结合人工授粉、显微观察与遗传分析的杏自交与异交亲和性关系测定

该方法有助于确定不同物种的授粉需求，并建立品种间的不亲和关系。此方法的主要优势在于，可在实验室条件下评估多种不亲和性，避免田间试验中可能出现的诸多问题。

这有助于鉴定并确定多个栽培品种所属的相应不亲和性组别，明确栽培品种之间的互亲和性关系。该方法还可用于确定其他果树作物（如樱桃或李子）中的自交不亲和性及不亲和性关系。

首先在田间采集花朵。在花蕾呈气球状时进行采集，即杏树发育的BBCH 58期，以避免发生前期授粉。在实验室中，去除花朵的雄蕊，并将其放置在纸张上，于室温下干燥。

24小时后，使用26毫米的细筛过滤花粉粒。对每组自交和异交授粉的花朵，在相同的气球状发育阶段去除30朵花的雄蕊，并在去雄后24小时将雌蕊置于盛水的花艺泡沫中，用毛笔蘸取同品种花朵的花粉为雌蕊授粉。另取每种品种的一组雌蕊，用来自相容授粉品种花朵的花粉进行授粉，作为对照。

72 小时后，将枪状结构从湿润的花泥中取出，并在体积比为 3:1 的乙醇-冰醋酸固定液中固定，4 摄氏度条件下至少固定 24 小时。随后弃去固定液，加入 75% 乙醇，确保样品完全浸没于溶液中。样品可在 4 摄氏度条件下保存于乙醇中，直至后续使用。

将用于对照授粉的相同品种的花粉粒撒在固化的花粉萌发培养基中，24小时后在显微镜下观察。将雌蕊用蒸馏水洗涤三次，每次一小时，以制备显微观察样品。最后一次洗涤后，将其置于4摄氏度的5%亚硫酸钠溶液中24小时。

然后在亚硫酸钠溶液中，于1 kg/cm²压力下高压灭菌10分钟以软化组织。将灭菌后的雌蕊置于载玻片上，用解剖刀去除子房周围的毛状体，再用盖玻片压片。

在制片上滴加一滴苯胺蓝，对花粉管生长过程中胼胝质沉积物进行染色，并根据手稿说明，使用显微镜观察花粉管在花柱中的生长情况。使用商业试剂盒从春季采集的幼嫩叶片中提取基因组DNA。随后根据手稿说明，混合试剂配制PCR反应体系。

将反应混合物涡旋混匀，并将其分配到PCR板的各孔中。向每孔加入1微升DNA稀释液，然后按照文稿中所述的热循环程序运行PCR。反应完成后，使用毛细管电泳或琼脂糖凝胶电泳分析结果。

进行毛细管电泳时，取1微升PCR产物加入读板的孔中，并加入一滴矿物油以防止水分蒸发。然后通过加入分离缓冲液制备分离板。使用基因分析仪的商用软件创建新的样品板，并保存板上所有孔的样品名称。

然后选择分析方法，将两块板插入基因分析仪中。用蒸馏水填充毛细管阵列。加载线性聚丙烯酰胺凝胶，然后点击运行。

若通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果，按照文稿说明，将琼脂糖溶解于电泳运行缓冲液中，制备1%琼脂糖凝胶。然后向凝胶中加入4 µL核酸染料，并轻轻混匀。将凝胶托盘装上梳子，缓慢将凝胶倒入中间位置，注意避免产生气泡。

将凝胶在室温下静置，直至完全凝固，约需30-45分钟。然后放入电泳槽中。拔出梳子，并用1x TAE缓冲液覆盖。

先加入DNA分子量标记，然后加入与上样染料混合的PCR产物上样至凝胶。随后以90伏电压电泳60-90分钟，直至蓝色染料迁移至凝胶泳道约75%的位置。电泳结束后，使用凝胶成像仪观察结果。

通过荧光显微镜观察自花授粉与异花授粉中的花粉管生长情况，以确定每个品种的自交亲和性。当花粉管生长受阻时，该品种被视为自交不亲和；当至少有一根花粉管到达花柱基部时，则视为自交亲和。采用5对引物组合，通过PCR结合毛细管电泳或凝胶电泳来鉴定S等位基因。

首先，使用 SRc 引物对扩增 S-RNase 的第一个内含子以鉴定 S 等位基因。然后，利用三对引物扩增 RNase 的第二个内含子，以区分 S6、S9、S1 和 S7 等位基因。此外，使用 AprFBC8 引物对扩增 SFB 基因的 V2 和 HVB 可变区，以鉴定 Sc 和 S8 等位基因。

在鉴定出S等位基因后，可根据基因型建立不同的不亲和组，组内基因型相互不亲和。进行毛细管电泳时必须使用对照，因为自动片段分析系统可能会报告出更多的片段大小差异，从而导致等位基因鉴定不准确。显微镜观察与遗传分析相结合，已成为鉴定杏树自交不亲和性以及明确品种间不亲和关系的一种非常有效的方法。

自交不亲和性现已成为杏地方品种之间的关联因素。相关决定因子似乎参与其中。未来的研究工作应集中于杏这一栽培品种的遗传改良。

这种文献记录方法的结合可为商业果园中栽培品种的适当选择以及杏育种项目中的基因型模式提供有价值的信息。类似的方法也可应用于其他木本多年生作物。