Name: 造血干细胞代谢分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: 学习使用优化方案分离小鼠骨髓造血干细胞并测量线粒体呼吸与糖酵解活性。该方法提高细胞存活率，助力研究血液形成与造血疾病的代谢调控机制。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院（HL131645，CA016058）、圣巴尔德里克基金会和佩洛通尼亚基金会的资金支持。

本方案已获全美儿童医院动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
注意：本实验方案按时间顺序描述，跨越两天时间。请使用下述方案中所述的新鲜试剂。
1. 检测前一天的试剂准备
<ol>
	<li>水化传感器板。
	<ol>
		<li>将5 mL校准液（材料表）置于无CO2、37 °C的培养箱中孵育过夜。</li>
		<li>打开细胞能量代谢检测套件（材料表），将传感器板（绿色；上层）与工具板（透明；下层）分离。随后将传感器板倒置，并放置在工具板旁边。</li>
		<li>使用无菌水，向工具板的孔中加入200 µL，孔周围腔室加入400 µL。</li>
		<li>将传感器板完全浸入工具板中，确保传感器完全被水覆盖。轻敲3次以避免气泡形成。</li>
		<li>将浸没在工具板中的传感器板置于无CO2、37 °C的培养箱中过夜。为防止水分蒸发，确保培养箱内保持适当湿度。在传感器板-工具板旁额外放置一个盛有H2O的敞口烧杯作为预防措施，特别是在使用普通烘箱时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备检测板。
	<ol>
		<li>使用70%乙醇对二级生物安全柜表面进行消毒。在生物安全柜内打开检测板。</li>
		<li>在生物安全柜内，向检测板的每个孔中加入40 µL市售的0.01% (w/v) 聚-L-赖氨酸（PLL）溶液。</li>
		<li>用试剂盒提供的盖子盖上检测板。将封闭的检测板在室温（RT）下于生物安全柜内孵育1小时。 
		注意：孵育的目的是使PLL包被检测板表面，以促进悬浮细胞在检测板表面的黏附。</li>
		<li>孵育1小时后，用无菌真空吸液器吸除多余液体，并在生物安全柜内将孔晾干。 
		注意：使用吸液器去除多余PLL后，晾干检测板孔大约需要30−60分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 检测当天
<ol>
	<li>准备 cartridge。
	<ol>
		<li>取出传感器 cartridge，将其倒置放置于组织培养罩内，并弃去 utility plate 中的水。</li>
		<li>向 utility plate 的孔中加入 200 μL 预热的校准液。</li>
		<li>向孔周围的腔室中加入 400 μL 校准液。</li>
		<li>将传感器 cartridge 浸入 utility plate 中，确保传感器完全被校准液覆盖。轻敲 3 次以避免气泡形成。</li>
		<li>将浸没在 utility plate 中的传感器 cartridge 置于不含 CO2 的 37 °C 培养箱中平衡 45−60 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离小鼠骨髓来源的 LSK HSPCs。
	<ol>
		<li>为满足足够的生物学重复，计划每孔检测板使用一只小鼠来源的 HSPCs。 
		注意：该骨髓采集方法每只小鼠可获得约 50,000−80,000 个 LSK HSPCs。本细胞外通量检测方案已优化为每 96 孔板每孔使用约 70,000 个 LSK HSPCs。</li>
		<li>按照当地 IACUC 批准的方法，使用过量 CO2 和颈椎脱位法处死小鼠。</li>
		<li>使用 70% 乙醇对解剖工具和实验台表面进行消毒。</li>
		<li>每只小鼠预先准备一个培养皿，加入室温的含 2% 热灭活胎牛血清（FBS）的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）。 
		注意：请勿使用预冷的 PBS，否则在后续步骤中会产生细胞团块。</li>
		<li>用 70%（v/v）乙醇喷洒整个已处死的小鼠。从小鼠中分离所有骨骼，包括上下肢、髋骨、胸骨、肋骨和脊柱17,18。从小鼠脊髓中取出白质组织，因其可能污染 LSK 细胞。在收集过程中，将所有骨骼立即放入含 2% FBS 的 1× PBS 中，置于培养皿内备用。</li>
		<li>将一个新的 50 mL 离心管倒置，用于在培养皿中含 1× PBS（+ 2% FBS）的液体中吹打骨骼。</li>
		<li>使用 10 mL 移液管，在压碎骨骼后上下吹打约 10 次，均匀地将细胞从骨骼中冲洗出来。</li>
		<li>将 40 µm 细胞筛置于 50 mL 离心管上。通过加入 1 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 预先润湿筛网表面。</li>
		<li>收集步骤 2.2.7 得到的骨髓细胞悬液，通过已润湿的细胞筛，以去除骨碎片。</li>
		<li>重复步骤 2.2.6 至 2.2.9，直至所有骨组织变为白色，表明大部分骨髓细胞已被收集至 50 mL 离心管中。 
		注意：通常每只小鼠需要两个 50 mL 离心管才能收集全部骨髓来源的细胞。</li>
		<li>将含有骨髓来源细胞的 50 mL 离心管在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液。将骨髓来源的细胞（合并两个 50 mL 管中的内容物）重悬于 5 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 中，最终体积为 5 mL，并将细胞置于室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离单核小鼠骨髓细胞。
	<ol>
		<li>向 15 mL 离心管中加入 5 mL 密度梯度介质（如 Ficoll）。然后缓慢加入 5 mL 骨髓细胞悬液，确保细胞层位于密度梯度介质上方。</li>
		<li>在室温下以 500 × g 离心 30 分钟。离心过程中不得使用刹车，并确保离心机加速度设置为最低（例如加速度为 1，减速度为 0）。</li>
		<li>离心后，收集中间单核细胞层（白色）至新的 15 mL 离心管中。</li>
		<li>用 5 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 洗涤从密度梯度介质中收集的细胞，在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>重复步骤 2.3.4。</li>
		<li>将管中细胞重悬于 300 µL 含 2% FBS 的 1× PBS 中。取 10 µL 细胞悬液分装至流式管中，用于未染色或单色对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从小鼠骨髓单核细胞中分离 LSK HSPCs。
	<ol>
		<li>通过混合以下每种抗体各 3 µL（每样本）制备生物素化抗体混合液：Gr1、Cd8a、Cd5、B220、Ter119。向 300 µL 单核骨髓细胞中加入 15 µL 生物素化抗体混合液。 
		注意：每种抗体的稀释比例为 1:100。</li>
		<li>将细胞与生物素化抗体混合液在 4 °C 下避光震荡孵育 30 分钟，防止细胞在管底聚集。</li>
		<li>向与生物素化抗体混合的细胞中加入 10 mL 预冷的含 2% FBS 的 1× PBS。</li>
		<li>在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 400 µL 含 2% FBS 的 1× PBS 中。分装 10 µL 用于链霉亲和素单色对照。</li>
		<li>使用前短暂涡旋抗生物素微珠（材料表）。向每个细胞样本（400 µL）中加入 80 µL 微珠，充分混匀后在 4 °C 下继续震荡孵育 20 分钟。</li>
		<li>向细胞中加入 10 mL 预冷的含 2% FBS 的 1× PBS，在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 中，4 °C 保存，同时准备磁性分离装置。</li>
		<li>将柱子（材料表）置于磁性细胞分选（MACS）分选仪的磁场中，保持 4 °C。在 4 °C 下通过重力流用 3 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 冲洗柱子，完成磁性分离前的准备。</li>
		<li>将步骤 2.4.7 的细胞悬液加入已在 4 °C 预润湿的柱子中，让细胞在 4 °C 下流过柱子，并将流出液收集至 15 mL 离心管中。 
		注意：流出液中未标记的细胞部分即为富集的谱系阴性细胞。</li>
		<li>在 4 °C 下用 3 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 洗涤柱子，重复 3 次。收集穿流液并置于 4 °C 保存。使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法计数洗脱的活细胞。</li>
		<li>将含有穿流液的 15 mL 离心管在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。将细胞重悬于 0.5 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 中，并转移至流式管中。</li>
		<li>每 107 个细胞加入 24 µL LSK 抗体混合液。该抗体混合液包含等浓度的 450-链霉亲和素抗体、PE-CY7-Sca1 抗体和 APC-c-Kit 抗体。</li>
		<li>在 4 °C 下避光（用锡箔纸包裹）震荡孵育 1 小时。</li>
		<li>向流式管中加入 3 mL 含 2% FBS 的 1× PBS，在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将抗体标记的细胞重悬于 1 mL 含 2% FBS 的 1× PBS 中。在分选前立即向细胞悬液中加入 1 µL 浓度为 1 mg/mL 的碘化丙啶（propidium iodide）。</li>
		<li>在分选 LSK 细胞前，使用 40 µm 滤器过滤流式管中的内容物。</li>
		<li>通过流式细胞分选（FACS）收集 LSK 细胞，分选至含有 0.5 mL 完全培养基的 1.5 mL 管中，该培养基补充有 2 mM 谷氨酰胺、3 mg/mL 葡萄糖、1 mM 丙酮酸钠、1× 血小板生成素（TPO）、1× 干细胞因子（SCF）、0.5× 青霉素/链霉素（P/S），pH 7.4（表 1）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. LSK造血干细胞的线粒体呼吸和糖酵解检测
<ol>
	<li>在检测板中接种LSK细胞
	<ol>
		<li>将步骤2.4.17中获得的LSK细胞在室温下以500 × g 离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用完全培养基重悬细胞，调整终浓度至少为70,000个细胞/40 µL。</li>
		<li>将含70,000个细胞的40 µL培养基接种至步骤1.2.4中已包被PLL的8孔板中，四个角上的孔保持空置。</li>
		<li>在室温下以450 × g 离心1分钟，不启用刹车。使用倒置显微镜确认细胞已贴附于孔底。</li>
		<li>向每孔细胞中加入135 µL完全培养基，使终体积达到175 µL；在板的两个对角孔中各加入175 µL完全培养基作为空白对照。</li>
		<li>将细胞置于非CO2 培养箱中，37 °C孵育2小时。</li>
		<li>在分析仪中设置程序，按照表2（线粒体应激测试）和表3（糖酵解应激测试）所述的计量方式向各孔添加药物。 
		注：细胞孵育期间，请开启仪器并确保其温度维持在37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线粒体应激测试
	<ol>
		<li>配制寡霉素（oligomycin）45 µM、羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）50 µM以及鱼藤酮/抗霉素A（rotenone/antimycin A）25 µM的储备液。配制45 µM寡霉素储备液时，将市售小袋内含物溶于280 µL完全培养基中；配制50 µM FCCP储备液时，将市售小袋内含物溶于288 µL完全培养基中；配制25 µM鱼藤酮/抗霉素A储备液时，将市售小袋内含物溶于216 µL完全培养基中。</li>
		<li>从培养箱中取出装有传感器微板的工具板，向其端口（A、B和C）加样，使各孔在稀释后达到终浓度分别为2 µM寡霉素、1.5 µM FCCP和0.5 µM鱼藤酮/抗霉素A，具体稀释比例参见表4（用于氧消耗率检测）。</li>
		<li>取下工具板上组装好的传感器微板盖，将其放置于仪器托盘上，启动校准程序，持续20分钟。</li>
		<li>校准完成后，移除工具板，并替换为含有已贴壁LSK细胞的检测板。</li>
		<li>点击继续以启动表2中描述的程序。程序运行结束后，获取数据并使用Wave Desktop软件进行分析。 
		注：细胞外通量检测所产生的数据可通过Wave Desktop软件中的点图进行可视化，或导出至基于网络的统计分析程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>糖酵解应激测试
	<ol>
		<li>将市售小袋中的葡萄糖溶于300 µL完全培养基中（终浓度100 mM），寡霉素溶于288 µL完全培养基中（终浓度50 µM），2-脱氧葡萄糖（2-DG）溶于300 µL完全培养基中（终浓度500 mM）。</li>
		<li>轻柔吹打溶液约10次以充分溶解化合物；对2-DG样品涡旋震荡约1分钟，确保其在培养基中完全溶解。</li>
		<li>从培养箱中取出传感器微板，按照表5所述的稀释比例向端口A至C加样，使终浓度分别为10 mM葡萄糖、2 µM寡霉素和50 mM 2-DG。</li>
		<li>重复步骤3.2.3和3.2.4。</li>
		<li>点击继续以启动表3中描述的程序。程序运行结束后，获取数据并使用Wave Desktop软件进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+origin%2C+development%2C+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hematopoietic+stem+cell+diet%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li>
<li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+change%3A+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li>
<li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li>
<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125(2016).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li>
<li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+Mitochondria%2C+Metabolism%2C+and+Stem+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li>
<li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901(2015).</li>
<li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li>
<li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li>
<li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li>
<li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li>
<li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li>
<li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+%28HSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li>
<li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis%3A+therapeutic+targets+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li>
<li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility%3A+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li>
<li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li>
<li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism%3A+Culprits+or+Bystanders%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li>
<li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+%26+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li>
<li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li>
<li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li>
<li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li>
<li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li>
<li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文展示了如何分离出最大量的高纯度且具有活性的小鼠LSK HSPCs群体，并利用细胞外通量分析仪检测其糖酵解和线粒体呼吸功能。具体而言，该实验方案克服了LSK HSPCs应用中的以下技术难题：i）LSK HSPCs在小鼠骨髓中频率较低14；ii）LSK HSPCs的基础代谢活性较低26；iii）LSK HSPCs细胞脆弱易损27；以及iv）LSK HSPCs不易贴附于培养容器表面15。此外，我们还优化了药物浓度和培养基成分，以确保细胞外通量检测达到最佳性能。
骨髓来源的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）存在于低氧微环境中，表现出糖酵解表型，这对于维持其干性至关重要28。相反，呼吸作用对HSPC的分化至关重要6。由于HSPCs的代谢功能障碍会导致血液系统疾病，本文中我们描述了用于检测小鼠骨髓来源LSK ...

由于大多数成熟血细胞的寿命较短，血液系统的稳态依赖于一种寿命较长但数量稀少的造血干细胞（HSPCs）的自我更新和分化能力1。HSPCs通常处于静息状态，但在受到刺激时能够迅速增殖并启动分化，以满足血液系统的需求。由于每种HSPC细胞状态都需要独特的生物能量支持，因此代谢变化是决定HSPC命运的关键驱动因素。因此，当HSPCs在静息、自我更新和分化之间的平衡被打破，导致代谢可塑性丧失时，常引发骨髓或淋巴增殖性疾病。综上所述，深入理解代谢调控在HSPC发育过程中的作用，对于揭示血液系统恶性肿瘤的潜在机制至关重要2,3,4,5。
线粒体呼吸和糖酵解生成 ATP，以驱动细胞内反应并产生大分子合成所需的结构单元。由于造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的线粒体质量低于分化细胞6，且它们在低氧的骨髓微环境中维持静息状态，因此主要依赖糖酵解供能。HSPCs 的激活会增强其线粒体代谢，导致静息状态的丧失并进入细胞周期。HSPCs 的这种代谢可塑性使得 HSPC 群体能够在整个成年期得以维持6,7,8,9,10,11,12。因此，研究其代谢活性至关重要，例如氧消耗率（OCR；氧化磷酸化的指标）和细胞外酸化率（ECAR；糖酵解的指标），以分析 HSPC 的激活状态和健康状况。OCR 和 ECAR 均可利用细胞外通量分析仪进行实时、同步测量。然而，现有方法需要大量细胞，且针对贴壁细胞进行了优化13。由于 HSPCs 无法从小鼠体内大量分离14，需要分选以获得纯群体，属于非贴壁细胞15，且无法在不诱导分化的情况下进行过夜培养16，因此对 HSPCs 的 OCR 和 ECAR 进行测量一直存在困难。本文提供了一套清晰、逐步的操作说明，配合基于视频的教程，介绍如何对数千个鼠源骨髓 LineagenegSca1+c-Kit+（LSK）HSPCs 的代谢呼吸和糖酵解进行测量。

<table><tbody><tr><td>0.01% (w/v) 聚-L-赖氨酸溶液</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>用于LSK细胞贴附</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 细胞滤筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>用于骨组织碾碎后的细胞过滤</td></tr><tr><td>抗生物素微珠（Anti-Biotin MicroBeads）</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td>用于Lin⁻细胞分离</td></tr><tr><td>生物素标记大鼠抗小鼠CD45R/B220单克隆抗体（克隆RA3-6B2）</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td>用于Lin⁻细胞分离</td></tr><tr><td>生物素标记大鼠抗小鼠CD5单克隆抗体（克隆53-7.3）</td><td>BD Biosciences</td><td>553019</td><td>用于Lin⁻细胞分离</td></tr><tr><td>生物素标记大鼠抗小鼠CD8a单克隆抗体（克隆53-6.7）</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td>用于Lin⁻细胞分离</td></tr><tr><td>生物素标记大鼠抗小鼠Ly-6G和Ly-6C单克隆抗体（克隆RB6-8C5）</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td>用于Lin⁻细胞分离</td></tr><tr><td>生物素标记大鼠抗小鼠TER-119/红系细胞单克隆抗体（克隆TER-119）</td><td>BD Biosciences</td><td>553672</td><td>用于Lin⁻细胞分离</td></tr><tr><td>CD117 (c-Kit) 单克隆抗体 (2B8), APC标记</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>用于LSK细胞分选</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 圆锥形离心管</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>用于细胞分离</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 圆锥形离心管</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>用于细胞分离</td></tr><tr><td>Falcon 圆底聚丙烯管</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-11A</td><td>用于LSK细胞分选</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Neuromics</td><td>FBS001-HI</td><td>用于FACS缓冲液配制</td></tr><tr><td>Histopaque-1083</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td>用于Ficoll密度梯度分离</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 100倍溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>用于实验培养基配制</td></tr><tr><td>LS柱</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>用于Lin⁻细胞分离</td></tr><tr><td>Ly-6A/E (Sca-1) 单克隆抗体 (D7), PE-Cyanine7标记</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-82</td><td>用于LSK细胞分选</td></tr><tr><td>小鼠干细胞因子（SCF）</td><td>PeproTech</td><td>250-03-100UG</td><td>用于实验培养基配制</td></tr><tr><td>小鼠血小板生成素（TPO）</td><td>PeproTech</td><td>315-14-100UG</td><td>用于实验培养基配制</td></tr><tr><td>PBS 1%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>用于FACS缓冲液配制</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>用于实验培养基配制</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Fisher Scientific</td><td>P1304MP</td><td>用于LSK细胞分选</td></tr><tr><td>Seahorse XFp 细胞培养微型板</td><td>Agilent Technologies</td><td>103025-100</td><td>用于LSK细胞接种</td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>ThermoFisher</td><td>11360070</td><td>用于实验培养基配制</td></tr><tr><td>链霉亲和素-eFluor 450偶联物</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>用于LSK细胞分选</td></tr><tr><td>XF校准液</td><td>Agilent Technologies</td><td>100840-000</td><td>用于检测探针盒平衡</td></tr><tr><td>XF培养基</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>用于实验培养基配制</td></tr><tr><td>XFp 糖酵解压力测试试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>103017100</td><td>用于糖酵解压力测试的药物</td></tr><tr><td>XFp 线粒体压力测试试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>103010100</td><td>用于线粒体压力测试的药物</td></tr><tr><td>XFp 传感器探针盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>103022-100</td><td>用于糖酵解和线粒体压力测试</td></tr></tbody></table>

造血干祖细胞代谢分析

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

造血干祖细胞（HSPCs）具有独特的代谢可塑性，使其能够从静息状态转变为分化状态，以满足血液生成的需求。然而，由于HSPCs数量有限，且缺乏针对非贴壁、脆弱HSPCs优化的实验方案，分析其代谢状态（线粒体呼吸和糖酵解）一直存在困难。本文提供了一套清晰、逐步的操作指南，用于检测小鼠骨髓LineagenegSca1+c-Kit+（LSK）HSPCs的代谢呼吸（氧消耗率；OCR）和糖酵解（细胞外酸化率；ECAR）。该方案可从小鼠骨髓中获得更高数量的LSK HSPCs，提高HSPCs在孵育过程中的存活率，便于对非贴壁HSPCs进行细胞外通量分析，并提供了针对氧化磷酸化和糖酵解通路靶向药物的优化注射方案（浓度和时间）。该方法有助于预测HSPCs在血液发育及疾病过程中的代谢状态和细胞健康状况。

我们的提取方法使每只小鼠可收获约 80,000 个 LSK HSPC。由于以下原因，该方法提高了 LSK 细胞的存活率和数量：（1）联合采集上肢和下肢、髋骨、胸骨、肋骨及脊柱的骨髓；（2）避免使用红细胞裂解缓冲液，以免增加细胞死亡和细胞聚团；（3）采用密度梯度介质分离单核细胞；（4）避免使用预冷缓冲液，以防目标细胞因聚团而丢失。
尽管细胞外通量分析传统上用于贴壁细胞，但我们通过使用PLL包被孔板，随后将细胞离心接种于其上，促进了LSK造血干细胞（HSPCs）在孔板表面的贴附。这使得我们能够测量细胞外通量，从而评估LSK HSPCs的代谢状态。考虑到从小鼠中可收获的细胞数量有限，以及其分离方案耗时较长，我们采用具有8孔板格式的分析仪，已成为最具成本效益且可行的解决方案（图1）。
细胞通过糖酵解和线粒体呼吸作用来满足其能量需求，并产生增殖和生长所需的中间代谢产物19。己糖激酶将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，后者随后被转化为丙...

造血干细胞祖细胞（HSPCs）在血液形成过程中由于其代谢可塑性，会从静息状态转变为分化状态。本文介绍了一种优化的检测HSPCs线粒体呼吸和糖酵解的方法。

造血干祖细胞（HSPCs）具有独特的代谢可塑性，这使得它们能够从静息状态转变为……

造血干细胞和祖细胞的代谢变化使其能够从静息状态转变为分化状态，以满足血液生成的需求。造血干细胞和祖细胞代谢可塑性的改变可导致血液系统疾病。本方案将有助于测量在血液发育及疾病过程中造血干细胞和祖细胞的代谢调控及其细胞状态。造血干细胞和祖细胞的线粒体呼吸和糖酵解分析较为困难，因为这类细胞脆弱且数量稀少。我们优化的实验方案可从鼠骨髓中分离出更高数量的造血干细胞和祖细胞，提高细胞在孵育过程中的存活率，便于对非贴壁型造血干细胞和祖细胞进行细胞外通量分析，并提供了针对氧化磷酸化及糖酵解通路药物检测的优化注射参数。开始本实验前，需将工具板的孔以及孔周围腔室中加入无菌水。将传感器 cartridge 浸入工具板中，确保传感器完全被水覆盖。然后将浸在工具板中的 cartridge 置于 37 摄氏度的非 CO2 培养箱中过夜培养。在 II 级生物安全柜中，向检测板的每孔加入 40 µL 商品化的 0.1% PLL 溶液。用试剂盒中提供的盖子盖住检测板，并将封闭的板在通风橱内室温下孵育一小时。之后，使用无菌的真空抽吸装置去除多余的溶液，并在通风橱内将板风干。为收获单核小鼠骨髓细胞，向一个15毫升的锥形管中加入5毫升密度梯度介质。缓慢加入5 mL骨髓细胞悬液，确保细胞保持在密度梯度介质上方形成一层。在室温下以500 × g离心30分钟，注意将离心机的加速度调至最低。收集单个核细胞的中间界面层至新的15 mL离心管中。然后用含有2% FBS的5毫升1×PBS洗涤细胞。在4°C下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于300微升含有2% FBS的1×PBS中。接下来，取10 µL细胞悬液，分装至流式管中，用于未染色或单色对照。为从单核小鼠骨髓细胞中分离LSK HSPCs，向300 µL单核骨髓细胞中加入15 µL生物素标记抗体混合液。为从单核小鼠骨髓细胞中分离LSK HSPCs，向300 µL单核骨髓细胞中加入15 µL生物素标记抗体混合液。将试管置于冰箱内摇床上的冰桶中，4°C条件下振荡孵育30分钟。然后向细胞中加入10 mL预冷的含2% FBS的1×PBS。在4°C条件下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于400微升含2% FBS的1×PBS中。使用前短暂涡旋振荡抗生物素微珠。向每份样品中加入80微升微珠，并充分混匀。在4°C条件下，继续振荡孵育20分钟。随后，向细胞中加入10 mL预冷的含2% FBS的PBS。在4°C条件下，以500 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 毫升含 2% FBS 的 PBS 中。在设置磁性分离装置的同时，将细胞悬液置于 4°C 保存。将分选柱置于 4°C 的磁场中，用于磁性辅助细胞分选分离装置。在4°C条件下，使用3毫升含2% FBS的1× PBS通过重力流冲洗色谱柱，以准备进行磁分离。在4°C条件

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

造血干细胞代谢分析

集落形成细胞（CFC）实验是一种体外实验，其中造血祖细胞在半固体培养基中形成集落。通过集落形态、细胞形态以及流式细胞术相结合的方法，评估祖细胞在不同造血谱系中增殖和分化的能力。...

人血液细胞集落形成细胞（CFC）检测

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

本文介绍了一种利用 LacI 转基因小鼠模型，针对少量纯化的造血细胞进行 体内 诱变分析的实验方法。 可通过分离 LacI...

在纯化的造血干细胞/祖细胞中鉴定DNA突变

本方案提供了建立竞争性小鼠骨髓移植实验的逐步指南，用于研究造血干细胞/祖细胞功能，而无需通过细胞分选对干细胞进行预先纯化。...

竞争性移植评估造血干细胞适应性

我们描述了一种利用多参数流式细胞术检测小鼠健康造血干细胞和祖细胞（HSPCs）以及由MLL-AF9驱动的急性髓系白血病（AML）小鼠模型中白血病细胞线粒体活性氧（ROS）的方法。...

小鼠造血干细胞与祖细胞及MLL-AF9驱动型白血病中线粒体活性氧的流式细胞术分析

异源物质外排泵在造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中具有高度活性，会导致线粒体膜电位荧光染料TMRM被排出。本文介绍了一种在维拉帕米（一种外排泵抑制剂）存在的情况下，使用TMRM准确测定HSPCs中线粒体膜电位的实验方案。...

通过抑制外排泵提高流式细胞术检测造血干细胞和祖细胞线粒体膜电位的准确性

本文介绍了一种在体外培养的造血干细胞和T细胞中可靠测定线粒体质量与膜电位的方法。...

通过流式细胞术测定造血干细胞和T细胞中的线粒体质量与膜电位

本文介绍的方法总结了利用细胞外通量分析仪实时测定非贴壁小鼠造血干细胞和原始祖细胞（HSPCs）的细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR），以评估其细胞生物能量学的优化实验方案。...

利用细胞外通量分析仪评估小鼠造血干细胞及原始祖细胞的细胞生物能量代谢

本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。...

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

本文介绍了一种基于流式细胞术的技术，可同时测量细胞分裂次数、细胞表面表型以及细胞间的亲缘关系。这些特性可通过基于置换的统计框架进行检验。...

同时评估亲缘关系、分裂次数和表型 通过 造血干细胞与祖细胞的流式细胞术

本文介绍了一种准确且可靠地检测稀有细胞类型中代谢物的实验方案。通过技术改进，包括采用改良的鞘液进行细胞分选以及制备相应的空白对照样本，仅需每样本5000个细胞即可实现对代谢物的全面定量分析。...

稀有原代细胞的靶向代谢组学

学习使用优化方案分离小鼠骨髓造血干细胞并测量线粒体呼吸与糖酵解活性。该方法提高细胞存活率，助力研究血液形成与造血疾病的代谢调控机制。

造血干祖细胞代谢分析

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