Name: 使用 X 射线特定染色方法和纳米计算机断层扫描对软组织样本进行 3D 成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 了解使用X射线计算机断层扫描和伊红染色对小鼠肾脏等软组织进行三维可视化的方法。该技术可与组织病理学兼容，有助于病理学家做出更准确的诊断决策。

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感谢Enken Drecoll博士在组织学方面的讨论，以及瑞典Excillum AB公司的大力支持团队。本研究得到了德国研究基金会（DFG）卓越集群慕尼黑先进光子学中心（MAP）和DFG戈特弗里德·威廉·莱布尼茨计划的经费支持。此外，本研究项目还获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划在玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议编号H2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT下的资助。

警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。本实验方案中使用的多种化学试剂具有急性毒性和致癌性。进行染色实验时，请务必采取所有适当的安全措施，包括使用工程控制设备（通风橱、手套箱）和个人防护装备（护目镜、手套、实验服、长裤、封闭式鞋履）。
使用的动物： 
动物饲养在德国慕尼黑工业大学Klinikum rechts der Isar进行，遵循欧盟2010/63号指导方针。器官摘除操作已获得德国慕尼黑Klinikum rechts der Isar内部动物保护委员会批准（内部参考编号4-005-09）。所有操作均符合相关指导方针和法规。所有实验室均接受检查，以确保符合经合组织（OECD）良好实验室规范原则。
1. 伊红染色方案
<ol>
	<li>为固定软组织样本，取一个50 mL离心管，加入固定液，其中包含9.5 mL的4%（v/v）甲醛溶液（FA）和0.5 mL冰醋酸（AA）。 
	注意：FA溶液需使用37%无酸甲醛溶液（含约10%甲醇作为稳定剂）新鲜配制，并用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释。选择不含钙和镁的DPBS。稀释后的FA溶液保存时间不得超过一个月。酸化过程中，固定液的pH值会从中性降至约3。 
	警告：由于甲醛具有急性器官毒性、腐蚀性和致癌性，操作时必须使用通风橱，并穿戴适当的个人防护装备。
	<ol>
		<li>将新鲜取出的软组织样本放入50 mL离心管中，并于4°C冰箱中固定24–72小时。 
		注意：此步骤可暂停操作。</li>
		<li>用DPBS溶液清洗软组织样本1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对已固定的软组织样本（例如完整的小鼠肾脏）进行染色时，将组织置于2 mL伊红Y染色液中，于室温孵育24小时。孵育期间，将样本放置在水平摇床上，保持轻柔振荡（约60 rpm）。 
	注意：伊红Y染色液的浓度为30%（w/v），溶剂为蒸馏水。染色液体积应足以完全覆盖样本，并确保样本在容器内可自由移动。其他类型样本的孵育时间可能不同，需相应调整。</li>
	<li>染色完成后，小心地从容器中取出软组织样本。
	<ol>
		<li>用滤纸小心吸除多余的染色剂。</li>
		<li>将软组织样本置于锥形样品容器中，并放置于乙醇蒸气相环境中，用于储存和后续使用。 
		注意：锥形样品容器底部必须始终保留少量70%（v/v）乙醇，以保持软组织样本湿润，防止产生人工假象。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. X射线显微CT成像
注意：X射线显微CT测量使用一台显微CT扫描仪完成，该仪器可提供整体CT测量（能够在视野（FOV）内对整个样本进行成像）以及高分辨率CT测量（能够针对同一样本中某一特定感兴趣体积（VOI）进行聚焦成像），空间分辨率可达1 µm。
<ol>
	<li>将软组织样本安装到合适的样品 holder 上。确保样本在样品 holder 上紧密固定，以防止在X射线CT扫描过程中样本发生移动。
	<ol>
		<li>对于染色的小鼠肾脏样本：准备一个由两个离心管组成的样品 holder，其中一个离心管的底部被切除。使用双组分胶水将两个离心管粘合在一起。确保离心管围绕旋转轴保持直线对齐。等待胶水完全固化。</li>
		<li>当样品 holder 准备就绪后，将小鼠肾脏转移至完整的离心管中，该离心管底部预先加入少量70%（v/v）乙醇。 
		注意：样本的稳定性至关重要。请花足够时间准备X射线CT扫描所需的样本。软组织样本应置于乙醇蒸气环境中，以在X射线CT扫描期间保持样本湿润，防止软组织样本收缩及其他伪影的产生。软组织样本不应直接接触溶剂，以避免在X射线CT扫描过程中溶剂在样本周围积聚，从而导致样本移动或重建时出现问题。如果样品 holder 无法在底部容纳溶剂，可在其中放置一张用70%（v/v）乙醇润湿的纤维素纸。需注意的是，未观察到由乙醇溶剂引起的收缩伪影。 
		注意：本实验方案可在此处暂停。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在仔细对齐样本后，选择合适的采集参数以获得最佳图像质量。对于本研究中提供的显微CT数据，采用50 kV的峰值电压、3.5 W的电流，并在360°范围内均匀采集1601个投影图像。 
	注意：概览CT扫描的采集参数旨在实现最佳图像质量。因此选用0.39倍的相机物镜，以确保整个样本均位于视场（FOV）范围内，最终获得12 µm的有效像素尺寸。每个投影的曝光时间为2 s，可提供良好的信噪比。高分辨率CT扫描的感兴趣区域（ROI）是基于概览扫描获得的显微CT数据确定的。多数显微CT扫描仪配备集成软件工具，可用于精确定义所选定的ROI。对于高分辨率CT数据，选用4倍相机物镜，获得3.3 µm的有效像素尺寸，此时每个投影需要15 s的曝光时间。 
	注意：本实验方案可在此处暂停。</li>
	<li>完成X射线CT数据采集后，对投影图像进行相应处理，用于三维体数据的重建。对于本研究中提供的显微CT数据：使用设备自带软件对X射线CT数据进行重建。 
	注意：图 1 和 2 中所示的显微CT数据的体绘制图像通过可视化软件生成。 
	注意：本实验方案可在此处暂停。</li>
</ol>
3. X射线纳米CT成像
注意：该X射线纳米CT扫描仪为自主研发。该无透镜仪器配备纳米焦点X射线源和单光子计数探测器，可生成分辨率低至100 nm的三维数据10。通常，包括配备X射线光学元件在内的纳米CT系统均可在市场上获得，并不仅限于本文所述的纳米CT扫描仪。
<ol>
	<li>纳米CT样品制备
	<ol>
		<li>准备软组织样品的感兴趣区域（VOI）。使用解剖刀和体视显微镜将软组织切成约0.5 mm边长的小块。以小鼠肾脏为例：沿最长轴将小鼠肾脏切成两半，取其中一半，分离出肾皮质和肾髓质等不同解剖区域。 
		注：另一半小鼠肾脏被送至组织病理学检测，样品经石蜡包埋并按常规处理，制备成典型的组织学切片，如图3c和图3d所示。</li>
		<li>在首次脱水步骤前，将小块组织转移至新的培养皿中，并在后续所有步骤中保持在此培养皿中。</li>
		<li>使用不同浓度（均为v/v%）的乙醇进行脱水：50%、60%、70%、80%、90%、96%和100%乙醇，以蒸馏水平衡，每步脱水持续1小时。 
		注：此处可暂停实验流程。可将小块组织在100%乙醇中保存过夜。</li>
		<li>对小块组织进行临界点干燥（CPD）。 
		注：临界点干燥技术通过将溶剂（此处为乙醇）替换为干燥介质（此处为CO2），实现组织样品的完全脱水。该步骤对于确保样品能够牢固安装在纳米CT的样品台上、在测量过程中不发生移动，并可紧靠X射线源以实现最佳几何放大倍数至关重要。纳米CT系统基于纯几何放大原理，放大倍数定义为源-探测器距离与源-样品距离之比。该干燥技术最初由Anderson提出，用于在电子显微镜下保持生物样本的三维结构28。Bray对此技术提供了综述29。
		<ol>
			<li>预先将真空腔室充满100%乙醇。将小块组织放入微孔胶囊中，并置于临界点干燥仪的真空腔室内，关闭系统。 
			注：由于临界点干燥过程涉及高压，需确保干燥仪所有部件（特别是接头）完好无损，且系统已正确密封。</li>
			<li>将腔室冷却至6–8°C，并充入液态CO2。</li>
			<li>在搅拌条件下等待3分钟，使两种组分充分混合。小心排空腔室，确保样品支架仍被溶剂覆盖。重复此步骤十次，以确保样品内部的乙醇被CO2完全替换。</li>
			<li>在腔室最后一次充满CO2后，将设备加热至CO2的临界点（31°C和73.8 bar），随后在30分钟内缓慢释放气态CO2。 
			注：气体释放必须非常缓慢，否则样品表面可能凝结水分。确保温度不低于CO2的临界点。仅当系统内所有压力完全释放后，方可打开临界点干燥仪。</li>
			<li>迅速将经临界点干燥的组织块从仪器中取出，并在进一步使用前置于新的培养皿中，存放于干燥器内。 
			注：此处可暂停实验流程。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将经临界点干燥的组织块固定至合适的样品台上。确保样品在样品台上安装牢固，防止在CT扫描过程中发生移动。以小鼠肾脏组织块为例：使用瞬干胶将组织块粘附于样品台上。 
	注：在CT扫描过程中，任何样品的非预期移动都可能导致三维重建出现问题——尤其是在获取纳米级体素尺寸的数据集时尤为明显。 
	注：此处可暂停实验流程。</li>
	<li>在仔细对准样品后，选择最佳成像质量的采集参数。以本研究中展示的纳米CT数据为例：在60 kV峰值电压下采集投影，共获取1599个在360°范围内均匀分布的投影，体素尺寸约为400 nm。 
	注：在400 nm体素尺寸下，单次CT扫描在旋转轴方向（垂直方向）的视场（FOV）为75 µm，在垂直于旋转轴方向（水平方向）的视场约为560 µm。为研究更大体积的样品，可通过在不同垂直位置进行多次扫描并拼接，扩展沿旋转轴方向的视场。此外，还可进行局部断层扫描，以测量在垂直于旋转轴方向上直径大于全局CT扫描视场的样品。本研究中纳米CT数据的每幅投影曝光时间为4秒，因此每组数据的总采集时间约为3.5小时。 
	注：此处可暂停实验流程。</li>
	<li>在完成CT数据采集后，对投影图像进行相应处理，以重建三维体积。
	<ol>
		<li>针对本研究中展示的纳米CT数据，使用平场图像对采集的投影进行归一化处理。采用Richardson-Lucy去卷积算法30,31增强投影图像的锐度。去卷积核采用标准差为一个像素的旋转对称高斯函数。</li>
		<li>对锐化后的图像应用Paganin相位恢复算法，以增强软组织对比度。调整算法参数以优化图像质量32。使用先进的滤波反投影算法对预处理后的投影进行重建。 
		注：图3将获得的纳米CT数据与约7 µm厚的相应组织学切片进行对比评估。为此，通过计算相关切片中每个像素的最小值，生成了18个相邻纳米CT切片的最小强度投影图像，其虚拟厚度约为7 µm。使用可视化软件对纳米CT数据的三维体积进行渲染，结果如图4所示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

目前，伊红被用作标记细胞质的标准组织学染色方法。该染色剂以0.1%（w/v）的水溶液形式应用于软组织的显微切片（通常切片厚度为2–10 µm）33。将这一标准化的组织学染色方法应用于如完整小鼠肾脏等三维组织样本时，并不能产生可用于CT成像的衰减对比增强图像。一方面，这可归因于软组织在实验室微CT系统常用的X射线能量下固有的低衰减特性。通常，软组织主要由碳、氢、氧和氮组成34，因此无法产生明显的对比增强效果。另一方面，染色所用伊红的浓度较低也是限制因素。尽管一个伊红分子含有四个溴原子（高原子序数元素溴，Z = 3534），但仍未能达到X射线CT成像所需的灵敏度水平。
为了克服衰减对比度低的难题，研究了多种浓度的伊红。此处的限制因素是伊红在水中的最大溶解度，在水溶液中为30%（w/v）。根据朗伯-比尔定律，预期最高浓度的伊红可在软组织中产生最佳的衰减对比度增强效果，实验结果也确实如此。因此，最终染色方案采用最高浓度的伊红进行。
通过调节pH值，解决了如何在分子水平上对软组织进行最佳处理以优化染色过程并进一步提高对比度增强效果的问题。研究发现，在固定或染色前对软组织样本进行酸化处理至关重要，这一点也由Hong等人35证实。酸性环境通过增强离子相互作用，促进了染色剂在细胞质内的富集，这种离子相互作用的增强源于细胞质中蛋白质和多肽的氨基酸侧链发生质子化。与未染色的软组织样本相比，对比度增强的代表性结果如图1a,b所示。该结果实现了对整只小鼠肾脏的结构概览，清晰呈现了皮质、髓质、肾乳头和肾盂等关键解剖区域。
本染色方案操作简便，仅包含三个步骤，所需试剂易于获取。整体染色时间为24小时，对于完整器官的染色而言速度较快，可在实验室环境中实现软组织样本的多尺度三维可视化，直至细胞水平（图1c、图2b 和 图4b）。需要注意的是，根据样本性质的不同，整体染色时间及所需染色液体积可能需进行适当调整。尽管如此，基于伊红的染色方案适用于完整器官染色，从而实现对整个器官的高分辨率显微CT成像。在显微CT扫描过程中使用乙醇作为溶剂以保持样本湿润，但未观察到由此引起的收缩伪影。若需进行纳米CT成像以研究从原始样本中获取的较小组织片段，则需额外的制备步骤。针对未来的组织病理学应用，整体扫描将有助于深入了解解剖结构发生改变的区域，从而确定感兴趣区域（ROI），如 图2a 所示。这些区域可通过显微CT（图1c 和 图2b）或纳米CT（图4b）进行三维研究，并通过组织学方法进行二维评估（图3）。
该方案的另一优势体现在其与组织病理学中苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色程序的完全兼容性。尽管所用伊红浓度远高于组织学染色液，但基于伊红的染色方法应用于大块样本后，并不妨碍后续的组织学分析（图3）。纳米CT中虚拟厚度约为400 nm的切片（图3a）已与相应软组织样本制备的组织学切片（图3c）具有良好的可比性。考虑到组织学切片的厚度通常约为7–10 µm，对纳米CT数据生成对应虚拟厚度约为7 µm的最小强度投影切片（图3b），可实现与组织学切片（图3c）更佳的对比。在此类图像中，细胞核清晰地表现为无衰减区域，因为伊红特异性地对细胞质中的蛋白质和多肽进行染色33。
即使与标准组织学染色程序相比染色顺序发生了逆转，仍有可能采用标准组织学方法进行进一步的复染。首先使用基于伊红的CT染色方案，随后对这些基于伊红的组织切片进行苏木精复染，可实现完全兼容，并获得高质量的染色结果，呈现出预期的形态特征。采用Mayer酸性苏木精对组织切片进行细胞核特异性染色，使细胞核呈现紫色（图3d）。目前组织学复染的应用仅限于H染色。其他标准组织学复染方法，如过碘酸雪夫染色、弹性纤维染色（Elastica van Gieson）或Gomori银染法，均需进一步评估，同时还需要测试其与免疫组织化学技术的兼容性。
基于伊红的染色方案具有以下优势：（i）特异性靶向细胞质，（ii）染色均匀且完整，（iii）操作简便，（iv）可快速渗透组织，且不会产生扩散环等伪影，（v）适用于大尺寸和高密度的软组织样本染色，（vi）与常规H&amp;#38;E染色在组织病理学上完全兼容。这些特性对于实现软组织在细胞水平上的高分辨率X射线CT成像至关重要。结合近年来开发的纳米CT设备12,36,37，现已能够无损地生成在对比度和分辨率上均可与传统组织学数据相媲美的虚拟组织切片。该联合方法将推动X射线CT成为三维可视化微观组织结构的有力工具。

对软组织样本进行全面表征需要获取其三维组织微结构信息。目前软组织样本分析的金标准是组织病理学。该方法利用光学显微镜在选定的兴趣区域（ROI）内以二维方式观察样本的组织和细胞形态1。然而，该方法存在若干缺点：样本制备过程耗时、复杂、具有破坏性，且容易引入假象；所制备的显微切片仅能提供与切片平面平行的二维信息；由于时间限制，通常所分析的组织学切片数量也受到限制2,3。
近年来，三维组织学领域不断发展。在此领域中，可获取来自任意理想空间平面的虚拟组织切片。这使得能够追踪样本中的结构，从而更深入地理解三维组织架构及其与不同病理状态相关的结构变化。为获得三维体积数据，已开发出多种方法。这些方法包括基于连续切片的技术，使用光学显微镜或电子显微镜4,5,6,7,8，以及块面成像方法，如表层显微三维成像或块面扫描电子显微镜技术7,8,9。然而，上述所有方法均涉及切片过程或完全破坏样本，因而无法进行后续研究。所获得的分辨率在很大程度上依赖于切片过程，易受传统组织学中所描述的人工假象影响。这些方法也存在图像对齐伪影的问题。
显微和纳米计算机断层扫描（microCT 和 nanoCT）等三维X射线成像技术旨在无需破坏组织样本即可生成高分辨率的三维数据。迄今为止，软组织的X射线衰减对比度较弱，以及在实验室环境中难以实现高分辨率，限制了这些技术在微观组织结构三维可视化中的应用。近年来，基于实验室的高分辨率X射线CT技术取得了进展，分辨率已可显著低于1 µm10,11,12,13。
在传统的基于衰减的X射线成像中，软组织对比度不足的问题通常通过染色剂来弥补，这些染色剂可增强X射线的衰减对比。来自其他成像技术的已知染色剂，如四氧化锇（OsO4）、碘化碘化钾（IKI）或磷钨酸（PTA），常被使用14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25。为了将X射线CT确立为用于微观组织结构三维可视化的工具，需要满足以下条件的染色剂：(i) 可实现特异性生物靶向；(ii) 染色均匀且完全；(iii) 易于操作；(iv) 能快速渗透组织而不产生如扩散环等伪影；(v) 可对大块且致密的组织进行染色；(vi) 与组织病理学完全兼容。在本研究中，我们展示了如何利用一种基于伊红的细胞质特异性X射线染色剂对软组织样本进行X射线CT成像前处理，该染色剂满足上述所有要求26。
多尺度成像方法通过整体微计算机断层扫描（microCT）测量评估染色质量，并选择感兴趣体积（VOIs）进行进一步的高分辨率研究。染色质量的分析重点关注以下染色参数：（i）染色完整性，（ii）扩散环的出现，（iii）对比度增强，（iv）CT伪影（如条纹）的出现，以及（v）均匀性。基于实验室的纳米CT系统利用几何放大实现低至100 nm的分辨率，可在（亚）细胞水平上可视化软组织形态10,27。将纳米CT切片与相应的组织学光学显微图像进行比较分析，证实了在二维微观水平上对组织结构的相似细节再现，从而实现对组织样本的组织病理学表征。本详细的视频实验方案旨在提高对该方法的认知，突出其作为一种非破坏性三维软组织成像工具的潜力，适用于动物学家、生物学家及健康专业人员等广泛的科学群体。

<table><tbody><tr><td>50 ml 离心管，Falcon</td><td>VWR</td><td>734-0453</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液，37%</td><td>Carl Roth</td><td>CP10.2</td><td>无酸，以约 10% 甲醇稳定</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>36289.AP</td><td></td></tr><tr><td>伊红 Y 二钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4382</td><td>经生物染色剂委员会认证</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Merck</td><td>L1825</td><td>Dulbecco 配方，不含钙和镁</td></tr><tr><td>样品管，Nalgene</td><td>Carl Roth</td><td>ATK5.1</td><td></td></tr><tr><td>摇床振荡器 ST5</td><td>CAT</td><td>60281-0000</td><td></td></tr><tr><td>纤维素吸水纸</td><td>VWR</td><td>115-0600</td><td></td></tr><tr><td>镊子，USBECK Laborger&amp;auml;te</td><td>VWR</td><td>232-0096</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，Eppendorf</td><td>VWR</td><td>211-2120</td><td>安全锁扣，2.0 ml</td></tr><tr><td>无水乙醇，Baker Analyzed</td><td>VWR</td><td>80252500</td><td></td></tr><tr><td>一次性安全手术刀，Aesculap</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>AESCBA210</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，Sterilin</td><td>VWR</td><td>391-2019</td><td></td></tr><tr><td>塑料巴斯德吸管</td><td>Carl Roth</td><td>EA68.1</td><td>带刻度，1 ml</td></tr><tr><td>干燥器，Duran</td><td>VWR</td><td>SCOT247826954</td><td></td></tr><tr><td>硅脂，Bayer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85404</td><td>高真空</td></tr><tr><td>带虹吸管的二氧化碳气瓶</td><td>Linde</td><td>3700113</td><td>10 kg，短型</td></tr><tr><td>微孔处理胶囊</td><td>PLANO GmbH</td><td>4614</td><td>孔径 78 &amp;micro;m（B）</td></tr><tr><td>Bal-Tec CPD 030</td><td>Bal-Tec AG</td><td></td><td>以 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 作为干燥剂</td></tr><tr><td>Stemi 2000-C 体视显微镜，配备 KL 1500 LCD</td><td>Zeiss</td><td></td><td>该体视显微镜已更新&lt;sup&gt;(1)&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Zeiss Xradia Versa 500</td><td>Zeiss</td><td></td><td>该微计算机断层扫描仪已更新&lt;sup&gt;(2)&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Avizo Fire 8.1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PILATUS 探测器，作为纳米 CT 扫描仪的一部分</td><td>Dectris</td><td></td><td>单光子计数探测器&lt;sup&gt;(4,5)&lt;/sup&gt;；市面上已有商用纳米 CT 系统 &lt;sup&gt;(6,7)&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>纳米焦点 X 射线源，作为纳米 CT 扫描仪的一部分</td><td>Excillum</td><td></td><td>高通量纳米焦点 X 射线透射管&lt;sup&gt;(3)&lt;/sup&gt;；市面上已有商用纳米 CT 系统&lt;sup&gt;(6,7)&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>(1) 德国，Z. ZEISS 产品信息：ZEISS 体视显微镜 https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006&gt;（2019 年 9 月 6 日）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(2) 德国，Z. ZEISS 产品信息：ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html&gt;（2019 年 4 月 10 日）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3) Nachtrab, F. 等. 基于 Timepix 的 NanoXCT 项目探测器开发. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015)。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(4) Kraft, P. 等. 单光子计数 PILATUS 探测器模块的性能. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009)。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5) Kraft, P. 等. PILATUS 探测器的表征与校准. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009)。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(6) 德国，Z. ZEISS 产品信息：ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html&gt;（2019 年 4 月 9 日）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(7) 公司，G. E. GE 产品信息：Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf&gt;（2019 年 4 月 10 日）。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用x射线特异性染色法与纳米级计算机断层扫描对软组织样本进行三维成像

3D Imaging of Soft-Tissue Samples using an X-ray Specific Staining Method and Nanoscopic Computed Tomography

我们展示了一种基于实验室的方法，该方法结合了X射线显微CT（microCT）和纳米CT（nanoCT），并使用一种特异性靶向细胞质的X射线染色剂。所述实验方案易于操作、速度快，适用于较大的软组织样本。该方法能够对关键组织结构进行三维表征，并以完整的小鼠肾脏为例进行了演示。这种多尺度成像方法可实现对整个小鼠肾脏的成像，并支持进一步选择感兴趣区域，随后以更高的分辨率（可达纳米级）对这些区域进行成像。由此获得的软组织形态细节水平与相应的组织学光学显微图像相当。该方法在不干扰后续组织学分析的前提下，实现了对组织结构三维构型的深入观察。

图1展示了低分辨率显微CT数据的CT切片和体积渲染，突出显示染色后的对比度增强效果。图2展示了从小鼠全肾局部断层扫描获得的高分辨率显微CT数据的CT切片和体积渲染。图3展示了纳米CT数据的CT切片，并与相应的组织学切片进行对比。图4展示了纳米CT数据的CT切片及体积渲染，突出显示细胞水平的结构细节。低分辨率显微CT测量可提供整个器官的概览，并有助于识别高分辨率显微CT测量的兴趣区域（VOI）。通过这种多尺度方法，确定了纳米CT的兴趣区域。纳米CT能够在细胞水平上对软组织样本进行极为详细的观察。与相应组织学切片的对比研究显示出与组织病理学完全兼容。在此，多模态成像方法验证了两种模态所获得的结果。
<img alt="小鼠肝脏的显微CT横截面，标注解剖结构，断层分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60251/60251fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1. 低分辨率显微CT数据的CT切片与容积重建。（a,b）同一只小鼠肾脏在染色前（a）和染色后（b）的概览图像，突出显示基于伊红染色方案处理后获得的对比度增强效果。两组显微CT数据均采用相同的采集参数获取，体素尺寸均为12 µm。在图像（b）中实现的对比度增强使得以下解剖结构区域得以识别：皮质（I）、外髓质（II），其中进一步区分为外髓质外带（IIa）和外髓质内带（IIb）、内髓质（III）、肾乳头（IV）以及肾盂（V）。（c）显微CT数据的容积重建图像，显示穿过整个小鼠肾脏的虚拟矢状切面。该图经由Busse和Müller等26修改而来。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60251/60251fig1alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="3D骨结构分析、微CT横截面及500µm分辨率下的体积渲染。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60251/60251fig2a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2. 应用基于伊红的染色方案后，同一只小鼠肾脏获得的高分辨率微CT数据的CT切片与体积渲染图。（a）左上角为概览性微CT图像，突出显示了用于展示高分辨率图像的感兴趣区域（ROI，蓝色框）。以下解剖结构区域可被识别：皮质（I）、外髓质（II），其中进一步区分为外髓质外带（IIa）和外髓质内带（IIb）、内髓质（III）、肾小盏（IV）以及血管（V和VI）。（b）以3.3 µm体素尺寸采集的高分辨率微CT数据的感兴趣区域体积渲染图。图像展示了髓质区域，以及通过对整个肾脏进行局部断层扫描重建得到的血管虚拟切面。该图经Busse和Müller等人的研究修改而来26。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60251/60251fig2alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织切片的显微镜图像、比较分析、细胞结构、20 μm 比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60251/60251fig3a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3. 应用基于伊红的染色方案后，同一小鼠肾脏的nanoCT数据CT切片（a,b）与组织学切片（c,d）的对比。（a）经染色、解剖和临界点干燥处理后的小鼠肾脏样本的nanoCT图像，显示了在图1和图2中所见区域（IIb）的详细结构，即亨利氏袢的粗升支。（b）由（a）中相同nanoCT数据集生成的最小强度投影切片，虚拟切片厚度约为7 µm，可清晰显示细胞核。（c）代表性组织学切片，显示亨利氏袢的粗升支，细胞核和刷状缘清晰可见。该组织学切片厚度约为7 µm，来自同一小鼠肾脏样本，在应用基于伊红的染色后包埋于石蜡块中制备而成。（d）应用苏木精复染的代表性组织学切片，使细胞核呈现紫色。该切片制备位置接近（c）所示切片，厚度约为7 µm。本图经Busse和Müller等26修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60251/60251fig3alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="多孔结构的显微分析；图像 a）二维截面，b）三维重建。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60251/60251fig4a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4. 纳米CT数据的CT切片与容积重建。 (a同一小鼠肾脏样本的纳米CT图像，显示了亨利氏袢的粗升支结构。此为图中区域（IIb）的详细视图 图1 和 图2 从肾脏的一小块组织中获取，体素尺寸约为400 nm。样品制备过程包括染色、解剖和临界点干燥（CPD）。b) 基于nanoCT数据的体渲染，显示亨利氏袢升支粗段的三维结构。该图已根据Busse和Müller等人的研究修改。26 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60251/60251fig4alarge.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种利用专为X射线计算机断层扫描设计的X射线特异性染色方法，对微观组织结构进行三维可视化的实验方案。

利用X射线特异性染色法与纳米级计算机断层扫描对软组织样本进行三维成像

我们展示了一种基于实验室的方法，该方法结合了X射线显微CT（microCT）和纳米CT（nanoCT），并使用一种特异性靶向细胞质的X射线染色剂。所述……

我们的新方案实际上能够通过X射线计算机断层扫描技术实现细胞结构的三维可视化。我们通过伊红对组织进行染色，从而使细胞质可见。除了医学应用和研究外，我们还认为该方法可应用于生物学领域，例如动物学研究或发育生物学。该技术相对简单，速度非常快，也适用于较大的组织样本。我们认为，将我们的方法与X射线显微计算机断层扫描相结合，可整合到临床工作流程中，从而真正帮助病理学家做出更准确的决策。首先固定软组织样本。取一个50毫升离心管，加入固定液，其中包含9.5毫升4%甲醛和0.5毫升冰醋酸。将软组织样本放入离心管中，于冰箱中冷藏固定24至72小时。固定结束后，用DPBS溶液洗涤软组织样本1小时。然后将样品置于2 mL伊红Y染色液中染色，并在水平摇床上孵育24小时。次日，小心地将软组织样品从样品容器中取出，并用纤维素纸巾去除多余的染色剂。将其置于锥形容器中，放置于乙醇蒸气相上方，用于储存和后续使用。根据手稿说明准备合适的样品支架，用于安装软组织样品，并确保紧密贴合，以防止样品在X射线CT测量过程中发生移动。待粘合剂完全固化且样品支架可使用后，将小鼠肾脏转移至一个完整的离心管中，管底预先加入少量70%乙醇。随后将安装好的样品放入X射线CT扫描仪中。在仔细对齐样品后，选择最佳成像质量的采集参数。对于所提供的显微CT数据，在50千伏峰值电压和3.5瓦电流下，以均匀分布在360度范围内的1601个投影进行扫描采集。然后利用低分辨率CT概览扫描获得的显微CT数据，选定高分辨率CT扫描的目标区域。使用解剖刀和体视显微镜将软组织样本切成边长约0.5毫米的小块，以制备所需体积的样本。若使用小鼠肾脏，则沿其最长轴将其切成两半，取其中一半并分离出不同的解剖区域，如肾皮质和肾髓质。将小块样品转移至新的培养皿中进行脱水。根据手稿说明，使用一系列乙醇溶液对样品进行脱水处理，每步脱水处理持续一小时。将脱水后的样品转移至微孔胶囊中，并将其封闭。始终使样品保持与100%乙醇接触。随后对小块组织进行临界点干燥。组织样品制备完成后，置于新的培养皿中，并存放于干燥器内，以备后续使用。将组织样本固定在合适的样品台上，确保紧密贴合。对于小鼠肾脏，使用超级胶水在体视显微镜下将样本片固定于样品台上。在仔细调整样本位置后，选择最佳成像质量的采集参数。对于所提供的纳米CT数据，在60千伏峰值电压下采集投影，共采集1599个在360度范围内均匀分布的投影，体素大小约为400纳米。该方案用于小鼠肾脏微观组织结构的三维可视化。低分辨率的显微CT测量可提供整个器官的概览，并有助于确定高分辨率测量的兴趣区域。同一只小鼠的肾脏用于获取高分辨率的微型CT数据。从而能够更详细地观察皮质、外髓质、内髓质等解剖结构。对感兴趣区域进行三维重建，展示了髓质区域以及血管的虚拟切面。采用纳米CT在细胞水平上获取肾脏样本的详细图像。取自整只小鼠肾脏的一小块组织，用于成像髓袢升支粗段，体素尺寸约为400纳米。通过对比研究证实，纳米CT与组织病理学完全兼容。多模态成像方法验证了两种技术所获得的结果。在孵育步骤中，关键是要确保样品完全被染色液包围。此外，在进行CT X射线成像时，最重要的是确保数据采集过程中样品的稳定性。采用本方案分析过的软组织样本，可进一步使用标准组织学技术（如苏木精复染）进行分析。我们的染色方案将显著推动三维X射线组织学的发展。医学研究将尤其受益于这种非破坏性三维成像技术。

3d-imaging-soft-tissue-samples-using-an-x-ray-specific-staining

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用 X 射线特定染色方法和纳米计算机断层扫描对软组织样本进行 3D 成像

我们在欧洲同步辐射设施（ESRF）利用同步辐射X射线断层扫描技术，以0.7µm的像素分辨率无创地获取三维断层扫描数据集。通过体渲染软件，可在无需组织学切片的情况下，以自然状态重建内部结构，避免了由组织学切片所导致的人工假象。...

使用同步辐射X射线断层扫描实现亚微米分辨率的非侵入式三维可视化

只有通过断层扫描技术才能实现无损的体积可视化，其中最有效的方法是X射线显微计算机断层扫描（CT）。...

Ex-Vivo 生物样本的显微CT高分辨率三维成像

高分辨率X射线计算机断层扫描（HRCT）是一种非破坏性诊断成像技术，可用于三维研究植物维管系统结构与功能。我们展示了HRCT如何促进对多种植物组织和物种中木质部网络的探索。...

利用高分辨率计算机断层扫描技术可视化植物维管系统的三维结构与功能

利用现代塑料挤出和打印技术，现在可以快速且低成本地制作实验室获取的X射线CT数据的物理模型。体层扫描数据的三维打印已成为一种强大的可视化、研究和教育工具，目前前临床影像学领域已可便捷获取该技术。...

3D打印临床前X射线计算机断层扫描数据集

我们开发了相关方案并设计了一种定制装置，以实现毫米级样本的包埋。本文介绍了样本制备流程，重点阐述了使用丙烯酸树脂和聚酰亚胺管进行包埋的方法，以实现样本的刚性固定和长期保存，从而便于通过显微CT对组织结构和细胞形态进行研究。...

通过显微计算机断层扫描实现固定与染色后毫米级完整样本的刚性包埋，用于无切片三维组织学研究

微型X射线计算机断层扫描技术在获取无损人体标本的三维信息方面具有显著效果，但在观察软组织时存在局限性。使用磷钨酸作为对比剂可解决这一问题。我们采用该对比剂对人体精细的纤维肌肉组织（眼轮匝肌支持韧带）进行了观察研究。...

使用微米级X射线计算机断层扫描结合磷钨酸染色技术可视化人纤维肌性组织

对临床组织样本进行纳米级成像有助于加深对疾病发病机制的理解。扩展病理学（ExPath）是扩展显微技术（ExM）的一种改进版本，经过优化可兼容常规临床组织样本，从而利用传统的衍射受限显微镜研究生物分子的纳米级空间排布。...

通过物理性各向同性膨胀实现人体组织切片的纳米级成像

本文介绍了一种利用显微计算机断层扫描技术对黑腹果蝇（Drosophila...

整体动物成像 黑腹果蝇 使用显微计算机断层扫描

本文介绍了一种用于冷冻软X射线断层成像（SXT）的实验方案，该方案描述了对完整冷冻保存的细胞进行超微结构成像所需的样品制备和数据采集步骤，成像分辨率达到25...

通过低温软X射线断层扫描对细胞进行三维制图描述

本文提供了详细、可靠且互补的实验方案，用于对厚度从100...

三维类器官和球状体模型的染色与高分辨率成像

了解使用X射线计算机断层扫描和伊红染色对小鼠肾脏等软组织进行三维可视化的方法。该技术可与组织病理学兼容，有助于病理学家做出更准确的诊断决策。

利用X射线特异性染色法与纳米级计算机断层扫描对软组织样本进行三维成像

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