用于宏生物体研究与保护的生物修复及益生菌开发微生物菌株筛选

我们可以分离并构建既能促进珊瑚健康，又能同时减轻污染影响的益生菌，从而有助于珊瑚礁在不断变化的环境中持续生存。所述的分离与筛选方法可用于选择具有关键代谢活性的微生物，例如降解污染物的能力，或其他对珊瑚等海洋生物有益的特性。该方法可应用于分离能够降解各类污染物的微生物。

此外，还可以利用其他环境样品中的材料来源，例如植物、土壤、水体等各类样本。查阅相关文献，尝试将重点放在那些可能适合作为候选菌株的微生物上。如果条件允许，应针对这些目标菌株设计分离方法，并避免已知的病原菌。

如果计划使用细菌群落，首先研究群落成员之间是否存在拮抗活性也非常重要。由于珊瑚面临日益加剧的灭绝风险，该方法已开始在全球范围内得到应用，因此有必要推广并标准化该技术。由于部分珊瑚研究人员缺乏传统微生物学经验，他们经常就如何开展此类研究寻求建议。

首先，从每个目标采样点使用带螺口盖的无菌瓶平行采集 500 毫升水样。若稍后进行样品处理，需将样品瓶保存在 4°C 条件下。使用无菌的镊子和钳子从与水样相同的采样点剪取珊瑚碎片。

用20毫升无菌3%盐水溶液或人工海水冲洗样品珊瑚碎片，以去除海水中松散附着的自由生活细菌。使用镊子将每块珊瑚碎片放入含有无菌盐水溶液并带螺帽的无菌容器中。用无菌镊子和钳子在称重天平上的无菌培养皿中称取五克珊瑚碎片。

将五克珊瑚样品转移至无菌研钵中，使用无菌研杵进行研磨。用无菌刮勺将研磨后的样品转移至含有25毫升3%氯化钠无菌溶液和10至15颗直径为2.5毫米玻璃珠的无菌培养瓶中。用20毫升无菌生理盐水冲洗研钵，并将冲洗液全部转移至培养瓶中，以最大限度回收研磨液。

为了从不同珊瑚区室中分离微生物，将锥形瓶置于采样点水温条件下，以150 ×g持续振荡16小时。为筛选细菌，首先在无菌生理盐水中对珊瑚样品进行梯度稀释至10⁻⁹，对水样稀释至10⁻⁶。在丢弃枪头前，将稀释液上下吹打五次。

然后涡旋混匀每个样品。每次进行下一步连续稀释前，均需将样品涡旋混匀5秒。用移液器吸取100 µL每种稀释液，分别加入含有3%氯化钠的LB琼脂培养基的培养皿中，并进行涂布。

将平板在目标温度下（例如 26 °C）孵育一至三天。每天观察一次平板。采用划线平板法，挑选并分离在新平板上呈现明显不同生长形态的菌落。

根据需要重复此步骤，直至平板上长出纯菌落。按照文中的描述，将分离菌株保存于4摄氏度或甘油中。为进行雌二醇（EE2）降解能力测试，从新鲜平板上挑取单菌落，接种于含有2毫升无菌LB培养基的试管中。

如果是甘油菌种保存液，取10微升甘油菌液，划线接种于LB琼脂平板上。在24至28摄氏度下培养过夜，以获得单菌落。将装有LB培养基的试管置于倾斜位置，在24至28摄氏度下以150 ×g 持续振荡培养过夜。

细菌培养后，在室温下以 8,000 × g 离心八分钟，收集细胞沉淀。弃去上清液。为洗涤残留的 LB 肉汤，加入两毫升生理盐水重悬细胞。

重复洗涤两次，以确保无碳源残留。将洗涤后重悬的细胞接种于仅以雌二醇（EE2）为唯一碳源的最低量Bushnell Haas培养基中。通过在600纳米处测定光密度，并在LB琼脂培养基上测定菌落形成单位，评估细菌在培养16至72小时后的生长情况。

为了制备以原油的油水可溶组分和油水不溶组分作为唯一碳源的最低限度培养基，将1-2%的原油加入含有底部阀门的滤瓶中的500毫升无菌蒸馏水中。将滤瓶置于24至28摄氏度条件下，以150×g持续振荡48小时。之后，将滤瓶放置在稳定的平面上，静置10至20分钟，使可溶组分与不溶组分分离。

然后打开底部的滤瓶，将油水可溶部分转移至新的无菌瓶中，并保留油水不溶部分。接着准备两瓶布什内尔-哈斯琼脂最低培养基，进行高压灭菌。

以油水可溶组分作为唯一碳源，配制500毫升琼脂培养基。同样地，以油水不溶组分进行操作，并将每种培养基各约25毫升转移至各自的培养皿中。为分离降解石油的细菌，重复使用先前稀释的样品，用移液器将每种稀释液100微升接种到含有琼脂培养基的培养皿中并进行平板培养。

请务必为您的培养皿保留阴性对照。将培养皿在目标温度下孵育一至三天，并重复之前的分离步骤。在本方案中，微生物是从不同的水源和具有假定 BMC 特征并能够降解不同类别污染物的珊瑚碎枝中分离得到的。

利用从里约热内卢联邦大学环境卫生实验中心获得的污水处理厂水样，分离出33株能够降解EE2的细菌菌株。此外，采用筛选石油降解菌的技术，分离出20株能够降解油-水可溶组分和油-水不溶组分的菌株。在微生物中筛选了潜在的BMC特性，发现其中一株对珊瑚病原菌霍乱弧菌裂解型（Vibrio cholerae lyticus）具有强拮抗活性，还发现了能够降解尿素的菌株、过氧化氢酶高产菌株，以及携带潜在有益基因的微生物。

通过结合生物修复与BMC接种，可预测珊瑚受石油暴露影响的情况。从珊瑚中分离出的石油生物修复菌群PBMC被接种于暴露于1%石油的珊瑚碎片上，结果显示其光化学能力的保持优于未接种的珊瑚健康状况。

不要将样品在室温下放置过久，否则微生物群落可能发生改变，与疾病相关的微生物可能过度生长并抑制其他微生物。原油具有毒性。

在处理此类或其他任何污染物时，请务必使用适当的个人防护装备。该技术为珊瑚修复和海洋生物修复领域开辟了创新途径，有望减轻全球变化所造成的经济、生态和社会影响。