细菌肽展示技术用于筛选新型生物素化酶

本方案提供了一种高效的细菌展示系统，用于分离新型BirA变体，从而实现对天然蛋白质的特异性生物素化。该技术的主要优势在于利用高亲和力链霉亲和素进行筛选来选择BirA变体，确保去除无活性的克隆，从而建立一种高效的选择流程。

首先，在质粒编辑器中，设计正向引物时应包含肽编码序列的反向互补序列的最后30个核苷酸，并在其5'端添加质粒结合核苷酸序列。设计反向引物时应包含肽编码序列的反向互补序列的前30个核苷酸，并在其5'端添加质粒结合核苷酸序列。然后，配制一个20 µL的PCR反应体系，将各试剂加入薄壁PCR管中。

将离心管转移至热循环仪中，按照文稿所述进行PCR反应。接着，取5 µL PCR反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，以确认扩增出6 kb的PCR产物，并依照文稿继续后续操作。现在，为了使用BirA六组氨酸正向与反向引物合成突变型大引物，在PCR管中加入1 ng含有已制备靶向肽序列的pBAD-BirA-eCPX质粒作为模板。

根据制造商说明书，设置35个PCR循环，退火温度为60摄氏度。然后，取5微升扩增反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，以确认984碱基对的PCR产物扩增成功。使用 commercial PCR 纯化试剂盒从剩余的45微升扩增反应产物中纯化PCR产物，并用分光光度计定量DNA产量。

在薄壁PCR管中，向已制备的突变型大引物中加入试剂，以制备样品反应液。将反应混合物转移至热循环仪中，按照文稿所述程序运行PCR。将扩增反应产物置于4摄氏度或冰上保存。

接下来，向扩增反应中直接加入1 µL DpnI限制性内切酶，并轻轻混匀。短暂离心收集反应混合物，于37°C孵育2小时。孵育2小时后，取2 µL DpnI反应产物，转化至装有T7 Express lysY/Iq感受态E.coli细胞的离心管中。

首先，将1 mL BirA文库接种至100 mL含有1%葡萄糖和100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C、200 rpm振荡条件下过夜培养。然后，取100 µL过夜培养物接种至5 mL含有1%葡萄糖和100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，培养2小时30分钟，或直至菌液OD600达到约0.5。

接下来，加入终浓度为0.2%（质量/体积）的L-阿拉伯糖、100微摩尔的IPTG和100微摩尔的生物素，以诱导eCPX和BirA的表达。在37摄氏度下，以200转/分钟振荡培养1小时。在5,000 × g下离心10分钟，弃去上清液。

将细胞重悬于1毫升预冷的PBS中，于5,000 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于400微升预冷的PBS中，并将细胞置于冰上保存。随后，取10微升重悬的细胞转移至标记为“input”的1.5毫升离心管中。

置于冰上保存。接下来，将20 µL链霉亲和素磁珠加入含有1 mL预冷PBS的离心管中，洗涤磁珠，然后将离心管放入台式磁性分离器中静置2分钟，小心移除上清液。用20 µL预冷PBS重悬链霉亲和素磁珠，随后将磁珠悬液转移至先前制备的390 µL重悬细胞中。

轻轻吹打混匀。然后在 4°C 下孵育 30 分钟。将含有铁磁性微球的柱子置于磁性粒子分离器中，用 5 mL 冰冷的 PBS 洗涤。

将细胞和链霉亲和素磁珠从离心管转移至置于分离器上的分选柱中。当分选柱储液腔排空后，每次加入500微升冰浴预冷的磷酸盐缓冲液，共洗涤五毫升。随后，从分离器上取下分选柱，放入一个1.5毫升离心管中。

用移液器将1毫升冰冻的PBS加入柱中，使用推杆洗脱磁标记的细胞。然后将1.5毫升离心管放入台式分离器中，用1毫升冰冻的PBS洗涤磁标记的细胞。在1毫升冰冻的PBS中轻柔地重悬磁标记的细胞。

将10微升重悬液转移至标记为“output”的1.5毫升离心管中。用磁性标记的细胞接种含有1%葡萄糖和100微克/毫升氨苄青霉素的100毫升LB培养基，并在37摄氏度、200 rpm振荡条件下过夜培养。次日，取10毫升过夜LB培养物与甘油混合，使甘油终浓度为15%，然后于-80摄氏度保存，以制备冷冻菌种。

使用100微升过夜培养物进行下一轮筛选。现在，向输入样本和输出样本中分别加入990微升预冷的PBS，并将试管分别标记为输入10⁻²和输出10⁻²。用预冷的PBS对这两个样本进行10倍系列稀释，直至输入样本达到最终稀释度10⁻¹⁰，输出样本达到最终稀释度10⁻⁴。

取输入稀释度为10的负6次方、10的负8次方、10的负10次方，以及输出稀释度为10的负2次方、10的负3次方和10的负4次方的样品各100 µL，分别涂布于LB-氨苄青霉素平板上，于37°C过夜培养。次日早晨，计数菌落分布清晰可辨的平板上的菌落数量。将菌落数乘以稀释倍数，得到每100 µL样品中的细菌浓度数值。

在本实验方案中，首先构建了随机突变的BirA变体文库，随后诱导表达BirA和eCPX-AP。将细菌与亲和试剂孵育，弃去未结合的细菌，并对筛选出的细菌进行扩增。对表达pBAD-BirA-eCPX-AP的细菌进行蛋白质印迹检测，在未诱导和诱导培养物中均观察到一条与eCPX分子量相符的22千道尔顿的链霉亲和素反应条带。

然而，在 BirA 六组氨酸中未观察到此类现象。表达 eCPX-AP 的细菌由于表面生物素化程度高，在加入链霉亲和素磁珠后发生聚集，并在管底形成沉淀，而表达 eCPX（赖氨酸突变为丙氨酸）的细菌则未出现该现象。对链霉亲和素下拉沉淀物的分析显示，来自 eCPX-AP 培养物的样品中存在一条清晰的 22 千道尔顿条带，可与链霉亲和素及抗六组氨酸抗体反应，但在赖氨酸突变为丙氨酸的 eCPX-AP 培养物样品中未检测到该条带。

同样，在表达eCPX-AP的培养物中，结合到链霉亲和素磁珠上的细菌数量显著高于eCPX-AP赖氨酸突变为丙氨酸的突变体培养物。最关键的步骤是对结合链霉亲和素的细菌进行严格洗涤。严格洗涤可确保仅筛选出表面展示有生物素的细菌。

一旦观察到细菌的明显富集，即可对分离的克隆进行进一步突变，从而开发出具有高活性的BirA变体，实现对天然蛋白质的特异性生物素标记。