Name: 鼠乳层文化中自我更新的量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学习使用小鼠乳腺细胞进行乳腺球培养与自我更新定量分析的方法。该技术通过图像分析软件量化细胞生长速率，为癌症干细胞增殖研究提供简单且经济有效的实验工具。

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我们感谢布鲁诺·阿马蒂（Bruno Amati）惠赠Rosa26-MycER转基因小鼠模型。本工作由世界癌症研究基金会（WWCR）、意大利癌症研究协会（AIRC）、欧洲研究委员会（ERC）和意大利卫生部资助，资助对象为P.G.P.。T.V.和X.A.由意大利癌症研究基金会（FIRC）支持，A.S.由FUV基金资助。

体内实验严格按照欧盟指令2010/63执行，并经本机构动物福利组织（Organism for Animal Wellbeing——OPBA）及意大利卫生部批准（IACUC编号：762/2015和537/2017）。
1. 小鼠乳腺组织的采集与消化
<ol>
	<li>进行典型实验时，通过吸入 CO2 处死 8–10 周龄的未交配雌性小鼠。根据实验目的，使用 5–30 只小鼠。将小鼠置于解剖板上，并放置在通风橱内。用针固定前肢，并用乙醇冲洗动物体表毛发。</li>
	<li>用镊子提起皮肤，从骨盆区域开始沿垂直方向切开，一直切至颈部，注意保持腹膜完整。为避免划破皮肤或腹膜，请使用圆头剪刀。</li>
	<li>沿身体侧轴方向轻柔地使用剪刀，小心地将皮肤从身体上分离。</li>
	<li>当胸部和腹部区域的皮肤完全分离后，在动物四肢处做四个切口，并用针将皮肤固定。使用剪刀和镊子将动物身体完全与展开的皮肤分离。</li>
	<li>用镊子轻轻提起现已完全暴露的乳腺脂肪垫，并借助剪刀小心地将其从皮肤上分离。收集每只小鼠的下胸部和腹部乳腺组织，并将其浸入含 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）的 50 mL 锥形管中。每管最多收集 20 个腺体。将组织置于冰上保存。 
	注意：如有需要，组织可在冰上保存过夜。此为安全的暂停点。后续步骤应在无菌条件下进行。</li>
	<li>配制并过滤消化液：Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），添加 2 mM 谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、200 U/mL 胶原酶和 100 µg/mL 透明质酸酶（参见 材料表）。</li>
	<li>将最多 20 个腺体转移至一个 100 mm 培养皿中，使用手术刀或弯头剪刀将组织切碎。避免将大量 DPBS 液体转移至培养皿中。</li>
	<li>向每个培养皿中加入 10 mL 消化液，并使用 25 mL 血清移液管将切碎的组织转移至 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>用封口膜密封管子，并将其置于旋转仪上。将旋转仪调至低速（0.03 x g），在含 5% CO2 的湿润环境中 37 °C 孵育 2.5 小时。</li>
	<li>在进入下一步前，先肉眼检查悬液状态。若仍有较大组织块未完全消化，可在 37 °C 继续孵育 30 分钟。 
	注意：作为替代方案，也可使用温和的胶原酶/透明质酸酶混合酶液，在 37 °C、5% CO2 条件下过夜消化13。</li>
</ol>
2. 小鼠原代乳腺上皮细胞的分离
<ol>
	<li>停止旋转并从培养箱中取出试管。将P1000枪头置于5 mL血清移液管的开口处。若悬液能通过P1000枪头，则进行下一步操作；否则，在37 °C下继续孵育30分钟。</li>
	<li>在4 °C下以100 × g 离心5分钟。小心弃去上清液，并将每管沉淀重悬于3 mL DPBS中。 
	注意：低速离心可去除淋巴细胞和脂肪组织细胞。此步骤需轻柔操作，避免沉淀物脱落。</li>
	<li>分别对每管细胞悬液依次使用100、70和40 µm细胞筛进行过滤。每次过滤前，用2 mL DPBS冲洗滤网，再收集滤过液。 
	注意：自此步骤起，可将各管细胞悬液合并后一同处理。</li>
	<li>在4 °C下以300 × g 离心5分钟。小心弃去上清液，并将细胞重悬于残留的DPBS体积中。</li>
	<li>通过加入等体积的氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液（见材料表）进行红细胞（RBC）裂解。用移液器吹打混匀，并在冰上孵育最多5分钟。</li>
	<li>加入10 mL DPBS，在4 °C下以300 × g 离心5分钟。小心弃去上清液，并目视检查沉淀。若沉淀呈白色，则进行下一步操作；否则重复红细胞裂解步骤（步骤2.5）。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于1–5 mL乳腺球培养基中：乳腺上皮细胞基础生长培养基（MEBM），添加2 mM谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、5 µg/mL胰岛素、0.5 µg/mL氢化可的松、2% B27、20 ng/mL表皮生长因子（EGF）、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和0.4 IU/mL肝素（见材料表）。</li>
</ol>
3. 连续乳腺球重铺板
<ol>
	<li>为建立乳腺球培养体系，将细胞以每毫升200,000个活细胞的密度接种于未经组织培养处理（超低黏附）的6孔板中，培养基为乳腺球培养基。在37 °C、5% CO2条件下孵育7-10天。</li>
	<li>在95%乙醇中配制并过滤1%聚HEMA溶液（参见材料表）。为后续传代培养做准备，向超低黏附6孔板每孔加入400 µL 1%聚HEMA溶液，待乙醇完全挥发后完成包被。为获得更佳效果，建议重复包被两次。 
	注意：首次传代时使用未包被的培养板，可选择性去除成纤维细胞。</li>
	<li>7-10天培养结束后，收集所有孔中的初代乳腺球，于4 °C下以300 × g离心5分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液，使用带滤芯吸头的P200移液器对乳腺球进行机械性解离。反复吹打约100次，并在显微镜下观察悬液中是否存在较大的球状结构。 
	注意：可将球状细胞团在37 °C、5% CO2条件下，用少量（0.2–0.5 mL）胰蛋白酶或Accutase短时孵育（2–5分钟），以促进机械解离。每次传代接种前需新鲜配制乳腺球培养基（步骤2.7）。</li>
	<li>用1–5 mL新鲜乳腺球培养基重悬细胞，计数活细胞数。如需要，将细胞分入不同处理组或培养条件中。</li>
	<li>以每毫升20,000个活细胞的密度接种于聚HEMA包被的超低黏附6孔板中，在37 °C、5% CO2条件下孵育。 
	注意：乳腺球在接种后5–7天内达到最大尺寸。尽可能将每个样本或条件的细胞分配至多个孔中，以获得技术重复。接种密度应保持较低，以避免细胞聚集。建议6孔板不超过20,000个细胞/mL，24孔板不超过5,000个细胞/mL。</li>
	<li>5–7天后，计数每孔中的球体数量。可通过配备10倍放大镜头的显微镜手动计数，或采用数字图像分析（参见步骤4）。</li>
	<li>分别收集各孔中的乳腺球，于4 °C下以300 × g离心5分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液，使用带滤芯吸头的P200移液器对乳腺球进行机械性解离。反复吹打约100次，并在显微镜下观察悬液中是否存在较大的球状结构。</li>
	<li>用1 mL新鲜乳腺球培养基重悬细胞，计数活细胞数。将每个样本或条件的细胞合并后，重复步骤3.6–3.10。记录每次传代时接种的细胞数以及每孔计数得到的球体数和细胞数。随后进行步骤5，用于累计生长量的计算。</li>
</ol>
4. 使用数字图像分析（DIA）进行类球体计数
<ol>
	<li>每次传代结束时，使用体视显微镜上安装的数码相机扫描所有孔的整个表面，并获取球体的图像。将图像保存为 .tif 文件。</li>
	<li>在 ImageJ14 中以图像序列形式导入体视显微镜图像。设置图像比例尺，并将图像类型设为 8 位。</li>
	<li>复制图像堆栈，然后从菜单栏的处理选项卡中选择减去背景。勾选浅色背景和滑动抛物面选项，点击确定按钮。对堆栈中的所有图像执行此操作。</li>
	<li>从菜单栏的图像选项卡中依次选择调整，然后选择阈值。点击应用后，将弹出标题为将堆栈转换为二值图像的对话框。方法选择默认，背景选择浅色。勾选为每幅图像计算阈值，然后点击确定按钮。</li>
	<li>从菜单栏处理选项卡下的二值化列表中，依次选择分水岭、开操作和腐蚀命令。在弹出的对话框中点击是，对堆栈中的所有图像进行处理。 
	注意：这些处理步骤可实现相互接触物体的视觉分割、物体平滑化以及去除物体边缘的像素。</li>
	<li>从分析菜单中选择分析颗粒功能。将最小面积阈值设为 10,000 µm2，圆形度设为 0.50 至 1.00。在显示下拉菜单中选择椭圆选项。勾选汇总、排除边缘对象和原位显示，然后点击确定按钮。对堆栈中的所有图像执行此操作。</li>
	<li>目视检查椭圆与球体的对应情况，如有需要，相应地校正颗粒计数。将每个孔所有帧的计数相加，得到每个孔的乳腺球体总数。</li>
</ol>
5. 累积生长曲线计算
注意：每次传代（PN）结束时，每个孔中计数的乳腺球数量反映了在PN开始时接种的乳腺球起始细胞数量。
<ol>
	<li>针对每次传代（PN），记录接种的细胞数量以及每孔中计数的细胞数和球体数。计算每次传代结束时的球体大小： 
	球体大小 PN（细胞数/球体）= PN 计数的细胞数 / PN 计数的球体数 
	注意： PN 时的球体大小反映了在 PN 接种的每个乳腺球起始细胞的增殖潜能。</li>
	<li>通过将 PN 接种的细胞数除以上一次传代结束时（PN-1）计算得到的球体大小，推算接种的球体数量： 
	PN 接种的球体数 = PN 接种的细胞数 / PN-1 球体大小 
	注意： 按照惯例，在培养的第一代中球体大小被视为稳定（即 P0 球体大小 = P1 球体大小）。若使用多个孔作为技术重复，则分母应采用 PN-1 的平均球体大小。</li>
	<li>计算每次传代每孔的累积细胞数和累积球体数： 
	PN 累积数量 = （PN 计数数量 / PN 接种数量）× PN-1 累积数量。 
	注意： 按照惯例，P0 累积数量 = P1 接种数量。若使用多个孔作为技术重复，则应针对每次传代计算每个样本或条件的平均累积数量。</li>
	<li>将数据点绘制在半对数坐标图上。横轴（线性刻度）表示传代次数（P0 至 PN），纵轴（对数刻度）表示累积细胞数或累积球体数。</li>
	<li>对数据点拟合指数趋势线，并计算决定系数（R2）以评估拟合优度。 
	注意： 拟合的趋势线应近似指数曲线，这符合以恒定速率生长或死亡的细胞群体的预期特征。R2 的取值范围为 0 到 1，越接近 1 表示拟合效果越好。</li>
	<li>将趋势线方程表示为自然指数函数，以推断培养物的生长速率（GR）： 
	y = y0 e(GR)x，其中 y0 是当 x = 0 时 y 的值。</li>
</ol>

<ol><li>Kordon, E. C., Smith, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entire+functional+mammary+gland+may+comprise+the+progeny+from+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell.</a> Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li>
<li>van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage+and+time+dictate+the+fate+of+Wnt%2Fbeta-catenin-responsive+stem+cells+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).</li>
<li>Van Keymeulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stem+cells+contribute+to+mammary+gland+development+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance.</a> Nature. 479 (7372), 189-193 (2011).</li>
<li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138 (6), 1083-1095 (2009).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Grimshaw, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Research. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Pece, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+molecular+heterogeneity+of+breast+cancers+correlates+with+their+cancer+stem+cell+content%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content.</a> Cell. 140 (1), 62-73 (2010).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Santoro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Loss+in+Breast+Cancer+Leads+to+Myc+Activation%2C+Increased+Cell+Plasticity%2C+and+Expression+of+a+Mitotic+Signature+with+Prognostic+Value%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value.</a> Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+mammary+stem%2Fprogenitor+cell+isolation%3A+Different+method+matters%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Springerplus%22%5BJournal%5D)">Murine mammary stem/progenitor cell isolation: Different method matters?</a> Springerplus. 5, 140(2016).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Murphy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+thresholds+govern+Myc%27s+biological+output+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct thresholds govern Myc's biological output in vivo.</a> Cancer Cell. 14 (6), 447-457 (2008).</li>
<li>Bailey, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Tracking+of+Breast+Cancer+Cells+Enables+Prediction+of+Sphere+Formation+from+Early+Cell+Divisions%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions.</a> iScience. 8, 29-39 (2018).</li>
<li>Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+formation+assay+from+human+breast+cancer+tissues+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li>
<li>Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+sphere+culture+cannot+maintain+a+high+ratio+of+cancer+stem+cells%3A+a+mathematical+model+and+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li>
<li>Smart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+breast+cancer+cell+line+tumourspheres+and+primary+human+breast+epithelia+mammospheres+demonstrates+inter-+and+intrasphere+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li>
<li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+Generation+of+Somatic+Stem+Cells+by+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种在体外对乳腺干细胞（MaSC）生长特性进行定量描述的实验方案。以低水平组成型Myc表达对正常小鼠MaSCs的影响为例进行了说明。然而，该方法同样适用于多种不同实验条件。人或小鼠的原代细胞以及已建立的细胞系均可在无贴壁依赖的条件下培养，以建立可连续传代的乳腺球培养体系。通过在第一次传代末期（步骤3.5之后）加入病毒转导步骤，可方便地在该方案中引入基因过表达或RNA干扰。或者，也可先在贴壁条件下感染细胞，再将其接种为乳腺球进行培养。
本实验方案的一个关键环节是细胞接种密度，该密度应足够低，以避免形成聚集体而干扰结果的解读16,17。乳腺球的形态有助于解决这一模糊性问题。每次传代结束时，仅应计数结构致密、呈圆形的球体。球状体的圆度和大小均需纳入考量。通过DIA的自动化分析流程，可在客观且绝对的基础上，利用适当的阈值确保此步骤的准确性。通常，前体细胞会形成腺泡样结构或较小的细胞簇，这些应从乳腺球计数中排除。作为经验法则，我们采用100 µm直径作为阈值。最后，需注意避免将完整或未完全解离的乳腺球从一次传代转移至下一次。另一方面，过度吹打会导致细胞死亡增加。因此，若遇到此类困难，建议采用温和的胰蛋白酶消化或使用Accutase处理，并将解离后的细胞球通过40 µm滤网，以确保获得单细胞悬液。
集落形成效率（SFE）已被用作体外乳腺球培养中干细胞（SC）或肿瘤干细胞（CSC）定量的替代指标。SFE 确实可反映特定细胞群体中具有干细胞样特性的细胞比例。然而，该方法较为粗略，因其仅能提供特定时间点的信息。相比之下，通过计算累积球体数量并绘制累积生长曲线，可推断出从初始细胞接种开始，直至培养物耗尽（或对于永生化培养物而言，达到所需传代次数）期间的细胞生长速率。对生长特性的评估，首先可通过决定系数 R2 判断其偏离指数生长的程度，继而进一步评估 GR 值本身。
重要的是，累积性乳腺球生长曲线可用于评估小分子抑制剂或其他化疗药物在肿瘤干细胞（CSC）水平上的选择性作用6,11。与功能性上在5-7代后即耗竭的正常原代乳腺球不同，肿瘤来源的乳腺球往往能够无限扩增。这一特性与肿瘤干细胞无限的自我更新能力相关。通过分别绘制肿瘤细胞和乳腺球的生长曲线，可将对增殖和肿瘤干细胞自我更新的影响区分开来。预期肿瘤干细胞特异性的作用将导致累积性乳腺球生长速率下降，而对累积性细胞生长速率可能产生或不产生影响6,11。
最后，另一个研究热点是成体组织干细胞的重编程。完全发育的乳腺球由表型异质性的细胞群体组成，其中仅有一小部分细胞保留干细胞样特性，包括乳腺球形成能力以及移植到体内后再生乳腺组织的能力。6,9,11,18,19因此，可以通过体外标记保留实验分离乳腺前体细胞6,9,11 或利用已确立的表面标志物进行离体实验2,3值得注意的是，乳腺前体细胞无法在失巢凋亡中存活，也不能形成乳腺球。已有研究表明，强制性表达Myc可赋予经PKHneg分离的乳腺前体细胞以启动乳腺球形成的能力。11，从而获得可无限传代的细胞系。类似地，也可利用相同的实验方法检测生理重编程的负向调控因子的干扰作用。在此过程中，可能出现的一个常见问题是细胞起始数量有限。若起始细胞数低于10,000个，建议在24孔板中进行接种（每毫升最多接种5,000个活细胞）。然而，无贴壁依赖的培养条件可能对重编程效率的评估过于严苛，尤其是在重编程效应不立即显现的情况下。此时，使用支持性基质及三维类器官培养体系可能更为合适。20.
总体而言，乳腺球形成实验是一种经济高效的方案，可广泛用于评估正常及肿瘤性乳腺上皮细胞群体中的干细胞样特性。本实验方案采用定量方法，便于对不同培养条件或经不同刺激处理的细胞培养结果进行比较。若严格遵循本方案操作，可提供一个相对简单的体外模型系统，有助于解析体内决定干细胞特性的多种因素，从而为更深入的机制研究创造可能。

乳腺上皮干细胞和前体细胞的分离及体外培养已成为理解其在乳腺细胞生物学中特性的关键。巧妙的谱系示踪和连续移植实验使得研究人员能够在体内微环境背景下研究干细胞（SCs）及其他组织亚群。然而，该方法耗时较长，且需要构建报告基因小鼠模型1,2,3,4,5。因此，在体外培养和扩增乳腺干细胞（MaSCs）的同时保留其关键的干性特征，即自我更新能力和分化潜能，是该领域面临的最大挑战之一。近年来，乳腺球形成实验被广泛用于模拟正常乳腺组织和乳腺癌的生长过程，用于定量分析正常或肿瘤干细胞（CSCs），并以其自我更新能力作为替代指标，评估其在相应体内环境中的活性6,7,8,9,10,11。
乳腺球实验是一种高效且经济的方法，该方法将新分离的乳腺上皮细胞（MECs）在非黏附条件下进行培养，其原理是只有乳腺干细胞（MaSCs）能够存活并在悬浮状态下形成球状结构，而其他所有类型的细胞则会因失巢凋亡（anoikis）而死亡。此外，在连续的非黏附传代培养中能够形成多代乳腺球的能力，反映了MaSCs的自我更新能力6,9,11。本文描述了一种定量乳腺球实验的详细方案，该方案最初由Dontu及其同事7建立，是对早期神经球实验12的改进，能够在非黏附、无血清的条件下，通过添加适当的生长因子，促进假定干细胞（SCs）的生长7,12。

<table><tbody><tr><td>ACK 裂解缓冲液</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>氯化铵-氯化钾裂解缓冲液，100 mL。</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27 添加剂 50 倍浓缩液（10 mL）。终浓度为 2%（v/v）。</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>人重组碱性成纤维细胞生长因子，50 &amp;mu;g。储存液为 100 &amp;mu;g/&amp;mu;L，溶于 5 mM Tris 缓冲液（pH 7.6）。终稀释比例为 0.02%（v/v）。</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>来源于&lt;em&gt;Clostridium histolyticum&lt;/em&gt;的胶原酶，I-A 型，冻干粉末，1 g。储存液为 20,000 U/mL，溶于 DMEM。终稀释比例为 1%（v/v）。</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td>杜氏改良伊格尔培养基</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Microgem</td><td>S17859L0615</td><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Tebu-Bio</td><td>AF-100-15</td><td>人重组表皮生长因子。储存液为 100 &amp;mu;g/mL，溶于无菌 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O。终稀释比例为 0.02%（v/v）。</td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td>L-谷氨酰胺，200 mM。终稀释比例为 1%（v/v）。</td></tr><tr><td>肝素</td><td>PharmaTex</td><td>34692032</td><td>储存液浓度为 5,000 IU/mL。终稀释比例为 0.008%（v/v）。</td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>IV-S 型，粉末，固体中酶活性为 750–3,000 U/mg，30 mg。储存液为 10 mg/mL，溶于无菌 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O。终稀释比例为 1%（v/v）。</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>储存液浓度为 100 &amp;mu;g/mL。终稀释比例为 0.5%（v/v）。</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>SAFCBiosciences</td><td>91077C</td><td>人重组胰岛素，干粉，250 mg。储存液浓度为 1 mg/mL。终稀释比例为 0.5%（v/v）。</td></tr><tr><td>低吸附 6 孔板</td><td>Corning</td><td>351146</td><td>无菌 6 孔未处理细胞培养板，带透明平底和盖子。</td></tr><tr><td>MEBM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td>乳腺上皮细胞生长基础培养基</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素混合液</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td>每毫升含 10,000 U 钾盐青霉素和 10,000 &amp;micro;g 硫酸链霉素，溶于 0.85% 生理盐水。终稀释比例为 1%（v/v）。</td></tr><tr><td>Poly-HEMA</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td>溶于 95% 乙醇中，55 &amp;deg;C 过夜溶解。储存液浓度为 12%（w/v）。使用前以 95% 乙醇稀释至 1%（v/v），过滤（0.22 &amp;mu;m）。</td></tr></tbody></table>

小鼠乳腺球培养中自我更新能力的定量分析

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

乳腺具有强大的再生能力，因其在女性生命周期中会经历显著的激素变化。乳腺干细胞（MaSCs）的作用在生理/发育背景以及乳腺癌发生方面均受到广泛关注。在这一领域，针对MaSC特性的体外研究备受重视。乳腺球培养是器官形成的替代模型，已成为基础研究和转化研究中的重要工具。本文介绍了一种建立小鼠原代乳腺球培养体系及定量分析MaSC生长特性的详细方案。该方案包括乳腺组织的采集与消化、原代乳腺上皮细胞（MECs）的分离、原代乳腺球培养体系的建立、连续传代、乳腺球生长参数的定量分析以及结果解读。作为示例，我们展示了低水平组成型Myc表达对正常MECs的影响，可导致其自我更新能力和增殖能力增强。

Myc 在正常乳腺上皮细胞中的过表达导致乳腺球起始细胞频率增加。这一效应通过双重机制实现：Myc 提高乳腺干细胞对称分裂的速率，并增加前体细胞重编程为新的乳腺干细胞的频率。11为了检测低水平组成型Myc表达的影响，我们使用了Rosa26-MycER转基因小鼠模型，其中Myc活性可通过4-羟基他莫昔芬（4-OHT）诱导15我们首先将MECs接种于超低黏附6孔板中，以去除成纤维细胞，此过程未添加4-OHT。第一次传代后，将细胞培养物分为两组：两个孔保持未处理状态（对照组），另两个孔加入200 nM 4-OHT处理（MycER）。在三个独立实验中，连续计数5次传代的细胞球数量和细胞数量表1。每代次的累积细胞数和球体数显示在 表 2. 4-OHT诱导可提高成球率和细胞生长速度，如图所示 图1.
<img alt="图中显示细胞生长比较；MycER 与对照组；对数尺度；传代分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：代表性实验结果。 对照组与 MycER 乳腺球的累积球体数量（A）和细胞数（B）生长曲线。数据展示为3次独立实验的平均值及标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/60256fig1alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">第一次铺板</td>
			<td colspan="3">第二次铺板</td>
			<td colspan="3">第三次铺板</td>
			<td colspan="3">第四次铺板</td>
			<td colspan="3">第五次铺板</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>铺板细胞数</td>
			<td>细胞计数</td>
			<td>类球体计数</td>
			<td>铺板细胞数</td>
			<td>细胞计数</td>
			<td>类球体计数</td>
			<td>铺板细胞数</td>
			<td>细胞计数</td>
			<td>类球体计数</td>
			<td>铺板细胞数</td>
			<td>细胞计数</td>
			<td>类球体计数</td>
			<td>铺板细胞数</td>
			<td>细胞计数</td>
			<td>类球体计数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">实验1</td>
			<td rowspan="2">对照组</td>
			<td>77,000</td>
			<td>50,000</td>
			<td>31</td>
			<td>65,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>41</td>
			<td>57,000</td>
			<td>30,000</td>
			<td>32</td>
			<td>30,000</td>
			<td>22,000</td>
			<td>5</td>
			<td>22,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>77,000</td>
			<td>81,000</td>
			<td>41</td>
			<td>65,000</td>
			<td>55,000</td>
			<td>23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">MycER</td>
			<td>77,000</td>
			<td>31,0000</td>
			<td>193</td>
			<td>80,000</td>
			<td>375,000</td>
			<td>323</td>
			<td>80,000</td>
			<td>380,000</td>
			<td>217</td>
			<td>80,000</td>
			<td>220,000</td>
			<td>223</td>
			<td>80,000</td>
			<td>170,000</td>
			<td>155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>77,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>142</td>
			<td>80,000</td>
			<td>505,000</td>
			<td>396</td>
			<td>80,000</td>
			<td>270,000</td>
			<td>149</td>
			<td>80,000</td>
			<td>290,000</td>
			<td>194</td>
			<td>80,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">实验2</td>
			<td rowspan="2">对照组</td>
			<td>75,000</td>
			<td>75,000</td>
			<td>71</td>
			<td>60,000</td>
			<td>17,000</td>
			<td>34</td>
			<td>28,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>29</td>
			<td>45,000</td>
			<td>13,000</td>
			<td>2</td>
			<td>13,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75,000</td>
			<td>47,000</td>
			<td>45</td>
			<td>60,000</td>
			<td>11,000</td>
			<td>47</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">MycER</td>
			<td>75,000</td>
			<td>200,000</td>
			<td>188</td>
			<td>80,000</td>
			<td>225,000</td>
			<td>277</td>
			<td>80,000</td>
			<td>230,000</td>
			<td>155</td>
			<td>80,000</td>
			<td>210,000</td>
			<td>211</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>192</td>
			<td>80,000</td>
			<td>202,500</td>
			<td>283</td>
			<td>80,000</td>
			<td>305,000</td>
			<td>185</td>
			<td>80,000</td>
			<td>160,000</td>
			<td>237</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">实验3</td>
			<td rowspan="2">对照组</td>
			<td>82,500</td>
			<td>130,000</td>
			<td>121</td>
			<td>80,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>105</td>
			<td>80,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>86</td>
			<td>80,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>75</td>
			<td>58,500</td>
			<td>58,500</td>
			<td>78</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>82,500</td>
			<td>125,000</td>
			<td>177</td>
			<td>80,000</td>
			<td>71,250</td>
			<td>42</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">MycER</td>
			<td>82,500</td>
			<td>325,000</td>
			<td>457</td>
			<td>80,000</td>
			<td>610,000</td>
			<td>327</td>
			<td>80,000</td>
			<td>367,000</td>
			<td>309</td>
			<td>80,000</td>
			<td>500,000</td>
			<td>260</td>
			<td>80,000</td>
			<td>115,000</td>
			<td>146</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>82,500</td>
			<td>475,000</td>
			<td>463</td>
			<td>80,000</td>
			<td>455,000</td>
			<td>392</td>
			<td>80,000</td>
			<td>415,000</td>
			<td>204</td>
			<td>80,000</td>
			<td>470,000</td>
			<td>295</td>
			<td>80,000</td>
			<td>185,000</td>
			<td>161</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：每代培养中计数的细胞球数量以及接种并计数的细胞数量。
<img alt="显示对照组与 MycER 条件下不同传代次数中细胞计数的实验数据表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256table2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Table 2"> 
表 2：接种的类球体数量及累积类球体数量与细胞数量的计算。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/Table2.xlsx" target="_blank">请点击此处查看此表格的放大版本。（右键单击以下载。）</a>

本文介绍了体外乳腺球自我更新定量实验的结果实施与解读方法。

乳腺具有强大的再生能力，因其在女性生命周期中会经历显著的激素变化。

因此，乳腺球培养提供了一个易于操作的模型系统，用于研究和解析正常及癌变乳腺干细胞行为的重要特征，包括其自我更新和分化能力。我们的定量方法旨在以客观的方式评估乳腺球培养的生长速率，从而实现对不同类型细胞及不同培养条件的直接比较。在初次实验时，建议严格控制孵育时间，以避免过度消化，并确保每次接种前获得准确的细胞计数。本实验操作将由来自我实验室的技术员 Errico D'Elia 以夏洛莱公牛为例进行演示。从5至30只8至10周龄的雌性小鼠中取出四对腹侧及下胸部乳腺组织后，将最多20个腺体置于直径100毫米的培养皿中，加入最小体积的DPBS。将组织剪切成更小的碎片，并向组织碎片中加入10毫升消化液。使用25毫升血清移液管将组织块转移至50毫升锥形管中，并用石蜡膜密封管口。随后将组织碎片置于旋转仪上，在37摄氏度、5%二氧化碳及湿度条件下，以0.03 ×g振荡孵育2.5小时。孵育结束后，若所有组织碎片均可通过P1000移液器吸头，则通过离心沉淀组织悬液，并小心弃去上清液。将沉淀重悬于3毫升PBS中，随后依次通过100、170、140微米的细胞滤筛过滤至新的锥形管中，每次过滤后用2毫升新鲜DPBS冲洗滤筛。通过离心收集细胞，弃去上清液，将细胞重悬于残留的DPBS中。将细胞与等体积的氯化铵钾裂解缓冲液混合，在冰上裂解红细胞，时间不超过5分钟。孵育结束后，加入10毫升DPBS终止裂解，并通过离心收集细胞。确认存在白色沉淀后，将沉淀重悬于1至5毫升乳腺球培养基中进行计数。随后，将细胞以每毫升乳腺球培养基含2 × 10⁵个活细胞的浓度接种至未经组织培养处理的超低吸附6孔板中，在37°C及5%二氧化碳条件下孵育7至10天。在7至10天的培养结束后，从细胞培养板的每个孔中收集原代乳腺球，并通过离心沉淀乳腺球。弃去上清液后，使用带滤芯吸头的P200移液器将乳腺球反复吹打约100次。生成单细胞悬液对于准确量化乳腺球细胞的新生活性至关重要。肉眼观察细胞分离程度，必要时使用细胞筛网。用 1 至 5 毫升新鲜的乳腺球培养基重悬解离后的乳腺球，计数后以每毫升 2 × 10⁴ 个活细胞的密度接种于聚羟基乙基甲基丙烯酸酯（polyhema）包被的超低吸附六孔板中，进行 5 至 7 天的培养。随后，在培养 5 至 7 天后，计数每孔中的球体数量。每次传代结束时，使用安装在体视显微镜上的数码相机扫描所有孔的整个表面，以获取类球体的图像。将图像以 tif 文件格式保存后，将体视显微镜图像作为图像序列导入 ImageJ，并设置图像尺度和图像类型为 8 位。复制图像堆栈，然后从“Process”选项卡中选择“Subtract Background”。选中“亮背景”和“滑动抛物面”选项，然后点击“确定”以处理图像堆栈中的所有图像。在“图像”选项卡中选择“调整”和“阈值”，然后点击“应用”。此时将弹出一个窗口。选择“默认”作为方法，“浅色”作为背景。勾选“为每幅图像计算阈值”选项框，然后点击“确定”。要处理堆栈中的所有图像，请选择“分水岭”并点击“是”，然后选择“打开”并点击“是”，再选择“腐蚀”并点击“是”。接下来，从“分析”菜单中选择“分析颗粒”，将最小尺寸阈值设置为 10,000 平方微米，圆形度设置为 0.50 至 1.00。在“显示”下拉菜单中选择“椭圆”选项，并勾选“汇总”、“排除边缘”和“原位显示”。然后点击“确定”以处理图像堆栈中的所有图像。为计算每一代的累积生长曲线，需记录每孔接种的细胞数量以及每孔中计数的球形细胞团数量，并计算每一代结束时的球体大小。通过将每一代接种的细胞数除以上一代结束时计算得到的球体大小，推算出接种的球体数量。计算每孔每一代的累积细胞数和累积球体数，并将数据点绘制在半对数坐标图上。然后对数据点拟合指数趋势线，并计算决定系数以评估拟合优度。接着将趋势线方程表示为自然指数函数，以推断培养物的生长速率。在本实验中，测定了三次独立实验中连续五次传代的球体数量和细胞数量。此处显示了每次传代的累积细胞数和细胞球数量。如图所示，Myc 激活可导致细胞球和细胞生长速率增加。可根据需要选择具有生物学意义的时间点，用于收集细胞，或进行基因表达分析及其他功能性检测，以评估细胞分化、迁移和侵袭能力。这是一种简单且经济高效的方法，具有多种应用。例如，可用于直接发现研究，以检测对癌症干细胞增殖和自我更新的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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