Name: 生物修复和益生菌发育的微生物菌株的勘探，用于生物有机物的研究与保存 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 探索从珊瑚和海水样本中分离具有生物修复与益生菌潜力的微生物菌株的方法，用于降解污染物并增强珊瑚在污染环境中的健康与恢复力。该方法为珊瑚保护提供了标准化技术方案。

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本研究是与正在进行的 R 项目合作开展的&amp;#38;D 项目已注册&#160;作为ANP 21005-4项目，“PROBIO-DEEP - 深海海洋全生物受油气勘探活动影响的潜在评估及这些生态系统中潜在生物指示物与生物修复过程的筛选”（UFRJ / Shell Brasil / ANP）——“PROBIO-DEEP - Levantamento de potenciais impactos causados pela exploração de óleo e gás em holobiontes marinhos em mar profundo e seleção de potenciais bioindicadores e processos biorremediadores para esses ecossistemas”，由Shell Brasil根据ANP研究与开发基金资助&amp;#38;D levy 称为“研发投资承诺”。&#160;作者还感谢&#160;国家科学技术发展委员会（CNPq）&#160;和&#160;高等教育人员提升协调办公室（CAPES）&#160;感谢提供资金支持，以及感谢 Camila Messias、Phillipe Rosado 和 Henrique Fragoso dos Santos 提供的图片。

1. 用于微生物分离的海水和珊瑚采集与保存
注意：必须记录采样地点的坐标和温度。如果可能，盐度、pH值、深度和光照强度等元数据也有助于优化培养方法并对后续数据进行解释。为了获得可靠的结果，应尽可能缩短样品的保存时间。如果样品未在适宜的温度下保存和/或长期储存，水体/珊瑚微生物组可能会发生显著变化。若无法在采集后立即进行分离操作，则必须将样品在4 °C条件下保存直至处理。即使在4 °C下，样品保存时间越长，微生物群落的变化越大。
<ol>
	<li>采集并储存海水。
	<ol>
		<li>从每个目标采样点至少采集三份500 mL水样。建议使用带螺旋盖的无菌瓶。</li>
		<li>若在采集后立即处理水样，可将瓶子短暂置于室温（RT）下；若延迟处理，则应将瓶子保存在4 °C条件下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集并储存珊瑚样品。
	<ol>
		<li>使用无菌镊子从与水样相同的采样点剪取珊瑚片段。为避免污染，仅可通过无菌手套接触珊瑚。</li>
		<li>用20 mL无菌生理盐水（3% NaCl溶于蒸馏水中）或无菌人工海水冲洗所采集的珊瑚片段，以去除附着不牢的海水自由生活细菌。</li>
		<li>使用镊子将每份珊瑚片段放入含有无菌生理盐水的无菌250−500 mL带螺旋盖容器中。</li>
		<li>在实验室中，使用无菌镊子和钳子，将5 g珊瑚片段置于无菌100 mm × 20 mm培养皿中，并用天平称重。</li>
		<li>将5 g珊瑚样品转移至无菌研钵中，使用无菌研杵进行研磨。</li>
		<li>使用无菌刮铲将研磨后的样品转移至含有45 mL 3% NaCl无菌溶液和10−15颗5 mm玻璃珠的无菌培养瓶中。可使用部分45 mL无菌生理盐水冲洗研钵，以最大限度回收研磨物。</li>
		<li>将培养瓶置于恒定振荡条件下（150 × g），在采样点海水温度下孵育16小时。 
		注：对于浅水珊瑚，最适温度范围为24−28 °C。此步骤可使附着于珊瑚不同组分（如宿主细胞表面、组织内部或骨骼内）的微生物脱落。完成此步骤后，不应储存珊瑚研磨液，应立即进行分离操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从海水和/或珊瑚中分离降解EE2的细菌
<ol>
	<li>选择细菌。 
	注意：在完成步骤 1.1.2 和 1.2.7 后，从不同珊瑚匀浆中脱离的海水中微生物浓度将未知且可变。为了确保在含有琼脂培养基的培养皿中分离出单个微生物菌落，需要进行系列稀释。
	<ol>
		<li>将珊瑚样品在无菌生理盐水中进行最高至 10-9 的系列稀释，水样则稀释至 10-6。每次移液前将吸头上下吹打 5 次，然后弃去吸头。每次进行下一级系列稀释前，将样品涡旋振荡 5 秒。</li>
		<li>取每种稀释液 100 µL 接种到含有 3% NaCl 赖氨酸肉汤（LB）琼脂培养基的培养皿中，并进行涂布。 
		注意：可使用海水琼脂（MA）作为替代培养基。每种稀释度需设三个重复，以获得可靠结果。</li>
		<li>将培养皿在目标温度（例如 26 °C）下培养 1−3 天，每天观察一次培养皿。</li>
		<li>使用划线法在新的培养皿上选择并分离具有不同生长形态的菌落。根据需要重复此步骤，直至获得纯菌落。</li>
		<li>如果未立即进入步骤 2.3.1，则按照第 2.2 节所述方法将分离物保存于 4 °C 或甘油中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备甘油保存菌种。 
	注意：此步骤为可选步骤，可用于细菌的长期保存。
	<ol>
		<li>从新鲜培养皿或 4 °C 保存的培养皿中挑取单菌落，分别接种至 2 mL 无菌 LB 液体培养基中。</li>
		<li>将试管置于 24−28 °C 恒定振荡（150 x g）条件下过夜（ON）培养。</li>
		<li>取步骤 2.2.2 中的细菌培养物 1 mL 与无菌甘油混合，使甘油终浓度为 20%，分装至 2 mL 冻存管中。</li>
		<li>将冻存管在 4 °C 过夜放置。</li>
		<li>将甘油菌种保存于 -80 °C，待需要时使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行 EE2 降解能力测试。
	<ol>
		<li>在 LB 液体培养基或替代培养基中活化分离菌株。具体操作为：从新鲜培养皿或 4 °C 保存的培养皿中挑取单菌落，接种至 2 mL 无菌 LB 液体培养基中。若使用甘油保存菌种，需先在 LB 琼脂平板上划线，于 24−28 °C 培养过夜（ON），以获得单菌落。将含有 LB 培养基的试管倾斜放置，在 24−28 °C、恒定振荡（150 x g）条件下过夜（ON）培养。</li>
		<li>细菌生长后，在室温（RT）下以 8,000 x g 离心 8 分钟收集菌体。弃去上清液，用等体积（2 mL）的生理盐水轻轻吹打重悬菌体，以洗去残留的 LB 培养基。</li>
		<li>重复步骤 2.3.2 两次，确保完全去除碳源，每次均用等体积的生理盐水重悬菌体。例如，若初始培养体积为 2 mL，则最终用 2 mL 生理盐水重悬菌体。</li>
		<li>将洗涤并重悬的菌体接种至以 EE2 为唯一碳源的最低限度 Bushnell Haas 培养基（BH Broth）中59。 
		注意：EE2 以乙醇溶解，终浓度为 5 mg/L。根据需要可更换污染物种类和/或浓度。</li>
		<li>通过测定 600 nm 处的光密度值和/或在 LB 琼脂培养基上测定菌落形成单位（CFU），评估细菌在 16−72 小时培养期间的生长情况33。 
		注意：也可直接在以 EE2 或其他化合物为唯一碳源的最低限度培养基上进行微生物分离。该步骤可定向筛选目标菌株，避免非目标微生物的生长。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从海水和/或珊瑚中分离石油降解细菌
<ol>
	<li>制备以油类水溶性组分（oWSF）和油类水不溶性组分（oWIF）作为唯一碳源的最小培养基21。
	<ol>
		<li>将1−2%的原油加入500 mL无菌蒸馏水中。使用底部可开启的滤瓶，在不扰动上层不溶性组分的情况下分离出可溶性组分。</li>
		<li>将混合物在24−28 °C、150 × g 条件下持续振荡48小时。</li>
		<li>将含有原油各组分的滤瓶置于稳定平面上，静置10−20分钟，使可溶性与不溶性组分充分分离。</li>
		<li>将oWSF转移至新的无菌烧瓶中，并通过打开滤瓶底部移出可溶性组分，保留oWIF。</li>
		<li>利用上一步回收的全部oWSF（约400 mL），配制1 L以oWSF为唯一碳源的BH琼脂最小培养基。</li>
		<li>利用步骤3.1.4中烧瓶内剩余的oWIF，配制1 L以oWIF为唯一碳源的BH琼脂最小培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离能够降解oWSF和oWIF的细菌。
	<ol>
		<li>分别取步骤1.1.2和1.2.7中获得的水样和珊瑚匀浆液，按步骤2.1.1所述方法，在无菌生理盐水中进行梯度稀释至10-6。</li>
		<li>用移液器吸取每种稀释液100 µL，接种于含有BH-oWSF和BH-oWIF琼脂培养基的培养皿中，进行涂布。</li>
		<li>重复执行步骤2.1.3至步骤2.1.5所述操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 联盟成员选择
<ol>
	<li>提取DNA并进行测序以进行分类学鉴定。
	<ol>
		<li>按照步骤2.3.1所述方法活化保存在甘油中的菌株。</li>
		<li>使用DNA提取试剂盒提取DNA（参见材料表）。</li>
		<li>使用引物27f（5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′）和1492r（5′-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）扩增16S rRNA基因。</li>
		<li>按照以下方案进行50 µL的PCR反应：5 μL 10x聚合酶缓冲液，2 mM MgCl2，0.2 mM dNTPs，每种引物5 mM，10 ng基因组DNA，以及2.5 U Taq DNA聚合酶。添加阴性对照（即空白DNA提取样本和不含模板DNA的PCR反应），以确保无污染。</li>
		<li>设置以下热循环程序：94 °C预变性4分钟；随后进行35个循环，每个循环包括94 °C变性1分钟、50 °C退火1分钟、72 °C延伸2.5分钟；最后在72 °C延伸10分钟。</li>
		<li>使用1.2%琼脂糖凝胶在80 V电压下检测扩增产物的完整性。</li>
		<li>使用凝胶纯化试剂盒对样品进行凝胶纯化（参见材料表）。</li>
		<li>使用荧光计定量PCR产物。</li>
		<li>将产物送测序。 
		注：为获得更准确的分类学分类，推荐使用Sanger测序法60，因其可提供较长的序列。通用引物27f和1492r可用于扩增几乎全长的16S rRNA基因61。若使用一对引物无法完成序列拼接，应考虑在序列中间区域增加另一对引物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定生长曲线。
	<ol>
		<li>按照步骤2.3.1所述方法活化步骤2.2.5中保存于甘油中的菌株，但使用5 mL培养基代替2 mL。</li>
		<li>将步骤4.2.1中培养的5 mL菌液按1%（v/v）比例接种至含有100 mL 3% LB培养基的250 mL三角瓶中，每组设三个重复。同时需设置无接种物的阴性对照组三个重复。</li>
		<li>将三角瓶置于24−28 °C恒温摇床中，持续振荡（150 x g）。</li>
		<li>在48小时内每隔4小时取样1 mL。若菌株生长速率较快，可缩短取样间隔。</li>
		<li>测定600 nm波长下的光密度（OD）值，并通过系列稀释后涂布于富集培养基平板上计数菌落形成单位（CFU）（每平板接种100 µL，并将结果归一化至1 mL体积）。</li>
		<li>绘制OD值和CFU值的生长曲线，分析各菌株OD与CFU之间的相关性。此后可根据OD值计算细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行拮抗试验。
	<ol>
		<li>按照步骤2.3.1所述方法活化菌株。</li>
		<li>将一种菌株沿含琼脂培养基平板的中央划线接种，其余菌株垂直于中央菌株划线接种。重复此操作，确保所选所有微生物菌株均相互测试。</li>
		<li>将平板置于24−28 °C培养箱中培养，并每日观察是否出现指示拮抗活性的抑菌圈。若观察到抑菌圈，表明两菌株间存在拮抗作用，应排除其中一种菌株。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建菌群组合。
	<ol>
		<li>按照步骤2.3.1所述方法活化菌株。</li>
		<li>在3,500 x g条件下离心收集细胞，用等体积无菌生理盐水轻柔洗涤两次。将细胞重悬于等体积的生理盐水中（例如，若最终细胞体积为2 mL，则使用2 mL生理盐水洗涤，并最终重悬于2 mL体积中）。</li>
		<li>将1 mL菌液接种至100 mL含3% NaCl的LB培养基中，在150 x g条件下过夜培养。</li>
		<li>重复步骤4.5.2，将100 mL培养后洗涤并重悬的菌液接种至10 L培养体系中。在无菌气升式生物反应器中过夜培养，通过泵提供过滤空气。若需更多培养物，始终以1%的已培养菌液接种至新鲜培养基中。</li>
		<li>在4 °C条件下以8,000 x g离心培养物8分钟。离心后弃去上清液。</li>
		<li>用500 mL无菌生理盐水洗涤沉淀，并轻柔重悬细胞。</li>
		<li>重复步骤4.5.5和4.5.6。</li>
		<li>将每种单独培养的菌液重悬于100 mL生理盐水中，测定OD值以估算细胞数量。</li>
		<li>计算每种菌液所需体积，以达到最终浓度为107 cells mL-1。</li>
		<li>在富集培养基上进行CFU计数，最终确认细胞活力与浓度。</li>
		<li>将每种单独菌液取等体积混合于无菌三角瓶中，并分装至50 mL无菌离心管中。</li>
		<li>保存于4 °C直至接种。 
		注：应尽可能新鲜制备菌群组合，以确保细胞仍具活性。也可在接种前再次进行CFU计数。为构建理想的菌群组合，需选用具有不同且互补代谢能力的菌株。通常使用6−10个菌株构建菌群，但具体数量将根据成员特性及应用目的而调整。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 珊瑚潜在有益特性的检测
<ol>
	<li>通过将甘油保存菌种划线接种于LB琼脂平板上，并在24−28 °C条件下过夜培养，以获得单菌落。从平板上挑取单个菌落，接种至2 mL无菌LB液体培养基中。将含有LB培养基的试管置于倾斜位置，在24−28 °C、持续振荡（150 × g）条件下过夜培养。</li>
	<li>按照第4.1节所述方法进行DNA提取，用于通过PCR检测潜在有益基因。 
	注意：PCR反应条件和引物取决于目标基因。针对各菌株BMC特性的检测方法及潜在有益基因的PCR检测方案详见表1。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在过去50年中，生物修复方法得到了广泛研究。例如，已在多种不同生境中发现200多种细菌、蓝细菌、微藻和真菌，能够指示和/或降解石油烃类物质62,63,64。此外，其他对环境和人类健康造成影响的化合物，如塑料、双酚A、内分泌干扰物和重金属，也已成为生物修复技术研发的目标65,66,67。另一方面，海洋益生菌的研发主要集中于对经济具有明显影响的领域，例如水产养殖中的鱼类益生菌68,69。然而，近年来，人们开始重视分离和鉴定对珊瑚礁——这一支撑渔业、旅游业及其他盈利性活动的重要海洋生态系统——具有保护作用的有益微生物15。本文介绍了一种低成本、简便且易于实施的方案，用于筛选能够降解污染物、同时可能对当地海洋生态系统（特别是珊瑚的潜在有益微生物，pBMCs）具有积极作用的微生物。
此外，本文展示的方法可高度适用于多种化合物及不同类型的微生物来源。通过替换添加至最低培养基中的唯一碳源，可针对不同的污染物进行筛选。具体而言，可添加所需浓度的其他化合物来替代石油或EE2，从而形成选择压力，以分离出能够降解目标污染物的微生物。例如，已有研究利用相同的方法筛选并测试了能够降解其他类别的内分泌干扰物的微生物70。此外，还可使用其他海洋和陆地生物（如海绵和植物）71,72，以及不同类型的环境样品（如土壤、燃料和岩石）作为降解性微生物的来源25,73,74。例如，已有研究从不同的土壤和沉积物样品中成功检测并分离出可降解烃类的细菌25,54,63,64,75。最后，通过对培养基进行轻微调整，也可方便地筛选出细菌以外的其他微生物作为降解菌。例如，已有报道发现一种微藻菌株具有高效降解雌激素类化合物的能力76。
理想情况下，应针对每种特定化合物或区域组装用于生物修复的益生菌群落。在特定环境中生长的微生物，与在原生条件下相比，可能在新地点无法良好生长。由于研究人员尚未发现可在所有不同环境条件下高效应用的产品，因此应针对每种具体情况重新组装群落。这类似于为环境定制恢复方案的个性化医疗。因此，建立一个具有潜在益生特性及降解能力的微生物菌株中央库，是推动该领域发展的关键步骤。这一举措将节省时间和工作量，有助于在全球范围内快速构建新的特异性菌群。
与珊瑚相关的微生物（即微藻、细菌、古菌、真菌和病毒）在维持宿主稳态中发挥着复杂而精细的作用19。环境胁迫因素（如污染）也可能破坏珊瑚微生物组的稳定性，导致菌群失调，进而引发疾病甚至死亡30。目前，珊瑚微生物组支持珊瑚健康的具体机制正逐渐被揭示。这些机制是理解珊瑚对环境胁迫的抗性与恢复力的关键，从而有助于促进珊瑚礁的持续存在与保护。此外，该领域的研究发现还将有助于理解普遍存在的宿主-微生物组相互作用，可能为其他领域开发更有效的益生菌及促进健康的策略提供依据。同时，还需进一步深入研究这些益生菌接种在胁迫事件期间如何影响元有机体的健康状况。例如，仍需开展研究以明确珊瑚性能的提升确实源于益生菌的作用，而非仅仅因为珊瑚将细菌作为食物来源所导致。
同时，开发新的群落递送方法并改进现有方法具有重要意义。群落固定化的替代方法以及创新性策略（例如将珊瑚食物（即卤虫和轮虫）作为载体进行接种）均具有广阔前景。这些递送系统还可经改造后用于靶向其他海洋生物，对海洋益生菌领域的成功发展至关重要。
污染治理与珊瑚礁的存续目前是环境会议中经常强调的两个主要议题。联合国发布的《2030年可持续发展议程》是一份描述社会应实现的全球性目标以确保可持续未来的文件，其中为上述每个问题设定了具体目标。目标6强调通过减少污染来改善水质的重要性，目标14则重申了保护和可持续利用海洋、海区及海洋资源的相关性77。在此背景下，珊瑚礁保护依赖于应在近期实现的变革，包括污染治理。这一点极为重要，因为大多数大规模珊瑚损失事件均发生在气候事件与其他因素（如局部生境破坏和污染）共同作用的情况下78,79。本文表明，可将生物修复与pBMC接种相结合，以降解特定污染物，同时可能增强珊瑚应对污染物及其他压力的抗性和恢复力。对现有方案的优化和/或创新方法的开发，无论是联合应用还是独立使用，都将是决定海洋生态系统未来的关键。

污染是全球范围内影响人类、动物和植物健康的主要问题。尽管污染可能源于自然因素，例如火山灰1，但人类活动是大多数污染的主要成因。人为活动正在污染土壤、水体和空气，直接或间接导致每年近2000万人过早死亡2，并造成数十亿其他生命形式的灭绝。即使在地球上最偏远的地区也存在污染物。例如，已在深海无脊椎动物和极地哺乳动物中分别检测到重金属和持久性有机化合物3,4。
海洋环境尤其受到污染的严重影响。长期以来，人们一直认为海洋因其巨大的水体体积而不会受到影响，并能持续提供无穷无尽的资源5。因此，数百年来，各类工业和机构随意向水体排放废弃物6,7。已有多种类型的污染物被报道对海洋生态系统造成影响，包括塑料8、合成激素9、农药10、石油11、营养物质12、重金属3以及放射性废物13。在这一背景下，珊瑚礁是海洋环境中最重要且最敏感的生态系统之一14。珊瑚礁作为海岸保护屏障，在数千种海洋物种的繁衍发展中起着关键作用，参与营养循环并调节气候。此外，珊瑚礁还通过提供鱼类资源、商品和旅游业等方式促进经济发展15。例如，全球有45亿人依赖海洋鱼类作为主要食物来源16，而这些鱼类资源在很大程度上依赖于珊瑚礁的支持。
尽管珊瑚礁在生态、社会和经济方面具有重要意义，但它们正遭到严重破坏17,18。人类活动是导致珊瑚死亡的三大主要原因——气候变化、过度捕捞和水污染——的主要驱动因素19。尽管应对全球变暖至关重要，但同样重要的是应努力减少局部污染，包括可能严重加剧珊瑚衰退的水污染20。因此，迫切需要制定策略以延长珊瑚的生存时间，从而为其适应和存活争取更多时间。
在这方面，寻找减少污染的解决方案并制定提高珊瑚适应能力的策略极为重要。针对海洋污染物的修复策略多种多样，可分为物理、化学和生物三类方法。物理方法具有一定作用，但并不总是高效。例如，塑料垃圾可通过物理清除方式减少，而水溶性化合物则需要其他方法才能去除。此类化合物包括由石油工业活动和泄漏所释放的原油，以及其他微污染物，如合成激素——这类物质通常作为口服避孕药中的雌激素成分，存在于污水中21,22。使用化学物质降低污染虽可解决特定问题，但也可能带来额外的污染源。例如，用于缓解石油污染的化学分散剂，据描述其对海洋生态系统的毒性甚至超过石油污染本身23。因此，与其他方法相比，生物方法具有多项优势。生物修复是指生物体或其代谢产物将污染物转化为低毒或无毒形式的能力24。生物方法的主要优势在于其可持续性、相对较低的成本、环境友好性，以及可在不同生态系统中应用且对环境造成最小或更少影响的特点21,25,26,27。
此外，调控环境中存在的微生物群落具有额外的潜在优势。某些微生物组与宿主相关联，并对宿主健康至关重要。众所周知，这些共生的微生物组对于维持宿主内环境稳定是必需的19。针对植物和哺乳动物等宿主，其相关微生物的调控已得到广泛研究28,29，但珊瑚益生菌的应用仍属新兴领域15。珊瑚同样定殖并依赖大量特定的微生物种群以维持生存19。目前，这些微生物群落在珊瑚健康与菌群失调中的作用正处于积极研究之中，但尚远未完全阐明30。其中一个广受关注的假说称为“珊瑚益生菌假说”，该假说认为共生微生物与环境条件之间存在动态关系，从而促使最有利的珊瑚元生物体被选择出来31。基于这一理论，研究人员提出32并验证了若干关键的潜在益生菌作用机制，以及针对珊瑚有益微生物（BMCs）的分离、调控和递送策略，以实现多种应用目的33。这些潜在的有益特性包括对温度升高的耐受性、对活性氧（ROS）的防护、固氮能力、对污染物的抗性，以及对病原体的生物抑制作用等32。
本研究聚焦于筛选能够降解海洋环境中两种常见污染物的微藻共生体（BMCs）及自由生活的微生物：合成雌激素17α-乙炔基雌二醇（EE2）和原油。含有激素活性物质的污染物常存在于水体中34,35,36,37,38,39,40,41,42。其中，合成雌激素类内分泌干扰物（EDCs）可模拟雌激素在靶细胞上的作用，对动物造成多种影响，包括乳腺癌、不孕症和雌雄同体现象9。EE2因人类服用口服避孕药后经排泄进入环境。传统的污水处理厂无法将其完全去除，即使在极低浓度下（如ng/L或µg/L）也具有负面效应43,44,45。目前关于雌激素对珊瑚生理的影响知之甚少46,47。然而，在其他海洋无脊椎动物（如海绵、甲壳类和软体动物）中，雌激素已被报道会引起多种负面效应，主要涉及生殖系统，例如配子的发育和/或刺激、酶和蛋白质功能的改变、胚胎发育过程中的问题等48,49,50,51,52。EE2污染所导致的负面后果凸显了开发可持续方法以从环境中去除该化合物同时不损害海洋生物的必要性。
与此同时，目前石油约占全球消耗能源的40%53，而石油污染和泄漏事件常发生在珊瑚礁区域附近11。已有报道指出，石油污染对多种海洋动物、鸟类、植物以及人类均会产生负面影响54,55,56,57。对于珊瑚而言，石油污染可导致白化现象，降低幼虫对热应激的抵抗力58，破坏与其共生的微生物群落21，并引发组织坏死。此外，化学分散剂作为一种石油公司常用的溢油修复技术，其对珊瑚的毒性甚至高于石油本身23。相比之下，从珊瑚中分离出的有益微生物已被证实对宿主健康具有关键作用。然而，为了评估这些潜在益生菌可能带来的负面副作用，并筛选其代谢能力以提升共生体的适应性，仍需进一步深入研究。在此背景下，诸如对珊瑚病原体具有抗菌活性、能够产生过氧化氢酶以应对氧化应激、具备降解尿素的能力（尿素可能在钙化过程中发挥重要作用），以及含有赋予潜在有益特性的基因等特征，应成为研究的重点。本文展示了如何利用生物修复与益生菌技术协同减轻污染影响并增强珊瑚健康。开发可用于增强海洋物种存续能力的创新干预方法，是迈向更可持续、更健康地球的重要一步。

<table><tbody><tr><td>500 mL PYREX 培养基储存瓶</td><td>thomas scientific/Corning</td><td>1743E20/1395-500</td><td>用于采集水样。</td></tr><tr><td>500 mL 抽滤瓶</td><td>thomas scientific/Corning</td><td>1234B28/1220-2X</td><td>用于分离油相组分。</td></tr><tr><td>6 英寸钢丝钳</td><td>thomas scientific/Restek</td><td>1173Y64/23033</td><td>用于切割珊瑚片段。</td></tr><tr><td>17a-乙炔雌二醇</td><td>LGC Standards</td><td>DRE-C13245100</td><td>用作唯一碳源以制备选择性培养基。</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Himedia</td><td>PCT0901-1KG</td><td>用于制备固体培养基。</td></tr><tr><td>Bushnell Haas 肉汤</td><td>Himedia</td><td>M350-500G</td><td>用作基础培养基，需添加碳源进行补充。</td></tr><tr><td>锥形瓶</td><td>thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble)</td><td>4882H35/26500-125</td><td>用于将珊瑚匀浆与玻璃珠共同孵育。</td></tr><tr><td>GFX PCR DNA 及凝胶条带纯化试剂盒</td><td>GE Healthcare</td><td>28903470</td><td>用于在送测序前纯化 PCR 产物。</td></tr><tr><td>玻璃珠</td><td>MP Biomedicals</td><td>1177Q81/07DP1070</td><td>用于从珊瑚结构上解离微生物。</td></tr><tr><td>超净工作台</td><td></td><td></td><td>用于实现无菌操作。</td></tr><tr><td>LB 肉汤，Miller 型（Miller Luria Bertani 肉汤）</td><td>Himedia</td><td>M1245-1KG</td><td>用作营养丰富的培养基以培养细菌。</td></tr><tr><td>海水琼脂 2216（Zobell 海水琼脂）</td><td>Himedia</td><td>M384-500G</td><td>用作营养丰富的培养基以培养细菌。</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td></td><td></td><td>用于孵育液体培养基和油类样品。</td></tr><tr><td>平板培养箱</td><td></td><td></td><td>用于孵育平板。</td></tr><tr><td>瓷制研钵和研杵</td><td>Thomas scientific/United Scientific Supplies</td><td>1201U69/JMD150</td><td>用于研磨珊瑚片段制成匀浆。</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 荧光计</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>用于 DNA 和 PCR 产物的核酸定量。</td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td></td><td></td><td>用于离心细菌培养物。</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td></td><td></td><td>用于测定细菌培养物的光密度。</td></tr><tr><td>Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>用于微生物菌株的 DNA 提取。</td></tr></tbody></table>

用于宏生物体研究与保护的生物修复及益生菌开发微生物菌株筛选

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

污染影响着所有生物群落。海洋环境受到的影响尤为严重，特别是珊瑚礁——这是地球上最敏感的生态系统之一。全球有45亿人的经济依赖海洋，其中大部分生计由珊瑚礁提供。珊瑚具有极其重要的生态价值，因此其灭绝将导致灾难性后果。目前存在多种可能的解决方案来修复海洋污染物和局部污染，包括生物修复。生物修复是指生物体降解污染物的能力。该方法具有多项优势，例如可持续性、相对较低的成本，并且可应用于不同生态系统，对环境造成的影响极小。此外，调控内生微生物组（包括珊瑚潜在有益微生物，pBMCs）可能对海洋动物产生益生作用。在此背景下，结合使用生物修复与pBMC接种的双重策略可能具有广阔前景。该策略既能促进降解对珊瑚及其他多细胞生物有害的特定污染物，同时还能增强宿主应对污染及其他威胁的抗性和恢复力。本方法聚焦于筛选能够降解两种污染物的pBMCs：合成雌激素17α-乙炔基雌二醇（EE2）和原油。这两种物质均已被报道对包括珊瑚在内的海洋生物以及人类产生负面影响。本实验方案描述了如何分离并检测能够降解特定污染物的细菌，随后介绍如何鉴定这些共生微生物对珊瑚宿主的潜在有益特性。此处所述的方法相对廉价、易于操作且高度可适配。几乎任何类型的可溶性目标化合物均可替代EE2和石油进行研究。

根据本文所述方法，能够从不同水源和珊瑚小枝中分离出具有假定BMC特性的微生物，这些微生物能够降解多种类型的污染物（图1）。利用在里约热内卢联邦大学环境卫生成实验中心（CESA-UFRJ）采集的污水处理厂水样，并依据本文所述实验流程，共分离出33株能够在5 mg/L终浓度下降解雌二醇（EE2）的细菌菌株（图2A）。此外，通过筛选石油降解菌的技术，还分离出20株能够同时降解oWSF（图2B）和oWIF（图2C）的菌株。
在不同条件下从多种珊瑚物种中分离出的微生物中筛选出具有潜在BMC特性的菌株。其中，发现一株对珊瑚病原菌Vibrio coralliilyticus具有强烈拮抗活性的菌株（图3A），一些能够降解尿素的菌株（图3B），一株具有优良过氧化氢酶生产能力的菌株（图3C），以及携带潜在有益基因的微生物（图3D）。
结合使用两种方法（即生物修复和BMC接种），可以保护珊瑚免受石油暴露的影响。为此，将从珊瑚Mussismilia harttii中分离得到的石油生物修复菌pBMC复合群接种于暴露于1%石油的珊瑚断枝上，每组三个重复21。暴露于石油的处理组从第4天开始，Fv/Fm值持续下降，到第10天时接近零。可变荧光/最大荧光（Fv/Fm）反映了虫黄藻光系统II（PSII）的最大光化学效率，是珊瑚健康状况的间接指标。相比之下，接种了该复合菌群的水族箱中的珊瑚断枝则保持了较好的光化学能力（图4）。
<img alt="从水体和珊瑚中分离细菌；包括匀浆、涂布和平板培养、DNA分型等步骤的流程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：生物修复菌-珊瑚黏液共生菌（pBMC）群落筛选与构建主要步骤的概要。污染物降解微生物筛选步骤示意图（灰色部分），以及用于最终群落微生物筛选的步骤（DNA测序、生长曲线测定、拮抗试验和群落构建，以红色标示）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌菌落生长实验、培养皿示意图、菌落形态比较、微生物学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：污染物降解菌的筛选。（A）在以 EE2 为唯一碳源的最低培养基平板上生长的细菌分离株。（B）在以 oWSF 为唯一碳源的最低培养基平板上生长的细菌菌落。（C）在以 oWIF 为唯一碳源的最低培养基平板上生长的细菌菌落。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="抑菌试验、细菌生长和凝胶电泳结果；微生物学实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：pBMC 特征的检测。（A）菌株对珊瑚病原菌 Vibrio coralliilyticus（黑色）表现出拮抗活性的三重复点样结果，以及对照菌株（绿色）的结果。（B）在以尿素作为唯一碳源的培养基上生长的菌株。（C）产生过氧化氢酶的菌株（+）和过氧化氢酶产生能力差的菌株（-）。（D）nirK 基因 PCR 检测示例（泳道1 = 1kb DNA 标准 Marker；泳道2 = 空白 DNA 提取阴性对照；泳道3 = nirK 基因检测；泳道4 = 无模板 DNA 的 PCR 反应）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="叶绿素荧光分析图，对照组与油处理组在10天内的Fv/Fm比值。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：使用潜水式PAM叶绿素荧光仪测定 M. harttii 枝段在下午5点暗适应后的Fv/Fm值。 对照组、油处理组以及油+菌群处理组的Fv/Fm测量值每天进行三次重复，持续10天。图中显示标准偏差。本图部分图形特征经许可改编自先前研究成果21，原文发表于 https://www.nature.com/articles/srep18268，采用知识共享署名4.0许可协议。完整条款见 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>作用机制</td>
			<td>微生物</td>
			<td>检测技术</td>
			<td>参考文献</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">气候调节；硫循环；抗菌化合物；增强细胞抗氧化保护能力。</td>
			<td>Aspergillus sydowii</td>
			<td>针对 dddP 基因的 PCR</td>
			<td>81</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudovibrio sp. P12</td>
			<td>含二甲基巯基丙酸（DMSP）的培养基</td>
			<td>82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudoalteromonas sp.</td>
			<td>针对 dmdA 基因的 PCR</td>
			<td>33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">对病原体的生物调控。</td>
			<td>鹿角杯形珊瑚（Acropora palmata）黏液中的微生物组</td>
			<td>抑菌圈法</td>
			<td>83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>珊瑚提取物</td>
			<td>生长抑制实验</td>
			<td>84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marinobacter sp.</td>
			<td>群集运动实验</td>
			<td>85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudoalteromonas sp.</td>
			<td>琼脂平板交叉划线法</td>
			<td>86</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudoalteromonas sp.</td>
			<td>琼脂扩散法</td>
			<td>33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">促进钙化过程；为石珊瑚提供氮源。</td>
			<td>Symbiodinium spp.</td>
			<td>比色法</td>
			<td>87</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>柱状珊瑚（Stylophora pistillata）黏液中的微生物组</td>
			<td>___</td>
			<td>88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>艾氏鹿角珊瑚（Acropora alciminata）中的微生物组</td>
			<td>Bolland 等人80的方法</td>
			<td>89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">氮循环；增强固氮作用。</td>
			<td>微生物群落</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>微生物群落</td>
			<td>PCR</td>
			<td>91</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>微生物群落</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>92</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>微生物群落</td>
			<td>改良乙炔（C2H2）还原法</td>
			<td>93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudoalteromonas sp. 和 Halomonas taeanensis</td>
			<td>PCR</td>
			<td>33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">氮循环；降低铵根离子浓度。</td>
			<td>Pseudoalteromonas sp.</td>
			<td>PCR</td>
			<td>33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubastraea coccinea 微生物组</td>
			<td>PCR</td>
			<td>94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xestospongia testudinaria 微生物组</td>
			<td>预测性宏基因组分析</td>
			<td>95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">全共生体对活性氧（ROS）的防护作用。</td>
			<td>Pseudoalteromonas sp.、Cobetia marina 和 Halomonas taeanensis</td>
			<td>过氧化氢酶试验</td>
			<td>33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symbiodinium spp.</td>
			<td>Amplex red 法</td>
			<td>96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio pelagius 和 Sync-chococcus sp.</td>
			<td>辣根过氧化物酶-伞形酮法</td>
			<td>97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio fischeri</td>
			<td>多种方法</td>
			<td>98</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：假定BMC特征的检测、作用机制（MOA）、报道的具有该潜力的微生物以及用于检测该特征的技术。

污染影响着所有生物群落。海洋环境受到的影响尤为严重，特别是珊瑚礁，这是地球上最敏感的生态系统之一。生物修复是指生物降解污染物的能力。本文介绍了分离和检测具有生物修复能力以及潜在益生特性的珊瑚共生微生物的方法学。

污染影响着所有生物群落。海洋环境受到的影响尤为严重，特别是珊瑚礁，作为地球上最敏感的生态系统之一。

我们可以分离并构建既能促进珊瑚健康，又能同时减轻污染影响的益生菌，从而有助于珊瑚礁在不断变化的环境中持续生存。所述的分离与筛选方法可用于选择具有关键代谢活性的微生物，例如降解污染物的能力，或其他对珊瑚等海洋生物有益的特性。该方法可应用于分离能够降解各类污染物的微生物。此外，还可以利用其他环境样品中的材料来源，例如植物、土壤、水体等各类样本。查阅相关文献，尝试将重点放在那些可能适合作为候选菌株的微生物上。如果条件允许，应针对这些目标菌株设计分离方法，并避免已知的病原菌。如果计划使用细菌群落，首先研究群落成员之间是否存在拮抗活性也非常重要。由于珊瑚面临日益加剧的灭绝风险，该方法已开始在全球范围内得到应用，因此有必要推广并标准化该技术。由于部分珊瑚研究人员缺乏传统微生物学经验，他们经常就如何开展此类研究寻求建议。首先，从每个目标采样点使用带螺口盖的无菌瓶平行采集 500 毫升水样。若稍后进行样品处理，需将样品瓶保存在 4°C 条件下。使用无菌的镊子和钳子从与水样相同的采样点剪取珊瑚碎片。用20毫升无菌3%盐水溶液或人工海水冲洗样品珊瑚碎片，以去除海水中松散附着的自由生活细菌。使用镊子将每块珊瑚碎片放入含有无菌盐水溶液并带螺帽的无菌容器中。用无菌镊子和钳子在称重天平上的无菌培养皿中称取五克珊瑚碎片。将五克珊瑚样品转移至无菌研钵中，使用无菌研杵进行研磨。用无菌刮勺将研磨后的样品转移至含有25毫升3%氯化钠无菌溶液和10至15颗直径为2.5毫米玻璃珠的无菌培养瓶中。用20毫升无菌生理盐水冲洗研钵，并将冲洗液全部转移至培养瓶中，以最大限度回收研磨液。为了从不同珊瑚区室中分离微生物，将锥形瓶置于采样点水温条件下，以150 ×g持续振荡16小时。为筛选细菌，首先在无菌生理盐水中对珊瑚样品进行梯度稀释至10⁻⁹，对水样稀释至10⁻⁶。在丢弃枪头前，将稀释液上下吹打五次。然后涡旋混匀每个样品。每次进行下一步连续稀释前，均需将样品涡旋混匀5秒。用移液器吸取100 µL每种稀释液，分别加入含有3%氯化钠的LB琼脂培养基的培养皿中，并进行涂布。将平板在目标温度下（例如 26 °C）孵育一至三天。每天观察一次平板。采用划线平板法，挑选并分离在新平板上呈现明显不同生长形态的菌落。根据需要重复此步骤，直至平板上长出纯菌落。按照文中的描述，将分离菌株保存于4摄氏度或甘油中。为进行雌二醇（EE2）降解能力测试，从新鲜平板上挑取单菌落，接种于含有2毫升无菌LB培养基的试管中。如果是甘油菌种保存液，取10微升甘油菌液，划线接种于LB琼脂平板上。在24至28摄氏度下培养过夜，以获得单菌落。将装有LB培养基的试管置于倾斜位置，在24至28摄氏度下以150 ×g 持续振荡培养过夜。细菌培养后，在室温下以 8,000 × g 离心八分钟，收集细胞沉淀。弃去上清液。为洗涤残留的 LB 肉汤，加入两毫升生理盐水重悬细胞。重复洗涤两次，以确保无碳源残留。将洗涤后重悬的细胞接种于仅以雌二醇（EE2）为唯一碳源的最低量Bushnell Haas培养基中。通过在600纳米处测定光密度，并在LB琼脂培养基上测定菌落形成单位，评估细菌在培养16至72小时后的生长情况。为了制备以原油的油水可溶组分和油水不溶组分作为唯一碳源的最低限度培养基，将1-2%的原油加入含有底部阀门的滤瓶中的500毫升无菌蒸馏水中。将滤瓶置于24至28摄氏度条件下，以150×g持续振荡48小时。之后，将滤瓶放置在稳定的平面上，静置10至20分钟，使可溶组分与不溶组分分离。然后打开底部的滤瓶，将油水可溶部分转移至新的无菌瓶中，并保留油水不溶部分。接着准备两瓶布什内尔-哈斯琼脂最低培养基，进行高压灭菌。以油水可溶组分作为唯一碳源，配制500毫升琼脂培养基。同样地，以油水不溶组分进行操作，并将每种培养基各约25毫升转移至各自的培养皿中。为分离降解石油的细菌，重复使用先前稀释的样品，用移液器将每种稀释液100微升接种到含有琼脂培养基的培养皿中并进行平板培养。请务必为您的培养皿保留阴性对照。将培养皿在目标温度下孵育一至三天，并重复之前的分离步骤。在本方案中，微生物是从不同的水源和具有假定 BMC 特征并能够降解不同类别污染物的珊瑚碎枝中分离得到的。利用从里约热内卢联邦大学环境卫生实验中心获得的污水处理厂水样，分离出33株能够降解EE2的细菌菌株。此外，采用筛选石油降解菌的技术，分离出20株能够降解油-水可溶组分和油-水不溶组分的菌株。在微生物中筛选了潜在的BMC特性，发现其中一株对珊瑚病原菌霍乱弧菌裂解型（Vibrio cholerae lyticus）具有强拮抗活性，还发现了能够降解尿素的菌株、过氧化氢酶高产菌株，以及携带潜在有益基因的微生物。通过结合生物修复与BMC接种，可预测珊瑚受石油暴露影响的情况。从珊瑚中分离出的石油生物修复菌群PBMC被接种于暴露于1%石油的珊瑚碎片上，结果显示其光化学能力的保持优于未接种的珊瑚健康状况。不要将样品在室温下放置过久，否则微生物群落可能发生改变，与疾病相关的微生物可能过度生长并抑制其他微生物。原油具有毒性。在处理此类或其他任何污染物时，请务必使用适当的个人防护装备。该技术为珊瑚修复和海洋生物修复领域开辟了创新途径，有望减轻全球变化所造成的经济、生态和社会影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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