可视化和分析星形细胞中细胞内器官和其他货物的细胞内传输

在这里，我们描述了一种体外活成像方法，用于可视化细胞器的细胞内传输和在小鼠星形细胞中贩运血浆膜蛋白。该协议还提出了一种图像分析方法，以确定货物运输路线和动力学。

我们的协议可用于研究在受控的细胞外环境和轻度疾病状态下星形细胞器或蛋白质的动能和定位。与提供蛋白质和细胞器定位单一快照的MHA固定制剂不同，我们的实时成像技术可用于分析单个活星细胞的粒子动力学。转染种子星核细胞在转染后24至48小时进行成像的适当密度的第二天。

稀释血清介质中的唇部分离试剂，以适当的实验浓度。在250微升的血清介质中稀释5微克高纯度DNA，并在管中加入5微升的唇部增强剂试剂。将唇部分液试剂与同等体积的DNA唇部切除增强剂混合，在室温下孵育溶液15分钟。

在孵育结束时，从星细胞培养物中去除上经剂，并将100微升的转染混合物滴投到细胞中。在37摄氏度和5%的二氧化碳下6小时后，用适当体积的星细胞培养基基物取代转染复合物，将细胞返回细胞培养箱24至72小时。成像前30分钟，在200微升星细胞培养培养基中稀释合适的利索体标记探针，以1微摩尔的工作浓度，在37摄氏度下用探针对星细胞进行30分钟的标记。

然后用温暖的星细胞培养介质洗一次细胞，用成像介质代替洗涤。在探针标记后，立即将星细胞培养容器放入显微镜舞台上的适当适配器，并使用 EBI 荧光光，定位表达荧光蛋白或探针的细胞。使用数码相机调整荧光样品照明以可视化所选单元格，并调整焦点并放大到单个单元格。

然后使用缩放和确定焦点函数以每两秒一帧的频率获取单个 Z 堆栈延时系列，时间间隔介于 300 到 500 秒之间。将延时图像保存并导出为 AVI 或 TIFF 堆栈文件。要分析延时图像，请打开 ImageJ 或斐济中的延时图像序列，并使用拆分通道工具拆分通道。

在八位绿色通道图像中，使用分段线工具，使用所有影片的相同所需方向约定，沿粒子轨迹跟踪一条线，以便极性在所有被研究的单元格内和跨所有单元格之间保持一致。双击线条工具以调整线条宽度以匹配轨道的厚度，并使用 10 的线宽运行 Kymo ToolBox 插件的绘制 Kymo 宏。将出现一个提示，要求校准图像的时间和空间。

校准后，将生成基纳仪，并可保存为 TIFF 文件。要分配粒子轨迹，请使用分段线工具在采集整个持续时间内手动跟踪 kymograph 中的每个粒子，并使用 ROI 管理器将每个粒子轨迹记录为感兴趣的区域。保存每个延时视频的所有感兴趣区域，以进行进一步分析，并运行 Kymo ToolBox 插件的分析 Kymo 宏。

窗口将打开，要求从下拉菜单中从感兴趣的细胞核定义粒子运动的外向。应根据软件对每个感兴趣的货物的灵敏度定义限速，并且应调整线宽以匹配每个粒子轨迹的厚度。日志所有数据和日志外推坐标应用于计算各种货物运输参数。

单击"确定"。然后，每个轨道计算的数据将按 kymograph 进行池，并保存在特定于每个图像的文本文件中。将细胞素阿拉伯边治疗与基于摇动的纯化策略相结合，比仅包括纯化步骤的传统协议更丰富了星细胞培养物的纯度。

基于唇裂的转染允许蛋白质的瞬态表达，其水平是活细胞成像的最佳水平，而不会引起毒性或影响星细胞的生存能力。同样，使用荧光探针可以快速有效地标记酸性内糖体细胞器，以跟踪细胞器动力学和星形细胞。成像的延时数据可用于生成跟踪货物在时间和空间上的运动的 kymgraph。

在这些 kymograph 中，指示货物的逆极运动由带负斜面的轨迹表示，而逆行运动由带正斜面的轨迹表示。固定囊泡显示为垂直轨迹。在这项分析中，通过星细胞区域对特定货物的通量进行量化，揭示了货物之间模态粒子的百分比差异，这些粒子可能代表其在获得电影的星细胞区域的正常碱线运动性。

从 kymgraph 获得的每个粒子的 X、Y 位置沿完整时间刻度的精确映射也可用于评估其他运动参数，如货物速度和运行长度。由于该协议要求高质量的星细胞培养和高效的货物标签，因此应调整每个质粒或感兴趣的货物转染试剂孵育时间和采集时间表。该协议可以修改，以描述星形细胞中因细胞损伤、毒性、致病突变、突触活动或细胞内或细胞外环境变化而发生的运输事件。