果一致1。
样本标准化对于获得可重复的结果以及区分不同基因型和处理条件至关重要。校正红细胞（RBC）计数非常重要，因为红细胞数量会影响衍射图样的强度。若转子与杯壁间隙中的红细胞数量较少，曲线将向上并向左偏移。此外，曲线会出现波动，影响参数的准确计算，尤其是PoS值。
该技术的一个局限性在于，EI值代表了所有细胞（包括不同亚群）的平均值。镰状细胞病（SCD）患者红细胞群体的异质性及其对变形性测量的影响已被广泛研究。这促使了标准化方法的建立，即通过将衍射图样的大小调整为固定值，而非根据红细胞计数进行校正23,24。目前尚在研究这种标准化方法是否也应应用于氧梯度变形性测量。
基于在变形仪外部进行脱氧步骤的多种技术已被开发用于测量低氧条件下红细胞（RBC）的变形能力25,26,27。在这些条件下，在生理pH值下，血红蛋白S（HbS）性状患者与健康对照者之间的细胞行为差异未被观察到25。然而，氧梯度变形仪检测可清晰显示HbS性状个体存在虽低但明显的PoS（镰变起始氧分压）（图4A）。迄今为止，在常规临床实践中，用于体外测量个体患者红细胞镰变倾向的唯一替代方法是基于形态学的镰变检测：将红细胞置于促进HbS聚合的条件下（如低氧张力或低pH）孵育，孵育后加入固定剂，并通过光学显微镜手动或数字方式计数镰变细胞的百分比。许多临床前及早期药理学试验采用镰变检测作为次要结局指标，以预测药物在镰状细胞病（SCD）中的临床疗效28,29,30,31,32。然而，该方法耗时较长，变异度高，灵敏度低，且技术无法自动化，因此劳动强度大。此外，由于该检测是一种二维静态检测，镰变引起的形态学变化可能与红细胞变形能力等生理参数相关性较差2。
氧梯度变形红细胞计数法提供了一种快速且可重复的镰状化功能检测方法。这是一种体外实验，未考虑内皮表面的影响。然而，该方法能够提供镰状化行为和红细胞特性的功能信息，使其成为镰状细胞病研究中具有前景的技术。该技术未来的应用包括监测镰状细胞病（SCD）患者的治疗效果、作为新治疗策略的生物标志物、研究镰状化行为，以及在SCD患者造血干细胞移植后监测嵌合状态。

在镰状细胞病（SCD）中，单个点突变导致血红蛋白S（HbS）的产生，HbS在脱氧状态下可发生聚合。HbS的聚合引起红细胞（RBC）镰状变形，并降低RBC的变形能力。RBC镰状变形与RBC黏附于内皮细胞共同作用，导致多种SCD并发症，包括血管阻塞性危象（VOC）、中风、器官损伤和慢性溶血性贫血。即使在常氧条件下，SCD患者的RBC变形能力也已受损，而在低氧浓度下该能力进一步下降。在常氧条件下决定RBC变形能力的关键因素包括致密细胞、不可逆镰状细胞（ISC）和脱水细胞，这些细胞均具有降低的表面积与体积比1,2,3。
红细胞变形性测定（ektacytometry）是一种测量红细胞变形性的成熟方法，广泛用于遗传性溶血性贫血的诊断，尤其是膜病4。该方法还可用于血液流变学的研究5,6,7,8,9。渗透梯度红细胞变形性测定通过在渗透压连续变化过程中测量红细胞的变形性，已用于镰状细胞病（SCD）研究十余年10,11。胎儿血红蛋白（HbF）的百分比是抑制HbS聚合的最强因素之一，因为HbF及其混合杂交四聚体（∝2βSγ）均不能进入脱氧HbS的聚合相12。最近的研究表明，在SCD患者中提高HbF水平可改善表面积与体积的比值，从而改善非输血患者的细胞水合状态及红细胞变形性11。
过去，红细胞（RBC）变形性曾被研究作为镰状细胞病（SCD）并发症的生物标志物，但结果存在矛盾。在横断面研究和稳态条件下进行的研究中，发现红细胞变形性较高的个体发生骨坏死和疼痛危象的频率更高13,14,15。与此相反，在纵向研究中，同一患者在急性血管阻塞危象（VOC）期间的红细胞变形性较其稳态水平下降16。这种差异可能是由于在不同条件下（即稳态与VOC期间）研究红细胞变形性所致。VOC发作初期镰状红细胞比例较高，随着危象进展，这些细胞迅速被破坏，这可能解释了稳态横断面发病率数据与VOC期间获得的纵向数据之间的差异。然而，其他因素，例如红细胞亚群与内皮表面的黏附，也可能在VOC的发生中起重要作用。在SCD中，测量红细胞在脱氧过程中的变形性更具临床相关性，因为血管阻塞通常发生在缺氧的后毛细血管小静脉，而不是在缺氧程度较低的微毛细血管网络17。此外，不可逆镰状细胞（ISCs）的存在可能会影响ektacytometer在常氧条件下测量变形性的能力。ISCs在流动过程中排列不齐，导致衍射图案失真，从而干扰测量结果1,2,3。
研究镰状红细胞病血管闭塞危象（VOC）病理生理学的替代方法包括：测量红细胞（RBC）对人工表面的黏附性18、单细胞电学阻抗微流式细胞术19、结合细胞镰变与去镰变定量测量及单细胞流变学的微流控模型20，以及激光诱导聚合技术21。尽管这些方法具有前景，但成本较高、劳动强度大，且需要操作者接受 extensive 的培训。此外，基于形态学的检测方法无法研究细胞在氧浓度梯度变化下的功能行为，例如变形能力。
本研究中，我们描述了一种使用ektacytometer进行的快速且可重复的功能检测方法。这是一种新一代的ektacytometry测量技术，用于检测红细胞（RBC）变形能力在去氧（1,300 秒）和快速复氧（280 秒）过程中以EI表示的不同定性特征。这些时间间隔允许HbS聚合物形成，从而引发形态学变化并随后恢复。去氧过程通过引入氮气实现，氮气缓慢降低ektacytometer的转子与杯壁间隙中血样内的氧张力。在持续测量红细胞变形能力的同时，通过杯壁内置的小型O2-spot传感器每20秒测量一次氧张力。在整个测试过程中，约80次pO2测量值与对应时刻测得的EI值相匹配。去氧阶段氧分压降至20 mmHg以下，复氧则通过环境空气的被动扩散实现。ektacytometer及氧梯度ektacytometry模块的实验装置如图1和图2所示。ektacytometry的原理基于红细胞对激光束的散射作用；当同时施加剪切应力时，会产生椭圆形的衍射图样（图1）。

<table><tbody><tr><td>ADVIA 120 血液分析仪</td><td>Siemens</td><td>067-A004-14</td><td>仪器</td></tr><tr><td>Cell-Dyn Sapphire 血液分析仪</td><td>Abbott</td><td>8H00-01</td><td>仪器</td></tr><tr><td>Lorrca</td><td>RR Mechatronics</td><td>LORC109230 或 LORC109110</td><td>仪器</td></tr><tr><td>Lorrca 软件版本 V5.08</td><td>RR Mechatronics</td><td>-</td><td>软件</td></tr><tr><td>氮气 4.8 或 5.0</td><td>本地供应商</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>O2-spot</td><td>RR Mechatronics</td><td>PO2S020153</td><td>氧气测量</td></tr><tr><td>氧气扫描模块（pO2scan）</td><td>RR Mechatronics</td><td>PO2S109000</td><td>附加组件</td></tr><tr><td>Oxy-ISO</td><td>RR Mechatronics</td><td>QRR 030905</td><td>黏性溶液</td></tr><tr><td>X-Clean</td><td>RR Mechatronics</td><td>QRR 010946</td><td>Lorrca 清洗液</td></tr></tbody></table>

通过氧梯度变形红细胞计在可控自动脱氧过程中表征镰状化特性

Characterization of Sickling During Controlled Automated Deoxygenation with Oxygen Gradient Ektacytometry

在镰状细胞病（SCD）中，编码β-珠蛋白的基因发生单个点突变，导致异常血红蛋白S（HbS）的产生。当HbS脱氧时，可发生聚合，形成刚性的血红蛋白棒状结构，从而引起红细胞（RBC）镰状变形。这些镰状RBC的变形能力显著降低，导致血管阻塞，进而引发多种与SCD相关的临床并发症，包括疼痛、中风和器官损伤。RBC脱水也会降低其变形能力，产生更易发生镰变的致密红细胞。迄今为止，尚无一种广泛可用、快速且可重复的实验室检测方法能够预测疾病严重程度，或直接监测新型非诱导胎儿血红蛋白疗法的治疗效果。在本研究中，我们描述了一种测量RBC变形能力随氧分压（pO2）变化的实验方案，可用于定量评估SCD患者的镰变行为。氧梯度变形指数测定法通过测量RBC在不同pO2下的变形能力（以伸长指数（EI）表示），在一次完整的脱氧和再氧合循环过程中，对RBC施加30 Pa的恒定剪切应力，最终生成六个读数参数。其中，镰变起始点（PoS），定义为最大EI（EImax）下降5%时对应的pO2值，以及脱氧过程中的最小EI（EImin）最具信息价值，分别反映个体患者开始发生镰变时的pO2水平及其红细胞的最低变形能力。PoS与个体患者的血红蛋白对氧的亲和力相关，而EImin则与胎儿血红蛋白水平呈强相关性。我们得出结论：氧梯度变形指数测定法是一种有前景的技术，可用于监测SCD患者的治疗反应，作为临床和临床前试验中抗镰变药物的生物标志物，同时也是研究SCD患者及镰状细胞特征个体红细胞镰变行为的重要工具。

氧梯度变形图谱法可用于表征镰状细胞病（SCD）患者中红细胞的镰变行为。本研究共纳入38例SCD患者和5名健康对照者的血液样本。在健康对照者中，静息状态下衍射图案呈圆形，在较高剪切应力下则变为椭圆形4。根据衍射图案的高度和宽度，可计算伸长指数（EI）。在氧梯度变形图谱法中，通过氮气对样本进行缓慢且持续的去氧处理，随后暴露于空气实现快速复氧。在此条件下，可在去氧过程中观察到红细胞的镰变现象。由于镰变的红细胞在施加的剪切应力下无法正常排列，导致衍射图案发生畸变。因此，与健康红细胞相比，这些细胞表现出更低的变形能力（图2）。
图3A 显示了镰状红细胞在脱氧条件下发生的形态变化，该条件模拟了氧梯度变形性测定过程中的环境，而未进行脱氧处理的对照镰状红细胞则未出现形态改变。此过程导致氧梯度变形性测定时衍射图样发生畸变，从而引起EI值下降。图3B 展示了由此产生的不同衍射图样，从中可提取多种参数。
ektacytometer 获得的代表性曲线如图所示 图3C. 六个参数反映了红细胞镰变行为的不同特征：EI最大 是测量开始前在未脱氧状态下的最大伸展指数（EI）。该参数代表基线位置，反映红细胞总体在空气环境中的整体变形能力。EI分钟 是最小的EI值，代表脱氧后红细胞变形性的最低程度。该参数反映了（镰状）红细胞在脱氧过程中形态和取向的变化。ΔEI是EI之间的差值最大 和 EI分钟，表明在一轮去氧过程中发生镰变的细胞比例。5% 镰变点（PoS）5%) 是 pO2 （mmHg）下，EI 减少 5%最大 在去氧过程中测量，代表镰状化过程开始时的氧张力。面积表示曲线下面积，通过EI与pO的积分计算确定。2 100 mmHg 与 pO 之间的测量值2分钟（mmHg）。这是先前所述参数 EI 的结果最大，EI分钟，以及PoS。恢复度表示复氧末期与基线时EI的差值。两个EI值均在特定pO下测得。2 100–120 mmHg。该参数反映了红细胞在去氧过程中发生镰变后，在重新氧合过程中恢复原有形态的能力。22重复测量的参数通常具有变异系数（CV） &lt;5%（中位数为1.83%）。如果CV &gt; 获得5%时，进行了第三次测量。参数EI最大值 且恢复率的中位数变异系数（CV）最具可重复性 &lt;1%.
健康对照者、HbS性状（杂合子HbS）患者以及纯合子镰状细胞病（SCD）患者的红细胞代表性曲线如图所示 图4AHbSC 患者的代表性曲线显示恢复程度较低，这可能表明存在不同的镰状化过程（图4B). 羟基脲（HU）治疗和输血治疗的HbSS患者代表性曲线如图所示 图4C 和 图4D显然，HS性状（HbAS细胞）的代表性曲线与经输血治疗的HbSS患者红细胞（由纯合子镰状（HbSS）和纯合子正常（HbAA）细胞混合组成）之间存在显著差异。 图4A,D）。未接受治疗的镰状细胞病患者与接受羟基脲和输血治疗的患者之间曲线的明显差异，凸显了该检测方法的实用性（图4C,DHbF 和 HbS 水平与 EI 显著相关分钟 并且在较小程度上与 PoS 相关（图5A–D）。这表明，在患者评估中重要的实验室参数也在氧梯度变形性测定中得到反映。常氧条件下的镰状红细胞数量和高密度红细胞（DRBCs）百分比均影响EImax值，因为它们之间存在显著相关性。图5E–F），这表明EImax反映了镰状化过程中的另一个重要因素。这些结果展示了不同特征（如HbS百分比、HbF百分比、常氧条件下的镰状红细胞、DRBCs百分比）如何影响不同的参数。
<img alt="黏度计装置示意图；EI方程；用于流体黏度测量的激光束、相机和投影。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60213/60213fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1．变形红细胞计的示意图装置。变形红细胞计采用库爱特（Couette）系统对细胞施加剪切应力。通过旋转的外筒（杯）和静止的内筒（转子）产生层流，在37 °C下诱导剪切应力。转子与杯之间有一个微小间隙，血液悬液被注入其中。一束激光从转子穿过血液悬液，并因红细胞（RBCs）的存在而发生散射。衍射图样被投影并由相机分析。通过衍射图样的高度（a）和宽度（b）计算伸长指数（EI）4。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60213/60213fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="血流动力学；带有衍射装置的示意图，显示稀释血液悬液的分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60213/60213fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2．带有氧梯度变形能力测定模块的变形仪示意图。 该模块的示意图显示，通过注入氮气（N2）使血液悬液缓慢脱氧。氧张力通过LED-光纤发送至O2-探针的发光体信号的淬灭程度来测量。在脱氧过程中，镰状红细胞开始镰变，其变形能力下降，并不再与椭圆形红细胞保持一致排列。镰变的红细胞会扭曲衍射图样，使其形状从椭圆形变为菱形或类似钻石的形状。衍射图样形状的这种变化导致EI值降低。pO2和EI的测量不在杯中同一高度进行，这有助于更好地区分脱氧和再氧合曲线，从而更准确地解读曲线。该图已根据Rab等人的研究进行了修改22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60213/60213fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="氧合过程；光谱数据分析；显微镜图像，氧合-脱氧曲线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60213/60213fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3．典型的氧梯度变形指数测定曲线及衍射图样。（A）在类似于氧梯度变形指数测定的条件下进行脱氧处理后，镰状红细胞被固定。在对照组镰状红细胞中，采用相同条件，但不使用氮气。与对照组红细胞相比，脱氧后的镰状红细胞显示出形态变化。（B）在脱氧和剪切应力（30 Pa）作用下，衍射图样由椭圆形变为菱形。（C）氧梯度变形指数测定的典型曲线。最大伸长指数（EImax）表示基线位置，反映总体红细胞群体的整体变形能力。最小EI（EImin）表示最小变形能力，由脱氧过程中红细胞形态和取向改变引起。ΔEI（dEI，EImax与EImin之间的差值）显示在一次脱氧循环中有多少细胞发生镰变。镰变点（PoS，EI下降5%时的pO2）表示首个红细胞开始镰变时的氧张力。曲线下面积（从pO2min = 100 mmHg起计算）以参数“面积”表示，该参数综合了EImax、EImin和PoS的信息。镰变细胞在再氧合过程中恢复能力以参数“恢复率”表示（再氧合期间达到的EImax百分比）。为便于解读，每次独立实验中的所有数据点均用线条连接，以图形方式呈现结果。本图已根据Rab等人的研究进行了修改22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60213/60213fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="镰状细胞平衡氧结合曲线；HbSC、HbSS的图形；实验数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60213/60213fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4。氧梯度变形红细胞测定参数与镰状细胞病（SCD）患者的基因型及治疗方案相关。（A）HbS携带者（HbS性状）和健康对照组的红细胞相对于未经治疗的HbSS患者的代表性图谱。（B）血红蛋白SC病（HbSC）患者红细胞相对于未经治疗的HbSS患者的代表性图谱。（C）接受羟基脲治疗的纯合子SCD患者（HbSS HU）红细胞相对于未经治疗的HbSS患者的代表性图谱。（D）接受输血治疗的HbSS患者（HbSS transfusion）红细胞相对于未经治疗的HbSS患者的代表性图谱。本图已根据Rab等人的研究修改22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60213/60213fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="相关性图：HbF、HbS 与 El、PoS。分析血液参数和线性回归结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60213/60213fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5。氧梯度变形性测量参数与%HbF、%HbS、常氧条件下的镰状细胞百分比以及红细胞密度百分比相关。（A）15例未输血的HbSS或HbS/β-地中海贫血患者最小伸长指数（EImin）与%HbF的线性相关性。（B）EImin与%HbS的线性相关性。（C）PoS与%HbF的线性相关性。（D）PoS与%HbS的线性相关性。（E）最大伸长指数（EImax）与通过数字显微镜测量的常氧条件下镰状细胞百分比的线性相关性。（F）21例HbSS患者EImax与高密度红细胞百分比（%DRBCs）的线性相关性。该图已根据Rab等22修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60213/60213fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>设置</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>文件</td>
			<td>存储目录</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>常规选项</td>
			<td>默认介质黏度</td>
			<td>PVP 黏度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pO₂ 扫描</td>
			<td>最小抽吸时间（s）</td>
			<td>60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pO₂ 扫描剪切应力（Pa）</td>
			<td>30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>每隔（S）测定一次 pO₂</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>移动平均大小</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pO₂ 扫描步进；编辑</td>
			<td>0 -关；60 -开；1360 –关；1640 -关</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>校准区域范围（mmHg）</td>
			<td>10 和 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pO₂ 控制</td>
			<td>关闭（未勾选）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 变形红细胞计的推荐设置。

本文介绍了氧梯度变形性测定法，这是一种快速且可重复的方法，用于在受控去氧和复氧条件下测定镰状细胞病患者样本中红细胞的变形能力。该技术为研究红细胞镰状化以及监测镰状细胞病治疗效果提供了一种手段。

在镰状细胞病（SCD）中，编码β-珠蛋白的基因发生单个点突变，导致异常血红蛋白S（HbS）的产生。当……

氧梯度变形红细胞测定法是一种用于评估个体镰状化倾向的功能性检测方法。迄今为止，尚无其他功能性检测方法可用或被采用。氧梯度变形红细胞测定法能够确定镰状细胞病患者的红细胞开始发生镰状变形时的氧分压。这种氧张力具有患者特异性，可作为疾病严重程度的生物标志物。在镰状细胞病中，该技术可用于监测治疗效果，并可用于新疗法的开发。对该技术进行可视化演示非常重要，因为该技术非常敏感。有许多因素会影响测量结果，而这些因素在您刚开始使用该技术时可能并不知晓。初次尝试该技术的人可能会发现，该技术对样品制备和样品操作极为敏感。我的建议是尽可能采用标准化的操作流程，并逐步建立起稳定的操作习惯。开始此操作前，打开计算机和ektacytometer，并在计算机上启动软件。打开氮气瓶，确保有氮气供应以对样本进行脱氧。将转子降至样品杯中，并确保样品杯能够自由旋转。软件运行时，检查是否出现“确保气体阀门已打开”的提示，然后点击“确定”。确保变形红细胞计开始自检过程，并选择“开始”。如果自检失败，请通过点击“硬件检查”、“pO2”、“自检”重新运行。从左侧列出的不同测试项目中选择“pO2扫描”。在屏幕右侧选择设置，并确保其与文本方案中表一列出的参数一致，每次测量时均需保持相同的设置。通过点击“OK”保存这些设置，然后再次点击“OK”。首先，通过静脉穿刺采集血液样本至含有EDTA的试管中，并将血液在4°C下保存，时间不少于30分钟，但不超过24小时。此后，轻轻颠倒混匀样品以实现均质化。将样品置于滚轴摇床上，使其升至室温后再进行测量。使用血液分析仪进行全血细胞计数检测，将吸样针插入试管中，按下血液分析仪针头后方的按钮开始测量，分析仪将消耗20至200 µL的全血。然后通过计算需加入的样本体积，将全血样本标准化为在5毫升PVP中含有2亿个红细胞。首先，剪去一个移液器吸头的尖端，并通过将血液重悬三次进行预润湿。然后将计算出的样本体积移入PVP小瓶中。轻轻倒置混匀样品，直至均匀。缓慢将两毫升血液与PVP混合物吸入一支三毫升无针注射器中。推动活塞，排出所有可见气泡及过量样品溶液，直至注射器内剩余1.5至1.8毫升。通过连接器将全部样品体积缓慢且均匀地注入转子中。确保样品液面高于氧传感器和小吸孔。在软件中，点击“新建”，并填写样品编号、备注、捐献日期以及PVP的黏度。单击“确定”并开始抽吸。抽吸60秒后，杯体转动，再继续抽吸15秒。当转动停止后，单击“确定”。关闭仪器盖子。单击继续并立即开始，因为氧梯度ektacytometry测量采用固定增益进行。测量完成后，打印报告，报告中将显示由软件自动计算的曲线及参数。请确保原始数据已自动保存至设置中指定的文件夹。首先，取下样品注射器，换上一支装有蒸馏水或去离子水的注射器。按“清洗”键，并在冲洗过程中缓慢地将连接头两端都冲洗干净，确保双向冲洗。接下来，取下注射器并抬起转子。使用软布彻底擦干转子和连接器。然后使用大号注射器冲洗连接器，以去除管路和转子中残留的任何水分。将注射器保持在入口处，并堵住转子的出口，使管路内产生反向压力，从而排出残留的水分。然后干燥杯子，避免触碰氧敏点。放下转子并放好杯子，使仪器准备进行下一次测量。在确保仪器已正确冲洗后，检查确认相应的管道连接至清洗液。关闭软件，按下关闭按钮，然后按下启动按钮以开始每日清洁程序。随后清空废液瓶，并使用柔软的布将转子和杯体擦干。关闭仪器的盖子。关闭氮气瓶并关闭计算机和仪器。氧气梯度变形红细胞计可用于研究红细胞在不同氧浓度条件下的镰变行为。在氧气梯度变形红细胞计检测中，通过氮气持续使样本脱氧，随后由环境空气迅速再氧合。在这些条件下，可在去氧环境中观察到红细胞镰变。这将导致衍射图样发生畸变，因为镰状红细胞在施加的剪切应力下无法正常排列。镰状红细胞在去氧过程中会发生形态改变，类似于氧梯度变形红细胞计中的情况，但在氧合状态下则无形态变化。该过程会导致在氧梯度变形性测定过程中衍射图案发生畸变，从而引起伸长指数下降。变形仪获得的代表性曲线显示了反映镰变行为不同特征的六个参数：最大伸长指数、最小伸长指数、ΔEI、镰变起始点、曲线下面积以及恢复值。此处展示了来自健康对照者、HbS携带者以及纯合子镰状细胞病患者的红细胞的代表性曲线。接受羟基脲和输血治疗的纯合子镰状细胞病患者其代表性曲线存在明显差异，这凸显了该检测方法的实用性。影响氧梯度变形指数测定的因素众多，包括温度、pH值和PVP的渗透压，此外，血液样本溶液中残留的水分以及混合程度也可能影响测量结果。因此，标准化的样本处理至关重要。氧梯度变形性测量的结果可直接应用于临床实践，从而推动个体化医疗的发展。该技术可用于研究镰状细胞行为，以评估镰状细胞病新疗法的潜力，并可作为与临床相关的疾病严重程度生物标志物。

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Research

科研

JoVE Journal

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医学

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磁悬浮结合便携式成像与分析用于疾病诊断

本文介绍了通过ektacytometry测量红细胞变形能力及细胞异质性的技术。这些技术适用于红细胞变形能力的常规研究，以及针对某些血液疾病的特定研究，这些疾病的特点是循环血液中同时存在刚性红细胞和可变形红细胞，例如镰状细胞贫血。...

通过变形性测量和红细胞异质性分析的ektacytometry方法研究血液中的红细胞特性

测量代谢率的变化对于理解多种疾病及衰老进程至关重要。本文介绍了一种测量整个头部耗氧量的新技术，该技术更接近生理状态，可能有助于发现可调节线粒体活性的新型药物。...

测量与解读完整果蝇头部组织的耗氧率

本文提供了一种使用钙离子载体离子霉素诱导红细胞程序性死亡（即红细胞凋亡）的实验方案。通过检测磷脂酰丝氨酸在细胞膜外层的定位来评估红细胞凋亡是否成功。已研究影响该实验方案成功的关键因素，并提供了最佳实验条件。...

使用钙离子载体诱导红细胞凋亡

本方案描述了一种将痰液高效解离为单细胞悬液的方法，以及在标准流式细胞术平台上对细胞亚群进行后续表征的技术。...

通过流式细胞术进行质量控制的痰液分析

本方案描述了利用标准荧光显微镜对球状体的氧合状态和细胞死亡进行多参数分析，从而实现用于生物打印的高通量球状体制备。该方法可用于控制球状体的活力并实现标准化，这对于构建三维组织、肿瘤微环境以及成功进行（微）组织生物制造具有重要意义。...

低成本氧气显微镜辅助的多细胞球体生物制造

我们介绍了一种基于近红外扩散光学的多模态设备，用于无创、连续测量微血管的绝对血流指数和血氧饱和度。随后，通过血管阻断试验评估氧消耗的代谢率和反应性充血。...

用于重症监护的混合近红外漫射光学光谱无创监测微血管血氧及反应性充血

我们介绍一种用于测量视网膜色素上皮（RPE）细胞培养中耗氧率（OCR）的新型装置。该装置可在标准细胞培养板上使用标准培养基，在标准细胞培养箱中连续数周对RPE细胞进行OCR测量。...

高度分化且极化的视网膜色素上皮细胞培养物中耗氧率的长期监测

本文介绍了一种用于评估癌症和伤口愈合的临床前模型的氧敏感动态对比增强光声成像（OS-DCE OAI）方案。OS OAI 可对氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白进行成像，从而绘制组织氧合图；DCE-OAI...

利用OS-DCE OAI在癌症和伤口愈合的临床前模型中评估氧合与血管灌注

学习氧梯度激光衍射法测定镰状细胞病患者红细胞变形能力的技术。该方法可在受控脱氧和再氧合条件下评估镰状行为，为疾病严重程度和治疗效果提供生物标志物。

通过氧梯度变形红细胞计在可控自动脱氧过程中表征镰状化特性

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