Name: 胶质母细胞瘤中功能相关miRNA的特性及其工程在基因治疗的人工簇中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 了解人工miRNA簇工程化方法，用于胶质母细胞瘤基因治疗。该技术可同时调控多个微小RNA，简化分子克隆步骤，为脑癌等疾病提供灵活的治疗平台。

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作者谨向Harvey Cushing神经肿瘤学实验室的成员致以感谢，感谢他们的支持与建设性批评。本研究工作由NINDS基金K12NS80223和K08NS101091资助，项目负责人：P. P.

1. 胶质母细胞瘤中功能相关miRNA的表征
<ol>
	<li>胶质母细胞瘤与正常脑组织间差异性 miRNA 表达的广谱分析
	<ol>
		<li>首先，确定在肿瘤中表达显著失调的 miRNA。可通过至少以下三种方法实现：
		<ol>
			<li>在 https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga 获取癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas）中的测序数据11。</li>
			<li>利用新鲜手术标本进行微阵列分析12。</li>
			<li>使用已发表的数据集13。 
			注意：无论选择哪种方法，其输出结果均提供一组在统计学上与肿瘤生物学显著相关（正相关或负相关）的 miRNA。该初始 miRNA 集合构成进一步分析的基础，通过更动态的表达变化分析，从中识别出功能关联最为严格的 miRNA 子集，如下文所述。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>条件特异性 miRNA 表达分析
	<ol>
		<li>诱导细胞分化：
		<ol>
			<li>使用预先包被多聚-D-赖氨酸（PDL）的塑料培养皿，以促进单层细胞培养的形成。包被时，将 PDL 溶于水，配制成 100 µg/mL 的浓度，每 25 cm2 表面使用 1 mL 溶液。PDL 溶液加入后 6 小时，用 PBS 洗涤 2 次。</li>
			<li>将人神经干细胞以等量（100,000 个细胞/5 mL）接种于干细胞培养基（Neurobasal 培养基 + B27 添加剂 + 20 ng/mL EGF/FGF）、星形胶质细胞分化培养基（DMEM + 10% FBS）或神经元分化培养基（Neurobasal 培养基 + B27 添加剂 + 2 µM 视黄酸）中14。少突胶质细胞分化的方案要求在去除 EGF/FGF 后添加 IGF-1（200 ng/mL）14,15。</li>
			<li>细胞接种后，置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 1 周。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>RNA 提取：
		<ol>
			<li>7 天后，将细胞从培养箱中取出，弃去培养基。</li>
			<li>用 PBS（5 mL）洗涤细胞，然后加入 1 mL 裂解试剂（参见 材料表）裂解细胞，并用细胞刮刀将细胞刮入 1.5 mL 微离心管中。将含有裂解细胞的管子在室温（RT）下静置 5 分钟。</li>
			<li>按照制造商说明书进行总 RNA 的提取。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>miRNA 表达分析：
		<ol>
			<li>通过实时 PCR，使用 TaqMan 探针并遵循制造商的逆转录和 PCR 扩增方案，定量分析在步骤 1.1 中鉴定出的特定 miRNA 在三种分化模式中的差异表达（图 1）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过应激特异性挑战验证 miRNA 簇
	<ol>
		<li>在 Neurobasal 培养基 + B27 添加剂 + 20 ng/mL EGF/FGF 中培养 G34 胶质母细胞瘤干细胞样细胞。起始接种 1 × 106 个细胞于 5 mL 培养基中，置于 25 cm2 的低吸附培养瓶中。</li>
		<li>接种后 48 小时开始，每隔 5 天以倍增浓度添加 DNA 烷基化剂替莫唑胺（TMZ），具体如下：
		<ol>
			<li>起始浓度为 5 µM，作用 5 天。5 天后弃去培养基，更换为不含替莫唑胺的新鲜培养基，使存活细胞恢复。48 小时后，加入 10 µM TMZ，继续孵育 5 天。</li>
			<li>重复步骤 1.3.2.1，每次将 TMZ 浓度倍增，直至浓度达到至少 100 µM 且细胞对该药物产生耐药性10。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在平行实验中，对 G34 细胞进行照射，方法如下：
		<ol>
			<li>将 1 × 106 个细胞接种于 5 mL 培养基中，置于 25 cm2 低吸附培养瓶中，接种后 48 小时开始，以 2 Gy 能量照射细胞（任何可提供光子辐射的照射设备均可）。照射后将细胞放回培养箱，避免扰动。48 小时后，再次以额外 2 Gy 能量照射细胞。</li>
			<li>重复步骤 1.3.3.1 共 4 次，累计照射总能量达 10 Gy。</li>
			<li>照射结束后将细胞放回培养箱，在新鲜培养基中恢复至少 5 天，再进行后续分析。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>诱导耐药性后，使用裂解试剂裂解细胞，并根据制造商说明书提取总 RNA。</li>
		<li>按照步骤 1.2.1 所述方法，分析在第 1.1–1.2 节中鉴定出的特定 miRNA 的表达情况（图 2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚类 miRNA 功能汇聚的表征
	<ol>
		<li>利用 miRNA 靶标预测工具，获取在第 1.2–1.3 节中确定的各 miRNA 的预测靶基因组。 
		注意：我们通常使用 TargetScan，因其算法会定期更新16。其他可用的预测工具包括 miRanda17、miRDB18 和 DIANA-miRPath19。这些程序均为免费的基于网页的应用。
		<ol>
			<li>在 TargetScan 首页，从预填充的下拉菜单中选择感兴趣的 miRNA，点击 提交 按钮。</li>
			<li>通过 下载表格 链接下载得到的靶基因列表为电子表格格式（补充图 1）。</li>
			<li>为降低假阳性预测的可能性，在后续分析中仅包含保守位点列中的靶基因。此外，可通过使用其他 miRNA 预测程序（见上文）并仅保留所有算法共同预测的靶基因，进一步提高筛选的严格性。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用 ToppGene Suite20 根据基因本体（Gene Ontology）分类对所得靶基因组进行分类，以评估各 miRNA 共同富集的通路。
		<ol>
			<li>将步骤 1.4.1 得到的靶基因列表粘贴至 &#34;训练基因集&#34; 窗口中，输入类型选择 HGNC 符号。点击 提交 &#62; 开始。程序将输出一个表格，显示所输入基因列表中最显著的 &#34;GO&#34; 分类（补充图 2）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>最终为确定每个 miRNA 对共同通路或细胞过程（本例中为染色质调控）的调控贡献，使用 Bioinformatics and Evolutionary Genomics 网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn）提供的维恩图（Venn diagram）功能，将步骤 1.4.1 中获得的每个靶基因组与参与该特定细胞过程（即染色质调控）的全部基因列表进行比对。 
		注意：该程序可同时分析多个组的交集（图 3）。每个 miRNA 提供的特异性唯一靶基因随后将被注释，并用于后续功能实验。
		<ol>
			<li>在程序首页，上传或复制粘贴每个感兴趣 miRNA 的靶 mRNA 列表至相应窗口中，并为每个列表命名唯一标识符。</li>
			<li>点击 提交。程序将生成一个可视化维恩图，显示各区域的基因数量，同时提供每个子集及交集组合的完整 mRNA 列表。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 将miRNA模块组装成多顺反子转基因簇
<ol>
	<li>基于miR-17-92簇位点的转基因载体构建
	<ol>
		<li>从 Ensembl 基因组浏览器获取 miR-17-92 基因簇的核苷酸序列21选择约800个碱基对 &#34;核心&#34; 包含该位点全部六个编码 miRNA 发夹结构的序列，以及核心序列上游（5'）和下游（3'）各至少 200 个核苷酸的侧翼序列。</li>
		<li>将上述序列粘贴到任意文字编辑程序中。</li>
		<li>通过在miRBase中检索，确定六个天然发夹结构的序列22在先前已确定的范围内标记每一段序列 &#34;核心&#34; 序列。每个发夹结构之间的任何序列均代表间隔序列，这些间隔序列对于转基因的正确加工至关重要。</li>
		<li>移除天然发夹序列 &#34;核心&#34; 序列，但每个发夹结构的5'和3'末端各有3-5个核苷酸除外，这些核苷酸将作为新发夹结构的接合区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建编码多种选定miRNA的新转基因
	<ol>
		<li>从 miRBase 获取拟在转基因中过表达的 miRNA 的发夹序列。仔细记录微处理器切割位点的特定核苷酸。</li>
		<li>用步骤 2.2.1 中获得的所需 miRNA 的发夹序列替换已移除的发夹序列（步骤 2.1.4）。</li>
		<li>在转基因序列两侧的侧翼区域添加所需的限制性酶切位点，以方便将其亚克隆至选定的递送载体中。验证所选的限制性酶切位点在转基因序列内部不存在。</li>
		<li>对于阴性对照，使用20个核苷酸的随机序列替换每种成熟miRNA的天然20个核苷酸序列。可利用在线工具（如 https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence）生成这些随机序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>验证转基因的二维结构
	<ol>
		<li>将完整的转基因序列复制到RNA结构预测软件RNAweb Fold中23.</li>
		<li>使用标准程序设置，点击 继续.</li>
		<li>分析图形输出结果，特别关注是否存在结构明确的发夹结构，以及在微处理器切割位点近端至少11个核苷酸处是否存在双链茎结构。同时，检查发夹序列内部是否存在分支点图4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过DNA合成获取转基因
<ol>
	<li>在嵌合miRNA簇的设计及计算机模拟验证完成后，通过商业供应商的DNA合成服务获取工作序列24 并进行下游克隆至载体及转基因递送。我们已采用慢病毒载体进行体外递送10 以及用于体内颅内递送的腺相关病毒（AAVs）25.</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案基于以下理念：miRNA并非孤立发挥作用，而是在特定细胞环境中通过成组协作实现其生物学功能，这些miRNA组的表达由特定的转录调控机制决定26。为了从转化医学角度证明该策略的合理性，本文介绍了一项后续实验方案，可用于在细胞或组织中重建这种多miRNA表达模式。该方法利用了miRNA相对简单的生物合成过程：只要miRNA发夹结构被微处理器复合物（microprocessor）识别，即足以启动正确的miRNA加工过程27。这一最低结构要求使得研究人员能够利用天然存在的miRNA基因簇的遗传骨架作为载体，表达目标miRNA模块。这些模块可被包含在较短的DNA序列中，并可插入任意选择的递送载体。本方案的主要要求是维持发夹结构的完整性以及茎环部分具有足够的长度，以确保适当的切割加工。
在执行本方案时，有两个主要的关键注意事项。第一点是准确确定最佳的miRNA组合。这需要仔细分析细胞或组织与对照相比的miRNA表达特征，以及在实验操作过程中观察到的任何同时发生的表达变化。一旦确定了一组miRN...

miRNA 为多种疾病的广谱基因治疗策略开发提供了无与伦比的机遇1,2,3，包括癌症4,5。这一前景基于这些生物分子的若干独特特性，如分子量小6、生物合成过程简单7，以及天然倾向于协同发挥作用8。许多疾病均表现出特定的 miRNA 表达模式，这些模式通常共同调控复杂的生物学功能9。本方法的首要目标是建立一种策略，用于鉴定在特定细胞功能中具有协同作用的 miRNA 群组；进而为后续研究与应用中重建此类 miRNA 组合提供可行方案。
该方法能够同时对多个miRNA进行功能分析，利用它们对大量mRNA的协同靶向作用，从而重现疾病的复杂分子图景。最近，该方法已被用于鉴定一组三个miRNA，它们：1）在脑癌中同时呈下调表达；2）在神经分化过程以及辐射或DNA烷基化试剂引起的基因毒性应激反应中，表现出强烈的共表达模式。通过下文所述的聚类方法，对这三个miRNA组成的模块进行联合再表达，可显著干扰癌细胞的生物学行为，并可便捷地作为基因治疗策略用于临床前研究10。本实验方案对于从事miRNA研究及其转化应用的研究人员可能具有特别意义。

<table><tbody><tr><td>0.4% 低熔点琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70058</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;M 无菌滤器单元</td><td>默克密理博</td><td>SLH033RS</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微型离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>6孔板&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>裸鼠（FoxN1 nu/nu）</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td></td></tr><tr><td>B-27 补充剂&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀，16 cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>铯-137辐照仪&amp;nbsp;</td><td>JL Sheperd and Associates</td><td>核心设施（哈佛医学院）</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439142-4L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，丙酮酸钠&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>伊红Y溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>ATCC CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>苏木精溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1051750500</td><td></td></tr><tr><td>人原代胶质瘤干细胞样细胞（GBM62）</td><td></td><td></td><td>由 E. A. Chiocca 博士提供（Brigham and Women&amp;rsquo;波士顿，马萨诸塞州，s 医院</td></tr><tr><td>人原代胶质瘤干细胞样细胞（MGG4）</td><td></td><td></td><td>由美国马萨诸塞州波士顿市麻省总医院 Hiroaki Wakimoto 博士提供</td></tr><tr><td>慢病毒载体 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td><td>System Biosciences</td><td>CD511B-1</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>带制冷功能的微型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>型号 5424 R，货号 5404000138</td><td></td></tr><tr><td>封片剂&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4112APG</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 高速聚碳酸酯圆底离心管&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>神经前体细胞（NPC）</td><td></td><td></td><td>由 Jakub Godlewski 博士提供（Brigham and Women&amp;rsquo;波士顿，马萨诸塞州，s 医院</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>尼康Eclipse Ti电动荧光显微镜系统</td><td>日本尼康</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>PCR管&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6571-960EA</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>94/16 培养皿&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>重组人表皮生长因子&amp;nbsp;</td><td>PeproTech&amp;nbsp;</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子&amp;nbsp;</td><td>PeproTech&amp;nbsp;</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Gibco</td><td>12587-010&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNA小量制备试剂盒</td><td>Direct-zol</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>S1000型热循环仪&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>小型动物影像引导微型照射器&amp;nbsp;</td><td>Xstrahl Life Sciences，英国</td><td>核心设施（美国波士顿达纳—法伯癌症研究所）</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX+ 超速离心机&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>75000100</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>StepOne 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>应用生物系统公司&amp;nbsp;</td><td>4376357</td><td></td></tr><tr><td>SterilGARD 生物安全柜&amp;nbsp;</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>T98-G</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>ATCC CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>Temozolomide</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek最佳切割温度&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9636948</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol试剂&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15596026</td><td>裂解试剂</td></tr><tr><td>U251-MG</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>ATCC HTB-17</td><td></td></tr><tr><td>U87-MG&amp;nbsp;</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>ATCC HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>ViraPower 慢病毒表达系统&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>K4970-00</td><td></td></tr><tr><td>水，HPLC 级</td><td>Fisher</td><td>W54</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

胶质母细胞瘤中功能相关mirna的表征及其在基因治疗中的人工簇构建

Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

microRNA（miRNA）在健康与疾病中的生物学意义主要依赖于多种同时失调的miRNA所形成的特定组合，而非单个miRNA的作用。鉴定这些特定的miRNA模块是充分发挥其治疗潜力的关键步骤。这一点极为重要，因为miRNA的组合特性在实际应用中具有可操作性。本文描述了一种用于定义特定miRNA特征的方法，该特征与胶质母细胞瘤中癌性染色质抑制因子的调控相关。该方法首先确定在肿瘤组织与正常组织相比时发生失调的一组普遍miRNA；随后通过不同培养条件进一步细化分析，明确在特定细胞状态下共表达的miRNA亚群。最后，将满足上述筛选条件的miRNA组合成一种人工多顺反子转基因结构，该结构基于天然存在的miRNA基因簇骨架构建，用于在受体细胞中过表达这些miRNA模块。

该方法实现了对一组由三个miRNA组成的模块的表征，这些miRNA在脑肿瘤中持续下调，且仅在神经元分化过程中特异性共表达（图1），并参与治疗后肿瘤的存活应答（图2）。其作用机制是通过调控一条复杂的致癌性染色质抑制通路实现的。这种共表达模式提示这三个miRNA之间存在强烈的协同活性（图3）。因此，利用miRNA分子小且生物合成简单的特性，本实验方案的第二部分被用于设计一种转基因结构（图4），可在体外和体内同时在胶质母细胞瘤细胞中重现这三个miRNA的表达，对肿瘤生物学行为产生显著干扰，并展现出良好的转化应用前景（图5A,B,C）10。此外，研究还证实该转基因簇在乳腺癌模型中同样具有功能活性（<str...

本文介绍了一种用于表征具有生物学协同作用的miRNA模块及其组装成短转录子的方法，该方法可实现基因治疗应用中的同时过表达。

胶质母细胞瘤中功能相关miRNA的表征及其在基因治疗中的人工簇构建

microRNAs（miRNAs）在健康与疾病中的生物学意义在很大程度上依赖于多种同时失调的miRNA所形成的特定组合……

该方案能够在真核细胞中同时调控多种微小RNA（micro RNA），其基于一种极为简单且灵活的方法，最大限度地减少了分子克隆步骤。该技术对于体外研究微小RNA的功能相互作用具有重要意义，但更重要的是，它为更有效地将微小RNA应用于治疗提供了平台。我们主要在脑癌研究背景下开发并应用了该方法，但它同样适用于任何涉及多个基因表达改变的疾病。我们已在其他模型（如乳腺癌和甲状腺癌细胞系）中测试了人工转录基因，结果表明该技术具有可重复性。本实验方案中，具备生物信息学和microRNA生物学的基础知识会有所帮助，但并非必需。采用生物信息学方法对于确定相关的microRNA组合以及TRK-11至关重要，而熟悉microRNA的加工过程则有助于理解这些不同的microRNA如何被组装成人工DNA簇，并在稳定转染至特定细胞后成功加工。为包被培养皿，首先将聚-D-赖氨酸溶于水，配制成浓度为 100 微克/毫升的溶液。按每 25 平方厘米表面积加入 1 毫升溶液的量，将溶液倒入培养皿中。轻轻旋转培养皿，确保溶液完全覆盖整个皿面。六小时后吸除聚-D-赖氨酸溶液，并用 PBS 洗涤两次。以每五毫升培养基接种100,000个细胞的密度接种人神经干细胞，培养基可选用干细胞培养基、星形胶质细胞分化培养基或神经元分化培养基。细胞接种后，将培养皿置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中培养一周，随后根据文章所述方法进行微小RNA表达分析。培养GBM-34胶质母细胞瘤干细胞样细胞时，取1 × 10⁵个细胞接种于25 cm²低吸附培养瓶中，加入5 mL神经基础培养基。将培养瓶置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中。接种48小时后，每隔7天添加双倍浓度的DNA烷基化剂替莫唑胺。首先，在5毫升培养基中加入5微摩尔的替莫唑胺（TMZ），持续处理5天。5天后，移除培养基，并更换为不含替莫唑胺的新鲜培养基，使存活的细胞恢复生长。48小时后，加入10微摩尔的替莫唑胺，继续孵育5天。重复给予双倍浓度的替莫唑胺处理，直至浓度达到至少100微摩尔并使细胞对该药物产生耐药性。诱导耐药性后，使用1毫升裂解试剂裂解细胞。提取总RNA，并根据论文所述方法分析特定microRNA的表达水平。为了获得先前定义的每种micro RNA的预测靶基因组，请使用micro RNA靶向预测工具。在TargetScan的首页，从预填充的下拉菜单中选择感兴趣的micro RNA，然后点击提交按钮。使用下载表格链接将获得的目标列表以电子表格形式下载。为了降低假阳性预测的可能性，在保守位点列及后续分析中仅包含位于保守位点内的目标。通过使用其他 microRNA 预测程序可进一步提高筛选严格性，且仅包含所有算法共同识别的目标。然后，打开 ToppGene 工具套件 20。为了评估各 micro RNA 共享通路的富集情况，在训练基因集窗口中粘贴之前获得的靶基因列表，并在输入类型中选择 HGNC Symbol。单击提交并开始。该程序将提供一个输出表格，显示所输入基因列表中最显著的 GO 分类。为了最终确定每个微小 RNA 对共同通路或细胞过程调控的贡献，请打开生物信息学与进化基因组学网站提供的维恩图功能。将每个获得的靶基因组与参与特定细胞过程的全部基因列表进行比对。如果所关注的每个微小RNA（microRNA）的靶信使RNA（mRNA）均位于相应的窗口中，则上传或复制粘贴该列表。为每个列表命名一个唯一的标识符。单击提交。该程序将提供一个维恩图的可视化输出，图中每个区域均标有基因数量，同时提供每个子集及交集组合的全部信使RNA列表。为了将选定的微小RNA（micro RNA）组合成功能性的反式基因，需基于miR-17-92基因簇位点获取转基因骨架。从基因组浏览器中获取核苷酸序列。选择包含该位点全部六个编码的微小RNA发夹结构的大约800个碱基对的核心序列，并在核心序列的上下游各保留至少200个核苷酸的侧翼序列。将该序列粘贴至任意文字编辑程序中。通过从 miR base 中检索，确定六个天然发夹结构各自的序列。在先前已鉴定的核心序列范围内，标记出这些序列中的每一个。每个发夹结构之间的任何序列均代表间隔序列。接下来，从 miRBase 获取拟在转基因中过表达的 microRNA 的发夹序列。仔细记录位于 microprocessor 切割位点的特定核苷酸。将内源发夹序列从核心序列中删除，仅保留每个发夹5'端和3'端的三至五个核苷酸，这些核苷酸将作为新发夹序列的接合位点。将所需 micro RNA 的发夹序列粘贴至先前删除的发夹位置。在转基因序列两侧的侧翼区域添加所需的限制性酶切序列，以便将其亚克隆至选定的递送载体中。验证所选的限制性酶切序列在序列内部不存在。为了验证转基因的二维结构，将完整的转基因序列复制到RNA结构预测软件RNA Webfold中。选择标准程序设置，然后点击继续。分析图形输出结果，特别关注是否存在结构明确的发夹结构，且其双链茎区应位于microprocessor切割位点上游至少11个核苷酸处。此外，需检查发夹序列内部是否存在分支点。至此，该转基因已可进行基因合成，并克隆至目标递送载体中。该方法实现了对三个在脑肿瘤中持续下调的微小RNA模块的表征，这些微小RNA在神经元分化过程中特异性共表达。在基因毒性应激过程中，microRNA 模块的共表达模式得到验证，并提示这三种 microRNA 之间存在强烈的协同作用。所设计的转基因能够同时在体外和体内重现这三种 microRNA 在胶质母细胞瘤细胞中的表达，显著干扰肿瘤生物学行为，并展现出良好的转化应用前景。此外，该转基因簇在乳腺癌模型中也具有功能活性。本方案的关键要求是保持转基因中蛋白酶切割位点的原始大小，并确保嵌合微小 RNA 发夹的茎环结构得以保留。通过该方法，我们可将多个具有生物学活性的微小 RNA 基因浓缩为非常短的 DNA 序列，这些序列几乎可直接体外装入任何用于基因治疗的递送载体中。该方法适用于研究不同微小RNA之间的功能相互作用，并干预复杂的多因素细胞通路，而这些通路若采用药物干预则通常需要多种药物组合。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

胶质母细胞瘤中功能相关miRNA的特性及其工程在基因治疗的人工簇中

本文介绍了一种高效且用途广泛的方案，通过将转座子DNA注射到新生小鼠的脑室内，诱导、监测和分析新型胶质母细胞瘤（GBM）。位于脑室下区的细胞摄取质粒后发生转化、增殖，并形成具有人类GBM组织病理学特征的肿瘤。...

转座子介导的质粒DNA整合至新生小鼠侧脑室下区以构建新型胶质母细胞瘤模型

microRNA 在大脑中发挥着关键作用，并且是神经退行性疾病建模的潜在靶点。然而，由于 microRNA...

一种用于脑部特异性敲低miRNA的简单替代性立体定位注射方法

以三维培养方式生长的神经球是研究胶质瘤生物学的有力工具。本文介绍了一种在通过石蜡包埋保持胶质瘤神经球三维结构的前提下进行免疫组织化学分析的实验方案。该方法可用于表征胶质瘤神经球的特性，如干性及神经分化能力。...

通过石蜡包埋的三维胶质瘤神经球培养物免疫组织化学评估胶质瘤生物标志物

miRNA 治疗在调控癌症进展方面具有重要意义。本文展示了用于鉴定联合 miRNA...

联合miRNA治疗调控细胞周期与血管生成的分析

本实验方案采用基于探针的实时聚合酶链式反应（PCR）、磺酰罗丹明B（SRB）检测、3’非翻译区（3’...

一种体外评估肿瘤细胞中microRNA水平、功能及相关靶基因的实验方案

激光显微切割（LMD）是一种灵敏且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和侵袭性的分子通路。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，通过激光显微切割从胶质瘤组织中分离特定区域，并随后进行转录组学分析。...

激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

蛋白质组失调在弥漫性浸润性胶质瘤的扩散过程中起着重要作用，但仍有多种相关蛋白质尚未被鉴定。数字空间分析技术（DSP）为高效、高通量地表征可能参与浸润性胶质瘤侵袭与迁移的候选蛋白质的差异表达提供了一种有效方法。...

用于表征成人型弥漫性浸润性胶质瘤微环境的数字空间分析

本方案描述了一种高通量的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）基因编辑工作流程，用于微小RNA（miRNA）簇网络分析，可在单次实验中快速构建一系列基因修饰的细胞系，这些细胞系携带不同miRNA簇成员的特异性缺失组合，缺失片段长度可达35...

用于微小RNA簇网络分析的CRISPR基因编辑工具

血脑屏障是胶质母细胞瘤治疗药物递送的重大障碍，而该疾病目前尚无治愈手段。本文报道了一种体内成像引导的氧化铁治疗性纳米平台，该平台凭借其尺寸可绕过这一生理屏障，并在肿瘤部位富集。...

纳米颗粒递送寡核苷酸载荷在多形性胶质母细胞瘤动物模型中的应用

本方案描述了一种串联免疫荧光杂交检测法，利用甲醛固定石蜡包埋组织同时检测并定量 microRNA...

通过锁核酸进行微小RNA的扩增与识别 原位 杂交作为一种新型检测与定量方法

了解人工miRNA簇工程化方法，用于胶质母细胞瘤基因治疗。该技术可同时调控多个微小RNA，简化分子克隆步骤，为脑癌等疾病提供灵活的治疗平台。

胶质母细胞瘤中功能相关miRNA的表征及其在基因治疗中的人工簇构建

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