胶质母细胞瘤中功能相关miRNA的表征及其在基因治疗中的人工簇构建

该方案能够在真核细胞中同时调控多种微小RNA（micro RNA），其基于一种极为简单且灵活的方法，最大限度地减少了分子克隆步骤。该技术对于体外研究微小RNA的功能相互作用具有重要意义，但更重要的是，它为更有效地将微小RNA应用于治疗提供了平台。我们主要在脑癌研究背景下开发并应用了该方法，但它同样适用于任何涉及多个基因表达改变的疾病。

我们已在其他模型（如乳腺癌和甲状腺癌细胞系）中测试了人工转录基因，结果表明该技术具有可重复性。本实验方案中，具备生物信息学和microRNA生物学的基础知识会有所帮助，但并非必需。采用生物信息学方法对于确定相关的microRNA组合以及TRK-11至关重要，而熟悉microRNA的加工过程则有助于理解这些不同的microRNA如何被组装成人工DNA簇，并在稳定转染至特定细胞后成功加工。

为包被培养皿，首先将聚-D-赖氨酸溶于水，配制成浓度为 100 微克/毫升的溶液。按每 25 平方厘米表面积加入 1 毫升溶液的量，将溶液倒入培养皿中。轻轻旋转培养皿，确保溶液完全覆盖整个皿面。

六小时后吸除聚-D-赖氨酸溶液，并用 PBS 洗涤两次。以每五毫升培养基接种100,000个细胞的密度接种人神经干细胞，培养基可选用干细胞培养基、星形胶质细胞分化培养基或神经元分化培养基。细胞接种后，将培养皿置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中培养一周，随后根据文章所述方法进行微小RNA表达分析。

培养GBM-34胶质母细胞瘤干细胞样细胞时，取1 × 10⁵个细胞接种于25 cm²低吸附培养瓶中，加入5 mL神经基础培养基。将培养瓶置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中。接种48小时后，每隔7天添加双倍浓度的DNA烷基化剂替莫唑胺。

首先，在5毫升培养基中加入5微摩尔的替莫唑胺（TMZ），持续处理5天。5天后，移除培养基，并更换为不含替莫唑胺的新鲜培养基，使存活的细胞恢复生长。48小时后，加入10微摩尔的替莫唑胺，继续孵育5天。

重复给予双倍浓度的替莫唑胺处理，直至浓度达到至少100微摩尔并使细胞对该药物产生耐药性。诱导耐药性后，使用1毫升裂解试剂裂解细胞。提取总RNA，并根据论文所述方法分析特定microRNA的表达水平。

为了获得先前定义的每种micro RNA的预测靶基因组，请使用micro RNA靶向预测工具。在TargetScan的首页，从预填充的下拉菜单中选择感兴趣的micro RNA，然后点击提交按钮。

使用下载表格链接将获得的目标列表以电子表格形式下载。为了降低假阳性预测的可能性，在保守位点列及后续分析中仅包含位于保守位点内的目标。通过使用其他 microRNA 预测程序可进一步提高筛选严格性，且仅包含所有算法共同识别的目标。

然后，打开 ToppGene 工具套件 20。为了评估各 micro RNA 共享通路的富集情况，在训练基因集窗口中粘贴之前获得的靶基因列表，并在输入类型中选择 HGNC Symbol。

单击提交并开始。该程序将提供一个输出表格，显示所输入基因列表中最显著的 GO 分类。为了最终确定每个微小 RNA 对共同通路或细胞过程调控的贡献，请打开生物信息学与进化基因组学网站提供的维恩图功能。

将每个获得的靶基因组与参与特定细胞过程的全部基因列表进行比对。如果所关注的每个微小RNA（microRNA）的靶信使RNA（mRNA）均位于相应的窗口中，则上传或复制粘贴该列表。为每个列表命名一个唯一的标识符。

单击提交。该程序将提供一个维恩图的可视化输出，图中每个区域均标有基因数量，同时提供每个子集及交集组合的全部信使RNA列表。为了将选定的微小RNA（micro RNA）组合成功能性的反式基因，需基于miR-17-92基因簇位点获取转基因骨架。

从基因组浏览器中获取核苷酸序列。选择包含该位点全部六个编码的微小RNA发夹结构的大约800个碱基对的核心序列，并在核心序列的上下游各保留至少200个核苷酸的侧翼序列。将该序列粘贴至任意文字编辑程序中。

通过从 miR base 中检索，确定六个天然发夹结构各自的序列。在先前已鉴定的核心序列范围内，标记出这些序列中的每一个。每个发夹结构之间的任何序列均代表间隔序列。

接下来，从 miRBase 获取拟在转基因中过表达的 microRNA 的发夹序列。仔细记录位于 microprocessor 切割位点的特定核苷酸。将内源发夹序列从核心序列中删除，仅保留每个发夹5'端和3'端的三至五个核苷酸，这些核苷酸将作为新发夹序列的接合位点。

将所需 micro RNA 的发夹序列粘贴至先前删除的发夹位置。在转基因序列两侧的侧翼区域添加所需的限制性酶切序列，以便将其亚克隆至选定的递送载体中。验证所选的限制性酶切序列在序列内部不存在。

为了验证转基因的二维结构，将完整的转基因序列复制到RNA结构预测软件RNA Webfold中。选择标准程序设置，然后点击继续。分析图形输出结果，特别关注是否存在结构明确的发夹结构，且其双链茎区应位于microprocessor切割位点上游至少11个核苷酸处。

此外，需检查发夹序列内部是否存在分支点。至此，该转基因已可进行基因合成，并克隆至目标递送载体中。该方法实现了对三个在脑肿瘤中持续下调的微小RNA模块的表征，这些微小RNA在神经元分化过程中特异性共表达。

在基因毒性应激过程中，microRNA 模块的共表达模式得到验证，并提示这三种 microRNA 之间存在强烈的协同作用。所设计的转基因能够同时在体外和体内重现这三种 microRNA 在胶质母细胞瘤细胞中的表达，显著干扰肿瘤生物学行为，并展现出良好的转化应用前景。此外，该转基因簇在乳腺癌模型中也具有功能活性。

本方案的关键要求是保持转基因中蛋白酶切割位点的原始大小，并确保嵌合微小 RNA 发夹的茎环结构得以保留。通过该方法，我们可将多个具有生物学活性的微小 RNA 基因浓缩为非常短的 DNA 序列，这些序列几乎可直接体外装入任何用于基因治疗的递送载体中。

该方法适用于研究不同微小RNA之间的功能相互作用，并干预复杂的多因素细胞通路，而这些通路若采用药物干预则通常需要多种药物组合。