Name: 标准化一种非致命方法，以描述淡水贝类的生殖状况和幼虫发育（比瓦尔维亚:联合达） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 了解淡水贝类非致命采样技术，用于评估Hyriidae、Margaritiferidae和Unionidae科物种的生殖状况与幼虫发育阶段。该方法支持濒危物种保护与恢复研究。

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作者谨此感谢资助机构：美国鱼类及野生动物管理局和美国地质调查局。特别感谢安德鲁·哈茨戈（Andrew Hartzog）和桑德拉·珀西富尔（Sandra Pursifull）在组织野外工作团队和数据收集方面所做的贡献，同时感谢劳伦·帕特森（Lauren Patterson）和克里斯·安德森（Chris Anderson）在数据库开发中的宝贵工作。我们还要感谢所有在野外和实验室提供帮助的人员，包括谢里·博斯蒂克（Sherry Bostick）、马克·坎特雷尔（Mark Cantrell）、萨海尔·凯斯博尔特（Sahale Casebolt）、乔丹·霍尔科姆（Jordan Holcomb）、霍华德·耶尔克斯（Howard Jelks）、加里·马洪（Gary Mahon）、约翰·麦克劳德（John McLeod）、凯尔·穆恩（Kyle Moon）、凯拉·莫宁斯塔（Cayla Morningstar）、艾玛·皮斯托尔（Emma Pistole）、马特·罗（Matt Rowe）、尚宁·圣奥宾（Channing St. Aubin）以及吉姆·威廉姆斯（Jim Williams）。对任何贸易、公司或产品名称的使用仅出于描述目的，并不意味着美国政府的认可。

1. 孕雌性个体采集
注意：关于如何充分调查采样点中的濒危或受威胁物种，请参考美国鱼类和野生动物管理局的淡水蚌类调查方案33。在野外采集受保护物种前，必须获得适当的联邦许可证，且需取得针对所有现存物种的州级许可证。
<ol>
	<li>使用触觉-视觉方法从野外采集活体贻贝（步骤 1.2），或利用博物馆保存的标本（步骤 1.3）。 
	注意：采集后应保持活体贻贝处于低温湿润环境，以防止脱水并减少应激反应；对怀卵雌性贻贝应尽量减少操作，以避免雌体过早释放鳃内物质34。</li>
	<li>可通过采集时的目视检查（例如是否存在触手诱饵、包裹团等）或采集后的目视检查（例如轻轻撬开贝壳至足以观察内部，判断鳃是否膨胀，见图 1）来评估雌体是否怀卵。 
	注意：不同物种在育儿鳃中培育钩介幼虫的方式存在差异，有时仅两个外侧鳃（外鳃，ectobranchus）、仅两个内侧鳃（内鳃，endobranchus）或全部四个鳃（四源型，tetragenous）具有育儿功能17。本方案可在此暂停，怀卵雌体可运送回实验室进行鳃组织取样。</li>
</ol>
<img alt="贻贝恢复过程；在野外研究设置中，用手检查贻贝壳的健康状况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60244/60244fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：轻柔地撬开个体。 为检查活体贻贝的抱卵情况，可用拇指轻轻撬开其壳瓣（A），或谨慎使用窥器或反向钳子将壳瓣撬开（B）。有关此方法的注意事项，请参阅方案中的步骤 2.3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60244/60244fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>通过打开保存标本的壳瓣并检查鳃部，进行肉眼观察，以确定该个体是否为怀卵雌性（图2）。</li>
</ol>
<img alt="贝类解剖图，内部结构高亮，用于生物学研究分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60244/60244fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：如何识别怀卵雌性个体。 当雌性蚌类处于怀卵并育幼状态时，其育儿囊鳃会呈现膨胀状态。照片 A 和 C 从侧面展示鳃的结构，而照片 B 和 D 则提供鳃的腹面观。红色框线标出鳃部区域，以突出显示怀卵（A/B）与非怀卵（C/D）雌性 Lampsilis straminea 蚌的差异。个体总长度分别为 79 mm（A/B）和 88 mm（C/D）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60244/60244fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 鳃组织取样
注意：本方案可根据采样情况调整，适用于在野外和实验室中对活体贻贝进行采样，也适用于对保存的标本进行采样。
<ol>
	<li>准备一个1.5 mL塑料微量离心收集管，若计划在提取后24小时内检测鳃内容物，则加入约1 mL无菌水35；若无法在采集后24小时内完成样本检测，或鳃内容物来自用乙醇（EtOH）保存的博物馆标本，则使用乙醇。若钩介幼虫将用于扫描电子显微镜（SEM）成像，请使用70%乙醇；若钩介幼虫将用于遗传检测，请使用未变性的95%乙醇36。</li>
	<li>取一支无菌的10 mL注射器，其上装有20 G斜面针头，拆除纸包装。旋开针帽以暴露针头，并准备一个1.5 mL塑料管用于收集鳃内容物。将注射器推杆完全推到底，使黑色活塞位于0 mL/cc刻度线处。 
	注意：每次采集鳃内容物时均应使用新的无菌注射器。使用过的注射器可在野外进行消毒，方法是将针尖浸入10%次氯酸钠溶液中，然后用1 mL无菌水冲洗注射器（即吸入1 mL无菌水后再将活塞推回至0 mL/cc），最后用干净的布擦干注射器。</li>
	<li>拿起怀卵雌体，用拇指指尖轻轻撬开两片壳瓣。 
	警告：操作时需小心，避免伤害动物。过度或过快地打开壳瓣会过度拉伸闭壳肌，导致个体死亡。薄壳标本（例如Anodonta、Leptodea、Utterbackia等物种）以及幼体在此步骤中尤为脆弱。对壳质脆弱的物种强行操作可能导致壳破裂并致死。在某些情况下，从壳的前后缘轻轻挤压个体，同时观察其腹面，可使壳发生弹性变形而微微张开，从而便于观察鳃组织或撬开壳瓣，避免损伤脆弱的壳缘。 
	注意：可使用工具辅助此步骤，但若操作不当也可能导致死亡，因此应尽可能避免使用。例如，可使用阴道扩张器或改装的反向钳夹辅助打开个体，也可使用楔形物支撑壳瓣保持张开状态。如果有另一人协助，则这些工具可能并非必需（例如一人固定张开的壳，另一人操作注射器进行提取）。损伤或使外套膜组织与壳表层分离可能导致生长畸形和死亡37；因此，必须避免切断外套膜组织与壳外缘之间的连接。</li>
	<li>用注射器针头轻轻刺入膨大的育儿鳃中的单个水管。随后利用针头的斜面边缘轻柔地刮取鳃内容物。 
	注意：鳃内容物通常呈乳白色，可在针头斜面上清晰观察到。
	<ol>
		<li>若显微镜 readily available，可直接将注射器内容物排入培养皿中。否则，将样本保存于含指定液体（见步骤2.1）的1.5 mL塑料微量离心管中，以备后续分析。 
		注意：在运输过程中应尽量减少对钩介幼虫样本的扰动和操作，以避免损伤及降低存活率32,35。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录以下信息：属种鉴定、怀卵状态、雌体长度（mm）、采集人及联系方式、州、县、流域、具体采集地点、经纬度、鳃样本的唯一标识符、调查点的唯一标识符，以及采集日期（如已提取鳃内容物）（图3）。在每个采集容器上标注唯一标识符，以确保运输过程中数据记录的准确性。
	<ol>
		<li>拍摄蚌体右侧外壳外表面的照片，用于身份验证，并确保照片中包含清晰可读的、标注有唯一标识符的标签。可选地，采集其他非生物和生物参数，以补充有关蚌所处环境及其群落的信息（参见 图3 中的建议）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="美国地质调查局贻贝繁殖状态数据表，用于记录性别、物种和环境数据的研究表格。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60244/60244fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：野外繁殖状态数据表示例。 若采集鳃组织样本，则必须准确报告数据，以获得可靠的信息。此表为野外数据表的示例，列出了每份鳃组织样本应同时采集的最少必填字段及额外的非生物参数。如需更详细的信息，请参阅实验方案中的步骤4.1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60244/60244fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 鳃组织内容物的实验室评估
<ol>
	<li>如果鳃内容物在1.5 mL离心管中，将其转移至培养皿，并加水至铺满皿底。轻轻以圆形轨迹旋转培养皿，使内容物聚集于皿中央，以便更集中地观察样本。 
	注意：若鳃内容物粘附在管壁上，可能需要使用装有水的冲洗瓶或移液器冲洗离心管，以确保内容物完全转移。</li>
	<li>将培养皿置于解剖显微镜下观察样本。如有可能，在显微镜下拍摄鳃样本照片，并用该样本的唯一标识符进行标记。
	<ol>
		<li>记录每个鳃样本中存在的各个发育阶段。以图4为参考，对各发育阶段进行鉴定。在某些情况下，雌性个体可能同时孵育多个发育阶段的幼虫；因此，应报告在特定样本中观察到的所有发育阶段（例如，“EGG/DG/IMG/FDG”）。完成对保存的钩介幼虫的评估后，进入第4节。若鉴定出完全发育的钩介幼虫且未使用乙醇保存，则进入步骤3.3。 
		注意：EGG，卵团；DG，发育中的钩介幼虫；IMG，未成熟的钩介幼虫；FDG，完全发育的钩介幼虫。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="显微镜图像中的静力平衡概念；种子结构分析；示意图；显示比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60244/60244fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：育囊鳃中不同发育阶段钩介幼虫的形态示意图。（A）卵团（EGG）具有一层膜，使卵聚集在一起。在每个卵膜内，存在一个不透明的球形细胞分化团块。在早期细胞分裂过程中，该不透明球形团块可能分裂为多个球形团块，但在观察到明显的双壳形态之前，仍应记录为卵阶段（EGG）。（B）未成熟钩介幼虫（IMG）在卵膜内已形成明确的双壳状结构。（C）发育中钩介幼虫（DG）具有明显的双壳形态，无卵膜包裹，内部组织尚未分化，外观常呈模糊状。发育中钩介幼虫（DG）在接触 NaCl 时无反应，在记录数据时归类为“DG(T)”。（D）完全发育钩介幼虫（FDG）具有明显的双壳形态，并具有清晰可见的闭壳肌组织，使其能够闭合。固定后常可见完全发育钩介幼虫（FDG）呈两瓣张开状态。当暴露于 NaCl 时，两瓣通常会迅速闭合，或先张开再闭合，此类个体在记录时归类为“FDG(T)”。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60244/60244fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>通过向鳃样本的一部分液滴中加入一粒氯化钠（NaCl）晶体，进行氯化钠（NaCl）测试，以进一步评估完全发育的钩介幼虫的活力35。有活力的钩介幼虫在接触NaCl后会从张开状态闭合其壳瓣。记录数据时，应在经过盐测试的钩介幼虫名称末尾标注‘(T)’。 
	注意：完全发育的钩介幼虫也可能在未接触NaCl的情况下被观察到主动开合。</li>
</ol>
4. 报告至数据库
<ol>
	<li>访问 FMGA 网站（http://arcg.is/089uee），该网站使用在线软件程序开发38,39,40。FMGA 页面提供桌面数据录入表单的链接以及适用于移动设备的应用程序下载。移动应用程序支持在野外进行数据录入和自动地理配准41。 
	注意： gravidity 日历及其他与淡水 mussel 物种生活史事件相关的图形也可在 FMGA 仪表板上找到。
	<ol>
		<li>使用移动应用程序或桌面网站，通过下拉菜单和文本输入字段在数据录入表单中记录结果。对于大型的已有数据集，请联系作者获取模板电子表格。在相应的列标题下输入记录的数据，注意电子表格中的每条记录（即每一行）代表对一个 gravid 个体的鳃样本的观察结果。</li>
		<li>提交结果后，管理员将对数据进行验证，验证通过后数据将被添加至 FMGA 数据库；管理员可能会联系采集者以获取更多细节或照片。 
	注意：一旦数据在 FMGA 数据库中完成验证和汇总，FMGA 仪表板上显示的所有 gravidity 日历及其他交互式图形将自动更新。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

意义
濒危物种的保护依赖于现有种群中成功实现种群补充。在某些情况下，可能需要通过人工繁育来增强这些濒危种群的补充能力。这要求研究人员掌握每个物种繁殖活动的时间，并可能需要应用不同的方法或管理措施，以减轻对种群补充的不利影响。作为一类濒危生物，建立一种标准化且非致死性的研究繁殖习性的方法至关重要，并需提供一个平台，用于整合和可视化数据，向科学界提供最新、最准确的信息。本研究提供了一套逐步操作的实验方案，以确保采取必要的预防措施，并能够从雌性蚌类中充分采集和评估鳃部内容物。该方案已针对致死性和非致死性影响进行了测试，使研究人员和管理者能够负责任地实施该方法。我们还开发了一系列数据库管理工具和应用程序，以促进将妊娠信息整合到一个公开、用户友好的仪表板中。有关流行病学、钩介幼虫形态、生活史、系统发育、繁育及迁移的研究均可受益于这一涵盖所有淡水蚌类物种的时序性妊娠信息数据库，并可加以利用。
本研究不仅支持了以往关于某些物种繁殖习性的研究结果，还揭示了其他物种的新信息。尽管采集到的V. vibex数量少于V. lienosa，但根据妊娠数据仍可发现二者之间存在相似性。Villosa属的这两个物种似乎在一年中的大部分时间都孵育完全发育的钩介幼虫，表明它们属于越冬孵育型。这与以往对其他Villosa物种的研究结果一致43,44,45。本研究结果表明，H. australis从10月开始可发现其处于妊娠状态，并持续越冬至次年6月，但12月未发现妊娠个体。此前一项已发表的研究指出，同属物种H. altilis的妊娠期为每年3月至6月，持续四个月46,47。这一发现说明H. australis的妊娠期比以往认为的更长，总体上可将其归类为越冬孵育型。由于这些物种属于联邦保护物种，H. altilis与H. australis孵育期的差异可能影响管理决策，以在繁殖活跃期更好地保护其种群。Elliptio pullata仅在5月和6月发现其处于妊娠状态并携带EGG，这与其被归类为具有极短孵育期的速生型物种相符24,48,49,50。随着采用本方案积累更多Elliptio属物种的数据，针对特定钩介幼虫发育阶段开展野外工作时，这些详细信息将有助于提高调查效率，因为钩介幼虫每年仅在少数几个月内存在。对于样本量较少的其他物种，目前尚难以做出充分推断，但随着数据库中数据的不断积累，更大的样本量将有助于深入了解更多蚌类物种的繁殖习性。
操作说明
淡水贻贝及其钩介幼虫已知对人为胁迫因素较为敏感10,35。在检查怀卵状态时，贻贝壳瓣可能难以打开，若粗暴强行撬开，可能造成意外伤害，导致个体应激甚至死亡。一些壳质较脆弱的种类（例如Anodonta、Leptodea、Utterbackia等）以及体型较小的个体，其贝壳非常脆弱，闭壳肌也较弱，容易发生断裂或撕裂。若操作不当，鳃组织取样本身也可能成为一种应激源。先前有研究发现，在繁殖活跃期对贻贝进行操作和暴露于空气环境中，可能引发多种生理应激反应，包括鳃腔内容物的提前释放34。然而，另一项采用与本研究相似方法的研究表明，在进行鳃组织取样时操作怀卵雌性贻贝，并不会干扰当前的育幼过程，也不会导致短期或长期育幼种类发生提前释放现象16。此外，本实验方案中必须使用无菌注射器，以避免在穿刺多个个体的鳃组织时造成意外感染或交叉污染。同时，钩介幼虫本身较为脆弱，育幼批次可能已发育成熟并处于应激状态，但尚未排出体外。健康状况不佳的成熟钩介幼虫可能导致在盐水测试中反应的个体数量减少35。在区分DG(T)与FDG(T)时，应使用较大的样本量进行盐水测试，并详细记录观察结果，依据本研究提供的描述仔细辨别DG与FDG钩介幼虫之间的差异。若采取适当的操作防护措施，该操作所引发的应激程度极低，可使雌性贻贝继续自然完成育幼过程，从而降低对种群补充的不利影响。
可记录额外数据以补充数据库，并为淡水 mussel 的繁殖习性提供广泛背景。某些物种（例如 Fusconaia 属物种）已被观察到，其鳃的颜色会随着钩介幼虫（glochidia）发育阶段的不同而变化51。在对雌性个体进行初次怀卵检查时，可在报告数据中包含对鳃颜色的描述，以便未来进一步研究。此外，在本实验方案的此阶段，研究人员可记录怀卵雌性个体是否在两个外侧鳃（ectobranchus）、两个内侧鳃（endobranchus）或全部四个鳃（tetragenous）中育有钩介幼虫17。这些信息可添加至 FMGA 数据库，有助于填补针对各研究物种在育幼行为方面的数据空白。环境条件，特别是水温，可在野外采集并记录，以更全面地观察不同纬度范围内物种的怀卵状态及繁殖时间。研究表明，温度、光周期、流速和食物可得性等环境参数可能诱发淡水 mussel 的繁殖事件52,53,54,55,56。随着新数据的提交，数据库中亦可增加其他字段，以促进未来关于非生物因子影响怀卵状况的研究。此外，可将一种基于本研究设计的捕获-标记-重捕（capture-mark-recapture）改进方法纳入本实验方案，从而允许研究人员监测特定 mussel 个体的繁殖行为，并揭示每年多次繁殖的相关信息。
FMGA 中信息的准确性取决于数据来源。例如，由于许多淡水蚌类物种具有相似的外部特征，难以区分物种，因此误鉴定的情况较为常见57。若对误鉴定个体采集了鳃组织样本，可能导致该物种繁殖期信息出现混淆或错误。若采集鳃样本，应拍摄个体双壳内侧（如个体已死亡）、右壳外侧以及壳顶（两壳连接的铰合部）的照片，并通过桌面网站或移动应用程序随妊娠数据一并提交。我们也欢迎提交鳃部内容物的照片。在提交表单中设有下拉菜单，供采集者标明其对物种鉴定结果的信心程度。在记录验证前，系统将结合采集者的鉴定信心水平、物种可能的分布范围等因素进行综合评估。由于蚌科（Unionidae）物种存在较高的种内形态变异，鼓励提交组织样本，必要时可通过分子手段进行准确鉴定。
未来的意义
作为一种非致死性方法，本方案可应用于常见物种和濒危物种。濒危物种的妊娠时间表可为参与濒危物种立法和恢复规划的保护管理者提供物种繁殖活跃期的信息，从而辅助其决策。负责管理受威胁物种的州级和联邦机构可据此更合理地建议在物种不处于繁殖敏感期时发放许可，甚至可在蚌类培育完全发育的钩介幼虫期间限制宿主鱼类的捕捞。此外，野外调查可在物种非繁殖期进行，以尽量减少对种群补充过程的影响。公开可访问的数据库FMGA为研究人员和管理者提供了获取目标淡水蚌类物种重要繁殖信息的工具。该数据库还将凸显现有数据空白，促进针对特定物种育幼模式的进一步研究。由于了解物种的繁殖模式有助于制定适当的管理决策，我们希望本方案及数据库能够推动未来淡水蚌类的研究、保护与种群恢复工作。

淡水生态系统中种群的持续存在依赖于繁殖和补充的成功。对于寄生生物而言，明确其生活史的复杂细节（例如幼虫发育阶段和宿主吸引策略）有助于了解该生物的繁殖习性以及影响补充的关键过程。当物种面临濒危时，这类信息尤为重要，因为成功的补充对于维持现存种群至关重要，或在需要通过人工繁育来重新建立已灭绝种群时尤为关键。
淡水贻贝（双壳纲：蚌目）被认为是全球范围内最受威胁的生物类群之一，而汇总各物种特有的繁殖习性将有助于相关研究工作1,2,3,4,5。目前全球已确认的淡水贻贝物种超过800种，其多样性热点分布于北美、南美以及东南亚地区，但许多物种的基本生活史信息仍属未知2,5,6,7。该目内的各个科具有共同特征，即其幼虫阶段为寄生性，在附着于宿主期间完成变态发育，转变为自由生活的幼体7,8。这一独特的生活史阶段促进了淡水生态系统的生物多样性，而这些系统目前正面临危机9。高水平的濒危状况可归因于多种人为威胁，包括水道污染、栖息地改变与破坏、宿主鱼类丰度和多样性的下降，以及外来入侵物种的引入1,10。作为底栖滤食性生物，贻贝会将自身埋入底质中，因而容易受到随径流进入流域的污染物和有毒物质的影响11。恢复贻贝种群具有重要意义，因为它们提供了多种生态系统服务，包括碳封存、作为食物来源以及通过滤食作用实现水质净化11。此外，贻贝还被发现可用于指示生态系统健康状况、促进生物多样性，并进而增强生态系统的恢复力12。
许多淡水贻贝研究集中于探究其早期生活史需求，以更好地为物种状况评估和管理策略提供依据。本研究涉及的淡水贻贝科（例如 Hyriidae、Margaritiferidae、Unionidae）具有一种独特的生活史策略，即雌性个体在育儿鳃（marsupial gills）中孵育幼虫（钩介幼虫，glochidia）8。通过多种策略，雌性贻贝将成熟的钩介幼虫从育儿鳃中释放出来，使其寄生到脊椎动物宿主上13。关于钩介幼虫在鳃内发育的研究方法，最初借鉴了一种利用皮下注射器采集活体贻贝性腺液体并评估配子生成的技术14,15,16。随着研究人员验证了这种非致死性性腺取样方法的可行性，该技术被改进用于育儿鳃取样，以评估孵育发育情况15,16。孵育发育特征可用于解析系统发育关系，因为某些贻贝物种仅在外侧两片鳃（外鳃，ectobranchus）中孵育钩介幼虫，或仅在内侧两片鳃（内鳃，endobranchus）中孵育，或在全部四片鳃（四鳃型，tetrabranchus）中孵育，但并非所有物种的这一特征均已明确17。以往研究曾根据雌性贻贝是否在冬季孵育钩介幼虫（缓生型，bradytictic）或仅在夏季短暂孵育（速生型，tachytictic），将贻贝物种进行分类18。当对Anodonta属贻贝的生殖周期进行研究时，发现其确实在冬季保持孵育状态，支持了上述分类观点19。然而，随着多年来对基础生殖生物学的深入研究，人们发现这种二分法是一种过于简化的概括，某些物种的孵育周期实际上比最初设想的更为复杂20,21。例如，Hyriidae科的Hyridella属，以及Unionidae科的Glebula和Elliptio属物种，已被观察到每个繁殖季节可产生多达三个孵育批次22,23,24。由于物种特异性，甚至有时是种群特异性的生殖习性具有高度复杂性20，目前对于孵育发生的时间、持续时长以及单只雌性贻贝可能产生的孵育批次数量，仍存在知识空白。
尽管皮下注射器已被用于提取鳃内物质，但由于缺乏标准化操作，导致不同研究之间的结果难以比较。此前，已确定蚌科（Unionidae） glochidia 的四个发育阶段（即卵、胚胎、未成熟和完全成熟阶段），但这些阶段尚未被纳入标准操作程序16,25,26。其他针对珠蚌科（Margaritiferidae）物种的研究则用“发育中 glochidia”取代了“未成熟 glochidia”的分类，可能导致混淆27,28。由于对不同幼虫发育阶段的描述缺乏一致性，许多研究人员通常仅将抱卵雌体笼统地描述为“怀卵”，而这一术语无法涵盖幼虫发育的复杂过程。开展宿主鱼类试验的生命周期研究迫切需要具有完全成熟 glochidia 的怀卵雌体，但相关信息分散于已发表和未发表的文献中29,30。目前，关于许多蚌类物种的繁殖习性仍缺乏数据，包括卵、未成熟 glochidia 以及可附着于宿主的完全成熟 glochidia 之间的转变时间。对于大多数物种而言，雌体抱卵持续多长时间、受精卵发育至完全成熟所需的时间仍不清楚。这些知识空白在受保护物种中尤为显著，因此亟需一种经过验证、无致死效应的鳃内容物提取标准化方法，并可在科学界推广，以补充主流的数据采集手段，同时避免对受保护种群造成威胁24,31,32。
本研究有三个目标：1）规范一种鳃组织取样技术，并在野外对雌性蚌类进行致死性和非致死性影响测试；2）描述 glochidial（钩介幼虫）发育的不同阶段，并建立一种标准化的方法用于识别和报告各种幼虫发育阶段；3）建立一个公共数据存储库以保存所收集的数据。野外调查、长期监测项目以及博物馆标本收藏均为实施本方案并进一步收集更广泛感兴趣数据提供了机会。该规范化方案包含用于区分幼虫发育各阶段的图示和形态特征描述。通过统一分类标准，可在不同发生情况和物种之间对所收集的结果进行比较。数据收集完成后，均可提交至“淡水蚌类 gravidity（怀卵状态）年鉴”（Freshwater Mussel Gravidity Almanac, FMGA），该数据库专门用于存储采用本方案所获得的 gravidity 信息。最终形成的综合性数据存储与整合平台将作为一种研究工具，推动未来的研究、保护及恢复工作。将本方法纳入各类蚌类研究项目，并向 FMGA 提交数据，将有助于拓展全年范围内对蚌类物种 gravidity 状态的认知。作为一类高度濒危的生物类群，该方案及其所形成的关于淡水蚌类繁殖习性的数据库，对于理解其种群动态以及推动这些物种的保护工作至关重要。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 带卡扣盖的离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>在野外工作中，带卡扣盖的离心管非常重要，可防止螺旋盖松脱丢失。</td></tr><tr><td>带20 G针头的10 mL一次性注射器</td><td>Exelint International</td><td>26255</td><td>无菌10 mL一次性注射器，带针头，型号：10ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2&quot;</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>任意品牌</td><td>任意型号</td><td></td></tr><tr><td>标记笔</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-379-4</td><td>这是我们所使用的型号，但任何能在小型塑料管上书写的标记笔均可使用。该款标记笔具有较好的乙醇和防水性能。</td></tr><tr><td>分子级乙醇</td><td>任意品牌</td><td>任意型号</td><td>若需保存鳃部内容物，则需要此试剂。进行遗传学研究时需使用未变性的95%乙醇，扫描电镜成像工作则需70%乙醇。</td></tr><tr><td>普通纸张</td><td>任意品牌</td><td>任意型号</td><td>用于记录所采集样本的相关信息。</td></tr><tr><td>笔/铅笔</td><td>任意品牌</td><td>任意型号</td><td>若在野外工作，建议使用铅笔在防水纸上书写，以防字迹模糊。若在博物馆或实验室中，则可使用任意书写工具。</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>DWK Life Sciences (Kimble)</td><td>23000-9050</td><td>这是我们所使用的型号，但任何可用的培养皿均可。若培养皿侧壁较高则更佳，以防加水过多时溢出。</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>任意品牌</td><td>任意型号</td><td>用于检测钩介幼虫反应性的NaCl试验。保存的样本无需此试剂。</td></tr><tr><td>扩张器</td><td>任意品牌</td><td>任意型号</td><td>仅在需要辅助打开活体蚌类双壳时使用。</td></tr><tr><td>无菌水</td><td>任意品牌</td><td>任意型号</td><td>加入鳃部样本中，用于在采集后24小时内评估其反应性。</td></tr><tr><td>强力胶</td><td>Gorilla</td><td>Gorilla super glue gel</td><td>用于粘贴标签，仅在进行重捕标记-重捕研究时需要。</td></tr><tr><td>标签</td><td>Hallprint</td><td>FPN 8x4</td><td>仅在进行重捕标记-重捕研究时需要。</td></tr><tr><td>移液管</td><td>Thermo Scientific Samco</td><td>225</td><td>这是我们常用的型号，但任何移液管或挤压瓶均可适用。</td></tr><tr><td>镊子</td><td>任意品牌</td><td>任意型号</td><td>用于移动NaCl晶体以进行盐试验。保存的样本无需此工具。</td></tr><tr><td>防水纸</td><td>RainWriter</td><td>任意型号</td><td>仅在野外工作时需要。可用于记录每个个体鳃部内容物提取时的相关信息。</td></tr><tr><td>木制探针</td><td>任意品牌</td><td>任意型号</td><td>仅在需要辅助打开活体蚌类双壳时使用。</td></tr></tbody></table>

标准化一种用于评估淡水贻贝（双壳纲：蚌目）繁殖状态与幼体发育的非致死性方法

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels (Bivalvia: Unionida)

在开展种群恢复管理工作时，主动监测濒危物种的繁殖时机、发育过程和生殖模式至关重要。淡水贻贝是全球受威胁最严重的生物类群之一，但目前许多物种在早期幼虫（钩介幼虫）发育阶段及育幼期方面的信息仍然缺乏。以往研究多集中于雌性贻贝准备寄生宿主鱼类这一复杂生活史阶段，而针对育幼期及幼虫发育时间的研究则较少。本文所述方案使研究人员能够以非致死方式评估雌性贻贝的怀卵状态。本研究结果表明，该方法不会影响雌性贻贝在取样后维持怀卵状态或再次怀卵的能力。该方法的优势使其可用于联邦层面受威胁或濒危物种，或其他具有高度保护意义的种群。本方案可适用于保存样本或活体个体，并已在多种贻贝物种中进行了测试。所提供的数据库汇集了大量关于生殖行为时间规律的信息，将有助于推动未来淡水贻贝的研究、保护与种群恢复工作。

本方案应用于一项标记重捕研究，该研究于2015年1月至2015年12月期间对佛罗里达州沃尔顿县布鲁斯溪（Bruce Creek）一段750 m2区域内的淡水贻贝群落进行了监测。野外采样计划每四周进行一次；然而，由于高流量事件的影响，2015年4月和9月未实施采样。美国地质调查局、美国鱼类及野生动物管理局以及佛罗里达鱼类和野生动物保护委员会等州级和联邦机构协助完成了野外调查和鳃组织采样工作。调查过程中遇到的每只怀卵雌性个体均按照上述方案进行野外鳃内容物采样，标记（见材料表）后放回河流底质中。鳃组织样本保存于95%乙醇（EtOH）中，并运送至美国地质调查局湿地与水生研究中心实验室，用于鳃内容物分析。
通过全年每月对雌性个体进行标记并重新捕获，我们评估了鳃组织取样方案对共计90个个体的致死性和非致死性影响。本研究中重新捕获的物种包括以下七种：Elliptio pullata（n = 5）、Fusconaia burkei（n = 1）、Hamiota australis（n = 19）、Obovaria choctawensis（n = 1）、Strophitus williamsi（n = 1）、Villosa lienosa（n = 60）和Villosa vibex（n = 3）。我们的取样个体全长范围为24 mm至80 mm，其中包括受美国《濒危物种法案》保护的两个物种（F. burkei和H. australis）。本研究所使用的所有数据均公开可获取，我们已在ScienceBase平台公开了数据集（https://doi.org/10.5066/P90VU8EN）42。
通过采集鳃样本后重新捕获到的存活个体数量来评估存活率。研究期间观察到较高的存活率（97%），部分死亡可能与捕食有关，这由现场观察结果所提示。结果显示，约51%的个体（90只中的46只）在连续采样事件中保持怀卵状态。另有10%的个体（90只中的9只）首次被发现怀卵，重新捕获时未怀卵，之后再次被发现怀卵。本研究中约39%的个体（90只中的35只）初次被发现怀卵并采集了鳃样本，但在随后一年内的多次重新捕获中，均未再次发现其怀卵。结果表明，本文所述方案既非致死性也非亚致死性，且在采集鳃组织后不会显著干扰其当前的抱卵期。
尽管本研究中不同物种的样本量不相等，但研究结果突显了该实验方案的有益性和实际应用价值。V. lienosa 的妊娠时间分布显示，除8月份仅发现抱卵（EGG）雌性个体外，几乎每个月均发现抱有正在发育的卵（FDG）的妊娠雌性（图5A）。H. australis 雌性个体在7月、8月和12月均未发现妊娠（NG）。1月和2月有较大比例的雌性抱有FDG，但在10月和11月也有发现（图5B）。未发现任何E. pullata个体抱有FDG，尽管在5月至6月期间有抱卵（EGG）的雌性，且在6月记录到1只妊娠雌性（GFR）（图5C）。唯一一只妊娠的F. burkei雌性于6月以GFR状态被捕获，7月重捕时为NG状态。同一只O. choctawensis个体于2月以FDG状态被采集，7月重捕时为NG状态。仅发现1只S. williamsi个体，共重捕3次，该雌性在3月为FDG状态，5月为NG状态，6月为GFR状态，8月为EGG状态（图5C）。抱有FDG的V. vibex妊娠雌性出现在2月至6月之间（图5C）。
<img alt="妊娠状态柱状图；Villosa lienosa，Hamiota australis；月度采样数据趋势。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60244/60244fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 5"> 
图5：佛罗里达州布鲁斯溪研究结果以妊娠日历形式展示。（A）Villosa lienosa 捕获/重捕获的妊娠日历。（B）Hamiota australis 捕获/重捕获的妊娠日历。（C）所有采样个体数少于10的物种的妊娠日历。y轴包含月份缩写：1月（Ja）、2月（F）、3月（Mr）、5月（My）、6月（Jn）、7月（Jl）、8月（A）、10月（O）、11月（N）和12月（D）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60244/60244fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

淡水 mussel 的保护依赖于对物种繁殖模式和过程的监测。本研究建立了一种非致死性取样方法，用于采集鳃部内容物、表征幼体发育阶段，并为所收集的数据提供一个数字化数据库。该方案与数据库结合的工具包将成为濒危物种恢复工作中 mussel 研究人员的重要工具。

积极监测濒危物种的繁殖时间、发育过程和生殖模式，对于种群恢复管理至关重要。淡水……

本方案对 gravid 淡水蚌类的鳃组织取样方法以及幼体发育不同阶段的鉴定技术进行了标准化，并提供了 Gravidity Almanac 在线数据库，用于数据提交与查询。该技术为非致死性方法，对雌性蚌类在取样后维持 gravid 状态的能力无显著影响，因此可应用于常见物种及受保护物种。本方法适用于双壳纲（Bivalvia）中 Hyriidae、Margaritiferidae 和 Unionidae 科的生物类群，这些类群分布于除南极洲以外的各大洲淡水生态系统中。打开贻贝时需谨慎操作，收集地点信息，并确保数据采集准确无误。若鉴定结果存疑，应拍摄照片并联系相关专家。首先通过触觉和视觉方法从野外采集活体贻贝。通过肉眼观察来评估雌性个体的怀卵状态，可在采集过程中或采集后进行，轻轻撬开双壳至足以观察内部的程度，检查鳃是否膨胀。若使用博物馆保存的标本，则通过打开双壳并检查鳃部进行肉眼观察。为取样鳃部内容物，准备一个1.5毫升的塑料微量离心管，管中加入约1毫升的水或乙醇，具体选择取决于评估所需的时间。取一支无菌的30号斜面针头，将其安装在10毫升注射器上，拧开针帽露出针头，下压注射器推柄，使活塞位于0毫升刻度线处。拿起抱卵雌体，用拇指尖轻轻掰开两个外壳瓣。用针尖轻轻刺入膨胀的育儿囊鳃中的单根水管，然后用针头的斜面轻柔地刮取鳃内含物。将它们保存在已准备好的微量离心管中，以备后续评估。在数据表上记录相关信息，例如属种鉴定、采集地点信息和 gravidity 状态，并在每个采集容器上标注唯一标识符，以确保运输过程中数据记录的准确性。正确摆放蚌体方向，拍摄右壳照片以供身份验证，将其平放后拍照，确保照片中包含已标记的样品管。为评估鳃部内容物，将其转移至培养皿中，并在皿底加入水。轻轻摇晃培养皿，使内容物聚集于中央，以便更集中地观察样本。将培养皿置于解剖显微镜下观察样本，并在条件允许时，拍摄显微镜下的样本照片。记录每个鳃样本中存在的各个发育阶段。如果雌性个体所孵育的幼虫处于多个发育阶段，应报告在特定样本中观察到的所有发育阶段。若鉴定出完全发育的钩介幼虫且未使用乙醇保存样本，可通过向鳃样本的一部分液滴中加入一粒氯化钠晶体来评估其活力。存活的钩介幼虫会通过开闭双壳或从张开状态闭合双壳作出反应。记录数据时，对经过盐水测试的钩介幼虫，在其编号末尾标注字母 T。报告数据时，访问 FMGA 页面或移动应用程序，并使用下拉菜单和文本输入框在数据录入表中登记结果。对于已有的大型数据集，请联系作者获取模板电子表格。将记录的数据输入到相应的列标题下，注意电子表格中的每一行代表来自一个怀卵个体的鳃样本的观察结果，然后提交结果，经管理员验证后将被添加至FMGA数据库；管理员可能会联系样本提供者以获取更多详细信息或照片。FMGA数据库汇总所有提交的信息，允许用户可视化数据库中所有物种的时间动态怀卵数据。淡水贝类妊娠历书是一种研究工具，旨在标准化妊娠数据的采集，同时促进未来的研究、保护和恢复工作。通过全年每月对雌性个体进行标记和重捕，评估了鳃组织取样方案。尽管本研究中不同物种的样本量不均衡，但结果突显了该方案的有益性和实用性。细弱真珠蚌（Villosa lienosa）的繁殖期日历显示，除8月份仅发现抱卵的雌性个体外，几乎每个月都可发现携带完全发育钩介幼虫的雌性个体。南方哈氏蚌（Hamiota australis）的雌性个体在7月、8月和12月未发现怀孕。在1月和2月以及10月和11月，有更大比例的雌性个体携带完全发育的钩介幼虫。尽管雌性个体在5月至6月期间孵育卵团，但未发现任何椭圆黑蚌（Elliptio pullata）个体孵育完全发育的钩介幼虫。仅发现一只威廉氏旋纹蚌（Strophitus williamsi）雌性个体，并被重复捕获三次。该雌性个体在3月被发现孵育完全发育的钩介幼虫，5月时未见怀卵，6月报告为怀卵状态，8月则在孵育卵团。在2月至6月期间可发现携带完全发育的钩介幼虫的维洛沙·维贝克斯（Villosa vibex） gravid 雌性个体。淡水贻贝是一类濒危程度很高的生物类群。该方法学具有重要意义，因为它为评估濒危物种的繁殖特征提供了一种非致死性的途径。必须小心谨慎地处理蚌类。可在野外测量环境条件（如水温和溪流流量），以确定触发淡水蚌类繁殖和幼体发育的条件。汇总所有淡水蚌类物种的时序性怀卵数据，有助于开展流行病学、钩介幼虫形态学、生活史、系统发育、繁育及迁移等方面的研究。

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