利用X射线特异性染色法与纳米级计算机断层扫描对软组织样本进行三维成像

我们的新方案实际上能够通过X射线计算机断层扫描技术实现细胞结构的三维可视化。我们通过伊红对组织进行染色，从而使细胞质可见。除了医学应用和研究外，我们还认为该方法可应用于生物学领域，例如动物学研究或发育生物学。

该技术相对简单直接，速度非常快，也适用于较大的组织样本。我们认为，将我们的方法与X射线显微计算机断层扫描相结合，可整合到临床工作流程中，从而真正帮助病理学家做出更准确的决策。首先固定软组织样本。

向一个50毫升离心管中加入固定液，固定液包含9.5毫升4%甲醛和0.5毫升冰醋酸。将软组织样本放入离心管中，4°C冰箱中固定24至72小时。固定后，用DPBS溶液洗涤软组织样本1小时。

然后将样本置于2 mL伊红Y染色液中染色，并在水平摇床中孵育24小时。次日，小心将软组织样本从样本容器中取出，并用纤维素纸巾去除多余的染色剂。将其置于锥形容器中，放置于乙醇蒸气相上方，用于储存和后续使用。

根据手稿说明准备合适的样品台，用于安装软组织样品，并确保固定紧密，防止样品在X射线CT扫描过程中发生移动。待粘合剂完全固化且样品台准备好后，将小鼠肾脏转移至一个完整的离心管中，管底预先加入少量70%乙醇。随后将安装好的样品放入X射线CT扫描仪中。

在仔细对准样品后，选择最佳成像质量的采集参数。对于所提供的显微CT数据，在50千伏峰值电压和3.5瓦电流下，使用在360度范围内均匀分布的1601个投影进行扫描采集。然后利用低分辨率CT概览扫描获得的显微CT数据，选定高分辨率CT扫描的目标区域。

使用解剖刀和体视显微镜将软组织样本切成边长约0.5毫米的小块，以制备所需体积的样本。若使用小鼠肾脏，则沿其最长轴将其切为两半，取其中一半并分离出肾皮质和肾髓质等不同解剖区域。

将小块样品转移至新的培养皿中进行脱水。根据手稿说明，使用一系列乙醇溶液对样品进行脱水处理，每步脱水处理持续一小时。将脱水后的样品放入微孔胶囊中，并将其封闭。

始终使样品保持与100%乙醇接触。然后对小块组织进行临界点干燥。组织样品制备完成后，将其置于新的培养皿中，并存放于干燥器内，以备后续使用。

将组织样本固定在合适的样品台上，确保紧密贴合。对于小鼠肾脏，使用超级胶水在体视显微镜下将样本固定于样品台上。在仔细调整样本位置后，选择最佳成像质量的采集参数。

对于所提供的纳米CT数据，在60千伏峰值电压下采集投影，共采集1599个在360度范围内均匀分布的投影，体素尺寸约为400纳米。该方案用于小鼠肾脏微观组织结构的三维可视化。低分辨率的显微CT测量可提供整个器官的概览，并有助于确定高分辨率测量的兴趣区域。

同一只小鼠的肾脏用于获取高分辨率的微型CT数据。从而能够更详细地观察皮质、外髓质、内髓质等解剖结构。对感兴趣区域进行三维重建，展示了髓质区域以及血管的虚拟切面。

采用纳米CT在细胞水平上获取肾脏样本的详细图像。取自整只小鼠肾脏的一小块组织，用于成像髓袢升支粗段，体素尺寸约为400纳米。通过对比研究验证了纳米CT与组织病理学完全兼容。

多模态成像方法验证了两种技术所获得的结果。在孵育步骤中，关键是要确保样品完全被染色液包围。此外，在进行CT X射线成像时，最重要的是确保在数据采集过程中样品的稳定性。

采用本方案分析过的软组织样本，可进一步使用标准组织学技术进行分析，例如苏木精复染。我们的染色方案将显著推动三维X射线组织学的发展。医学研究将特别受益于这种非破坏性三维成像技术。