使用 X 射线特定染色方法和纳米计算机断层扫描对软组织样本进行 3D 成像
October 24th, 2019
提出了一种利用X射线特异性染色方法对微观组织结构进行三维可视化的协议，该方法专为X射线计算机断层扫描而设计。
我们的新协议实际上允许我们使用 X 射线计算机断层扫描以 3D 方式可视化蜂窝结构。我们通过用 eosin 染色组织来做到这一点，并这样使细胞质可见。除了医学应用和研究，我们还认为我们的方法可以应用于生物学，例如动物学研究或发育生物学。
该技术相对简单，非常快，也适合较大的组织样本。我们认为，我们的方法与X射线微计算机断层扫描相结合，可以集成到临床工作流程中，然后实际帮助病理学家做出更好的决策。首先固定软组织样本。
将 50 毫升离心管填充含有 9.5 毫升 4%甲醛和 0.5 毫升冰川醋酸的固定溶液。将软组织样品加入离心管，冷藏24至72小时。冷藏后用DPBS溶液清洗软组织样品一小时。
然后将样品染色，将其放入两毫升Eosin Y染色溶液中，并在水平摇板上孵育24小时。第二天，小心地将软组织样品从样品容器中取出，用纤维素纸巾去除多余的染色剂。将放在乙醇蒸汽相上方的圆锥容器中，以储存和进一步使用。
准备适当的样品架，根据手稿指示安装软组织样品，并确保紧密贴合以防止样品在 X 射线 CT 测量期间移动。一旦粘合剂变硬，样品架准备好使用，将鼠标肾脏转移到完整的离心管中，在底部保存几滴 70% 乙醇。将安装的样品放入 X 射线 CT 扫描仪中。
仔细对齐样品后，选择采集参数以获得最佳图像质量。对于提供的微 CT 数据，使用 1601 投影在 360 度以上均匀分布的 1601 投影，以 50 千伏的峰值电压和 3.5 瓦的电流获取扫描。然后使用概览扫描中的微 CT 数据选择高分辨率 CT 扫描感兴趣的区域。
使用手术刀和立体显微镜将软组织样本切成大约 0.5 毫米边缘长度的非常小的碎片，以制备大量感兴趣的软组织样本。如果使用鼠标肾脏，则沿最长轴将它切成两半。服用一半，准备不同的解剖区域，如肾皮质和肾脑。
将小块转移到新的培养皿中进行脱水。根据手稿方向使用一系列乙醇溶液对样品进行脱水，执行每个脱水步骤一小时。将脱水样品转移到微孔胶囊中并关闭。
使样品与100%乙醇保持接触。然后临界点干燥小组织件。一旦组织样本准备好，将它们放在一个新的培养皿中，然后储存在干燥器中，然后进一步使用。
将组织件安装到适当的样品支架上，确保紧密贴合。对于小鼠肾脏，使用立体显微镜将碎片超粘到样品架上。仔细对齐样品后，选择采集参数以获得最佳成像质量。
对于呈现的 nano-CT 数据，以 60 千伏的峰值电压获取投影，1599 个投影均匀分布在 360 度以上，体受到大约 400 纳米的体美大小。该协议用于小鼠肾脏微观组织结构的三:低分辨率微CT测量允许对整个器官进行概述，并有助于识别高分辨率测量感兴趣的体积。
同一小鼠肾脏用于获取高分辨率微CT数据。实现了解剖结构的更详细视图，如皮层、外层和内梅杜拉等。兴趣渲染量显示梅杜拉区域和通过容器的虚拟部分。
纳米CT用于获取细胞水平上肾脏样本的详细视图。从整个小鼠肾脏获得的一小块组织被用来成像亨勒环的厚上升四肢，体骨大小约为400纳米。进行了一项比较研究，以确保纳米CT与历史学完全兼容。
多模式成像方法证实了通过这两种方法获得的结果。在孵化步骤中，样品完全被染色溶液包围至关重要。此外，在进行 CT X 射线成像时，最重要的事实是确保数据采集期间的样品稳定性。
使用我们的协议分析的软组织样本可以使用标准组织学技术（如反污血氧素）进一步分析。我们的染色协议将大大有助于推进3D X射线组织学。医学研究将特别受益于这种无损的三维成像技术。
概述
本文介绍了一种使用X射线计算机断层扫描和伊红染色的细胞结构三维可视化协议。该方法适用于各种生物学领域，旨在增强临床工作流程。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 医学影像
背景
- X射线计算机断层扫描允许对组织结构进行详细成像。
- 伊红染色增强了细胞成分的可见性。
- 该技术适用于较大的组织样本。
- 潜在应用扩展到动物学和发育生物学。
研究目的
- 开发组织结构三维可视化的协议。
- 将该方法整合到临床工作流程中以改进病理学。
- 展示X射线成像与组织病理学的兼容性。
使用的方法
- 用福尔马林和醋酸固定软组织样本。
- 使用伊红Y溶液染色以增强细胞可见性。
- 使用微CT扫描进行低分辨率和高分辨率成像。
- 准备组织样本以在细胞水平进行详细成像。
主要结果
- 成功三维可视化了小鼠肾脏结构。
- 识别了高分辨率扫描的感兴趣区域。
- 确认了纳米CT与组织病理学技术的兼容性。
- 该方法增强了对组织结构和病理的理解。
结论
- 该协议显著推进了三维X射线组织学。
- 它提供了一种对医学研究有益的非破坏性成像技术。
- 未来的应用可能提高病理诊断的准确性。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution 3D imaging of soft-tissue samples using X-ray-specific staining and nanoscopic computed tomography enables detailed morphological characterization critical for early discovery and translational research. This approach bridges the gap between traditional histology and advanced imaging, supporting more predictive and risk-adjusted decisions in biopharma R&D. The method's compatibility with standard histopathology ensures continuity across discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables 3D visualization of cellular and subcellular structures for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by revealing tissue architecture in situ.
- Facilitates hypothesis testing through direct morphological assessment.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for downstream quantitative imaging workflows.
- Improves assay reproducibility by standardizing sample preparation and imaging conditions.
- Enables identification and selection of regions of interest for high-resolution analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns 3D imaging outputs with histopathological standards for translational continuity.
- Provides nondestructive assessment of tissue morphology, supporting biomarker discovery.
- Facilitates risk-adjusted advancement by confirming structural endpoints in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates from early discovery through preclinical validation, enabling seamless transition between morphological assessment and functional studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven exploration of tissue structure and cellular organization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative 3D data for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Provides high-resolution volumetric datasets for statistical and morphological evaluation.
- Translational Research: Ensures compatibility with standard histology for biomarker and endpoint alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable imaging capability for diverse tissue types and research questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in tissue-based target validation.
- Operational Value: Streamlines sample preparation and imaging for high-throughput, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making by providing robust morphological evidence.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, staining, and advanced imaging instrumentation.
- Demands access to microCT and nanoCT platforms with precise sample alignment capabilities.
- Necessitates standardized protocols for cross-team reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various soft-tissue types with protocol optimization as needed.
- Sample stability and complete staining coverage are critical for data quality.
