鼠乳层文化中自我更新的量化

因此，乳腺层培养提供了一个易于获取的运动系统，用于研究和剖析癌症乳腺癌干细胞行为中正常行为的重要方面，包括它们自我更新和分化的能力。我们的定量方法旨在以客观的方式评估乳腺层培养物的生长速率，从而能够直接比较不同的细胞类型和条件。对于第一次试验，我建议严格控制孵育时间，避免过度消化，并确保每次电镀前有准确的细胞计数。

与夏罗莱丝·布尔一起演示手术的将是来自我实验室的技术人员埃里科·德利亚。在收获了4个腹部和下胸乳腺从5至30，8至10周大的雌性小鼠后，将每100毫米培养皿中20个腺体放在最小体积的DPBS中。将组织分解成小块，在碎片中加入10毫升的消化介质。

使用 25 毫升血清移液器将组织件转移到 50 毫升锥形管中，并使用石蜡膜密封管。然后在0.03 X G的旋转器上孵育碎片，在37度和5%的湿度下孵育2个半小时。在孵化结束时，如果所有片段都可以通过P1000移液器尖端，通过离心沉淀组织浆料，并小心地抽取上经液。

将颗粒重新悬浮在 3 毫升 PBS 中，并通过一个 100、170、140 微米细胞滤片按顺序将管内装物过滤到新的锥形管中，每次过滤器后用 2 毫升新鲜 DPBS 清洗每个滤片。通过离心使细胞分裂，并化脱液，将其余 DPBS 中的细胞重新挂起。将细胞与同等体积的氯化铵钾解液缓冲液混合，将红血球在冰上解化长达5分钟。

在孵育结束时，用10毫升的DPBS进行解解，通过离心收集细胞。确认是否存在白色颗粒，并在 1 至 5 毫升乳腺层介质中重新悬浮颗粒进行计数。然后将细胞板盘到非组织培养处理的超低粘附六井板上，每毫升乳腺层中浓度为2×10至第五活细胞，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育7至10天。

在7至10天培养结束时，从细胞培养板的每个井中收集初级乳腺层，通过分型沉淀乳腺圈。去掉上清液后，使用带过滤尖端的 P200 移液器，将乳腺圈移液约 100 次。单细胞患者的生成对于准确量化乳腺层细胞实现新的可读性至关重要。

目视检查隔离范围，必要时使用细胞过滤器。重新挂起与未分离的乳腺层，用1至5毫升的新鲜乳腺层培养基进行计数，将每毫升2 X 10的活细胞板放在聚赫马涂层的超低粘附六井板上，进行5至7天的培养。然后，在 5 到 7 天后，计算每井的球体数。

在每个通道的末尾，使用安装在立体镜上的数码相机扫描所有孔的整个表面，以成像球体。保存图像后，作为 tif 文件，将立体镜图像作为图像序列导入 ImageJ，并设置比例和图像类型为 8 位。复制图像堆栈，并从"过程"选项卡中选择"减去背景"。

检查"光背景"和"滑动抛物线"选项，然后单击"确定"以处理堆栈的所有图像。从"图像"选项卡中选择"调整"和"阈值"，然后单击"应用"。将出现一个弹出窗口。

选择"默认为方法"，将浅色作为背景。选中每个图像框的"计算"阈值，然后单击"确定"。要处理堆栈中的所有图像，请选择"分水岭"并单击"是"。选择"打开"并单击"是"，然后选择"Erode"，然后单击"是"。

接下来，从"分析"菜单中选择"分析粒子"，将最小尺寸阈值设置为 10，000 微米平方，将循环度设置为 0.50 和 1.00 之间。从"显示"下拉菜单中选择"椭圆"选项，并选中"汇总"、边缘排除和原位显示。然后单击"确定"以处理堆栈的所有图像。

要计算每个通道的累积生长曲线，寄存镀细胞的数量和每井计数的球体中的细胞数，并计算每个通道末尾的球体大小。推断镀球的数量，方法是将每个通道的镀盘细胞数除以上一段末尾计算的球体大小。计算每个通道每个井的累积细胞数和每个通道的每个井的累积球体数，并在半对数尺度上绘制数据点。

然后向数据点建立指数趋势线，并计算测量拟合优度的决定系数。然后将趋势线的方程描绘成一个自然的指数函数，以推断文化的生长速度。在这个实验中，确定了连续五个通道的球体和细胞数，用于三个独立的实验。

此处显示了每个通道的累积单元格和球体数。正如观察到的 Myc 活化， 导致球体和细胞生长率增加.生物和相关的时间点可以选择用于细胞收集或执行基因表达分析或其他功能资产，以评估细胞分化、迁移和入侵。

这是一种简单且经济高效的方法，具有多种应用。例如，它可用于直接发现，以测量对癌症干细胞增殖和自我更新的影响。