Name: 使用共聚焦显微镜监测跨王国生物膜中的细胞外pH值 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 学习使用共聚焦显微镜和pH比率测定法监测跨王国生物膜中的细胞外pH值。该方法可实时追踪Candida albicans与Streptococcus mutans混合生物膜的酸碱梯度变化。

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感谢 Anette Aakjær Thomsen 和 Javier E. Garcia 提供出色的技术支持。作者感谢 Rubens Spin-Neto 就图像分析问题进行的富有成效的讨论。

唾液采集方案已通过奥胡斯县伦理委员会（M-20100032）的审查和批准。
1. 跨界生物膜的培养
<ol>
	<li>培养 S. mutans DSM 20523 和 C. albicans NCPF 3179 在37 °C、有氧条件下于血琼脂平板上培养。</li>
	<li>将每种生物的单个菌落转移至装有5 mL脑心浸液（BHI）的试管中，在37 °C有氧条件下培养18 h。</li>
	<li>将过夜培养物在 1,200 x g 5 分钟。弃去上清液，用生理盐水重悬细胞，并调整 OD550 nm 至 0.5 C. albicans (~107 细胞/毫升）和 S. mutans (~108 细胞/毫升）。稀释 S. mutans 1:10 悬液，用无菌生理盐水配制（约107 细胞/毫升</li>
	<li>移取50 µL根据de Jong等人的方法制备的无菌唾液溶液19，加入至光学底96孔板的孔中用于显微镜观察。在37 °C孵育30分钟。用100 µL无菌生理盐水洗涤孔板3次。弃去孔内液体。</li>
	<li>加入 100 µL 的 C. albicans 将悬液加入每孔中，37 °C 孵育 90 分钟，用无菌生理盐水洗涤 3 次。 
	注意：洗涤过程中切勿将孔内液体完全吸干，保留20 µL的残留液体，以避免产生过大的剪切力。</li>
	<li>每孔加入 100 µL 热灭活的胎牛血清（56 °C 灭活 30 分钟）。37 °C 孵育 2 小时。用无菌生理盐水洗板 3 次。弃去液体，每孔保留 20 µL 储液。</li>
	<li>加入 100 µL 的 S. mutans 将悬液（步骤1.3中制备）加入各孔中，每孔加入含5%蔗糖的150 µL BHI培养基。37 °C孵育24小时或更长时间。培养较老的生物膜时，每日更换新鲜BHI培养基。在跨域生物膜生长阶段结束时，用无菌生理盐水洗涤5次。</li>
</ol>
2. 比值法pH成像
注意：在生物膜生长完成后，必须立即进行比率法 pH 成像。
<ol>
	<li>进行比率法pH成像时，使用配备63倍油镜或水镜、543 nm激光线和光谱成像系统（例如META探测器）的倒置共聚焦激光扫描显微镜，以实现重叠荧光信号的成像。使用培养箱将显微镜载物台预热至35 °C。</li>
	<li>设置探测器，确保检测576−608 nm范围内的绿色荧光，同时检测629−661 nm范围内的红色荧光。选择合适的激光功率和增益，避免图像过曝或欠曝。 
	注意：图像曝光情况最好通过伪彩调色板图像进行观察。</li>
	<li>将针孔大小设置为1个艾里单位（Airy Unit），或光学切片厚度约为0.8 µm。将图像尺寸设为512 × 512像素，扫描速度设为2。选择2次线平均，采用均值模式。 
	注意：在一系列实验开始前，应检查所选显微镜设置是否能清晰区分细菌细胞、真菌细胞壁、生物膜基质和真菌细胞质。</li>
	<li>准备100 µL含0.4%（w/v）葡萄糖的无菌生理盐水，并将pH滴定至7。配制C-SNARF-4储备液（1 mM，溶于二甲基亚砜）。将染料加入至终浓度为30 µM。 
	警告：操作比率法染料时需佩戴腈手套。</li>
	<li>取出一个含有跨物种生物膜的孔中液体，保留20 µL的残留体积。加入含葡萄糖和比率法染料的无菌生理盐水。将96孔板置于显微镜载物台上，开始对生物膜进行成像。</li>
	<li>在生物膜的不同位置采集单张图像或Z轴层扫图像。在显微镜软件中标记X-Y位置，以便随时间追踪特定视野内的pH变化。定期在关闭激光的情况下采集图像，以校正探测器偏移。</li>
	<li>对在不同孔中培养的每个生物膜重复步骤2.4–2.6。</li>
</ol>
3. 比值染料的校准
注意：染料的校准及校准曲线的拟合可与比率法 pH 成像在不同日期进行。
<ol>
	<li>配制一系列在35 °C下用50 mM 2-吗啉乙磺酸（MES）缓冲液滴定至pH 4.0–7.8、以0.2 pH单位为间隔的缓冲溶液。将每种缓冲液各150 µL加入光学底96孔板的孔中，用于显微镜观察。</li>
	<li>向96孔板中含缓冲液的孔中加入染料，使其终浓度为30 µM。平衡5分钟。</li>
	<li>将显微镜载物台预热至35 °C。选择与比率法pH成像相同的显微镜设置。将96孔板置于显微镜载物台上，聚焦于孔的底部。在距孔底5 µm处，对所有缓冲液采集两幅图像（绿色和红色通道）。定期在激光关闭状态下采集图像，以校正探测器偏移。</li>
	<li>重复三次校准实验。</li>
	<li>将所有图像导出为TIF文件，并导入专用图像分析软件（例如ImageJ20）。通过点击Process | Image Calculator | Subtract，将缓冲液图像减去对应激光关闭时采集的图像。 
	注意：如有必要，可通过使用Image | Crop进行矩形选区裁剪图像，以消除图像边缘的人工伪影。</li>
	<li>将绿色通道图像除以红色通道图像，并通过点击Analyze | Histogram计算所得图像中的平均荧光强度。</li>
	<li>根据三次重复实验，绘制平均绿/红荧光比值随pH变化的曲线。使用专用软件对校准数据拟合函数（例如MyCurveFit）。</li>
</ol>
4. 数字图像分析
注意：在染料校准和比率法 pH 成像完成后，可在任意时间点进行数字图像分析。
<ol>
	<li>将绿色和红色通道的生物膜图像分别存储在不同的文件夹中，并将两组文件重命名为连续的数字编号（例如，GREEN_0001）。将图像导入专用的图像分析软件（如 ImageJ）。点击 分析 | 直方图，确定激光关闭时拍摄图像的平均荧光强度，并通过点击 处理 | 数学 | 减去，从生物膜图像中减去该数值。</li>
	<li>将两组图像导入专用的图像分析软件（例如 daime21）。对红色通道图像执行基于阈值的分割（分割 | 自动分割 | 自定义阈值）。将“低”阈值设置在真菌细胞质荧光强度之上，将“高”阈值设置在真菌细胞壁和细菌荧光强度之下。 
	注意：当选择合适的阈值后，仅细胞外区域会被识别为对象。</li>
	<li>将分割后图像序列的对象层转移至绿色通道图像序列。操作方式为点击 分割 | 转移对象层。 
	注意：如果在单个颜色通道中，细胞外区域与真菌细胞质之间的对比度过弱，可在分割前通过点击 编辑 | 图像计算器 | 加法，将绿色通道图像序列添加到红色通道序列中。按步骤 4.2 所述进行分割，并将分割后图像序列的对象层同时转移至绿色通道和红色通道图像序列。</li>
	<li>使用对象编辑器删除红色和绿色通道图像序列中的非对象像素（可视化 | 对象编辑器 | 所有图像 | 删除非对象像素）。此时，生物膜图像中的细菌和真菌细胞均已清除。将处理后的图像序列导出为 TIF 文件。</li>
	<li>将两组图像序列导入 ImageJ。ImageJ 会为所有非对象像素分配强度值 0。通过将红色图像序列（R1）除以其自身（处理 | 图像计算器 | 图像 1：R1；操作： 除法；图像 2：R1），然后将结果图像序列（R2）与原始红色图像序列相乘（处理 | 图像计算器 | 图像 1：R1；操作： 乘法；图像 2：R2），来移除这些像素。生成第三个图像序列（R3），其与 R1 相同，但 R1 中所有强度为 0 的像素在 R3 中被赋值为 NaN。对绿色通道图像序列以相同方式处理。</li>
	<li>对红色和绿色通道图像序列应用“均值”滤波器（处理 | 滤波器 | 均值 | 半径 | 1 像素），以补偿探测器噪声。将绿色通道图像序列除以红色通道图像序列（处理 | 图像计算器 | 图像 1：G3；操作： 除法；图像 2：R3）。所得图像序列（G3/R3）显示所有对象像素的绿/红比值。</li>
	<li>计算每幅图像的平均比值（分析 | 直方图）。应用伪彩着色以更清晰地可视化图像中的比值（图像 | 查找表）。利用步骤 3.6 中拟合的函数，将绿/红比值转换为 pH 值。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

先前已有多种关于涉及C. albicans与Streptococcus spp.的跨域生物膜培养方案的描述9,22,23,24,25。然而，本实验设计侧重于简单的培养条件、与常规工作日相适应的时间安排、均衡的物种组成，以及形成体积较大的生物膜基质。此外，使用唾液溶液对96孔板进行包被，以在一定程度上模拟口腔中的黏附条件。
使用C-SNARF-4进行pH比率测定是一种经济、快速测定生物膜pH值的方法，其优缺点已在其他文献中详细讨论12,26。简而言之，该技术可用于评估生物膜内部不同位置的pH值...

由真菌和细菌物种共同组成的跨界生物膜参与了口腔中的多种病理状况。Candida spp. 已频繁从根管感染1以及牙周病变中分离得到2,3。在黏膜感染中，属于轻链球菌组（mitis group）的链球菌物种已被证明可在体外和小鼠模型中增强真菌生物膜的形成、组织侵袭及播散能力4,5,6,7。尤为引人注意的是，已有研究证实儿童口腔中携带 Candida spp. 与龋齿的患病率相关8。啮齿类动物模型研究表明，Streptococcus mutans 与 Candida albicans 之间存在共生关系，可增加胞外多糖的产生，导致形成更厚且更具致龋性的生物膜9,10。
在上述所有情况下，尤其是婴幼儿龋齿中，生物膜的pH值对疾病进展具有重要意义，而生物膜基质在形成产酸微环境中的关键作用11，促使人们需要发展能够研究跨域生物膜内部pH变化的方法。目前已开发出基于共聚焦显微镜的简单且准确的方法，用于监测细菌12和真菌13生物膜内部的pH值。利用比率型染料C-SNARF-4结合基于阈值的图像后期处理技术，可实时测定生物膜三维空间中胞外pH值14。与其他已发表的基于显微镜的生物膜pH监测技术相比，使用C-SNARF-4进行pH比率测定更为简便且成本低廉，因其无需合成包含参比染料的颗粒或化合物15，也无需使用双光子激发16。仅使用一种染料可避免探针区室化、荧光串色以及选择性漂白等问题16,17,18，同时仍能可靠地区分胞内与胞外pH值。最后，染料孵育在生物膜生长完成后进行，因此可用于研究实验室培养和原位生长的生物膜。
本研究的目的是扩展pH比率测定法的应用，并提供一种用于研究跨物种生物膜中pH变化的方法。作为概念验证，该方法被用于监测由S. mutans和C. albicans组成的双物种生物膜在暴露于葡萄糖时的pH变化。

<table><tbody><tr><td>血琼脂平板</td><td>Statens Serum Institut</td><td>677</td><td></td></tr><tr><td>脑心浸出液培养基</td><td>Oxoid</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>脑心浸出液培养基 + 5% 蔗糖</td><td>BDH 实验室用品公司</td><td>10274</td><td></td></tr><tr><td>白色念珠菌</td><td>国家病原真菌保藏中心</td><td>NCPF 3179</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>daime：微生物生态学中的数字图像分析</td><td>Universit&amp;auml;t Wien</td><td>N/A</td><td>免费软件；版本 2.1；&lt;a href=&quot;https://dome.csb.univie.ac.at/daime&quot; target=&quot;_blank">https://dome.csb.univie.ac.at/daime&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>GS-6R 冷冻离心机</td><td>Beckman</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>N/A</td><td>免费软件；版本 1.46r；&lt;a href=&quot;https://imagej.nih.gov/ij&quot; target=&quot;_blank">https://imagej.nih.gov/ij&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Java</td><td>Oracle</td><td>N/A</td><td>运行 ImageJ 所需的免费软件；版本 8.0；&lt;a href=&quot;https://java.com/en/download&quot; target=&quot;_blank">https://java.com/en/download&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&amp;micro;-96 孔黑色微孔板</td><td>Ibidi</td><td>89626</td><td></td></tr><tr><td>MyCurveFit</td><td>MyAssays Ltd.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES) 缓冲液</td><td>Bioworld</td><td>700728</td><td></td></tr><tr><td>PHM210 pH 计</td><td>Radiometer Analytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x 油浸物镜</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>NA=1.4</td></tr><tr><td>SNARF&amp;reg;-4F 5-(和-6)-羧酸</td><td>Life Technologies</td><td>S23920</td><td></td></tr><tr><td>无菌生理盐水</td><td>VWR</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>变形链球菌</td><td>德国微生物与细胞培养保藏中心</td><td>DSM 20523</td><td></td></tr><tr><td>Vis-V-3000PC 可见光分光光度计</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XL 培养箱</td><td>PeCON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 META</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

利用共聚焦显微镜监测跨物种生物膜中的胞外ph

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

由真菌和细菌细胞共同组成的跨域生物膜参与多种口腔疾病的发生，例如根管感染、牙周炎、黏膜感染，尤其是儿童早期龋齿。在所有这些情况下，生物膜基质中的 pH 值影响微生物与宿主之间的相互作用，从而影响疾病进展。本方案描述了一种基于共聚焦显微镜的方法，用于监测包含白色念珠菌（Candida albicans）和变异链球菌（Streptococcus mutans）的跨域生物膜内部的 pH 动态变化。该方法利用比率型探针 C-SNARF-4 的 pH 依赖性双发射光谱及其染色特性，检测生物膜胞外区域 pH 值的下降。使用该探针进行 pH 比率测定需要仔细选择成像参数、对染料进行充分校准，并对图像数据进行基于阈值的精细后处理。若操作得当，该技术可快速评估生物膜不同区域的胞外 pH 值，从而实现对水平和垂直方向 pH 梯度随时间变化的监测。尽管共聚焦显微镜的应用将 Z 轴剖面分析限制在厚度不超过 75 µm 的较薄生物膜范围内，但 pH 比率测定法非常适用于无创研究跨域生物膜中这一重要毒力因子。

24 h和48 h后，孔板中形成了稳定的跨域生物膜。C. albicans表现出不同程度的丝状生长，S. mutans则形成高达35 µm的致密菌簇。S. mutans的单个细胞和链状结构聚集在真菌菌丝周围，较大的细胞间间隙表明存在大量胞外基质（图S1）。
比率荧光染料的校准产生一条不对称的S形曲线13,14。在不同显微视野中，生物膜的胞外pH在葡萄糖暴露后的最初5分钟内迅速下降，下降速率各不相同。此后，酸化过程减缓，通常在15分钟后达到5.5–5.8的pH值（图1）。重复的生物膜实验表现出相似的趋势，平均pH值仅有轻微差异（图S2）。
pH 计算的准确性在很大程度上取决于采集过程中对图像参数的仔细选择。对于所研究的生物膜，0.8 ...

本方案描述了由白色念珠菌（Candida albicans）和变异链球菌（Streptococcus mutans）组成的跨域生物膜的培养方法，并介绍了一种基于共聚焦显微镜的技术，用于监测这些生物膜内部的胞外pH值。

利用共聚焦显微镜监测跨物种生物膜中的胞外pH

由真菌和细菌细胞组成的跨界生物膜参与多种口腔疾病，例如牙髓感染，……

本方案介绍了一种易于操作的方法，用于培养由变形链球菌（Streptococcus mutans）和白色念珠菌（Candida albicans）组成的跨域生物膜。随后基于共聚焦显微镜的pH比率测定技术，可准确监测这些生物膜胞外基质内部的pH变化情况。选择合适的图像采集参数对于获得具有足够对比度的图像数据以进行后续分析至关重要。pH 比值测定法是一种快速、精确且经济的方法，可用于实时研究跨物种生物膜中的横向和纵向 pH 梯度。pH 比值测定法也可用于纯真菌和细菌生物膜中。该方法有助于加深我们对生物膜中微生物代谢的理解。生物膜培养步骤将由本实验室技术员 Anette Aakjaer Thomsen 演示。在37摄氏度、有氧条件下，于血琼脂平板上培养 S.mutans 和 C.albicans。然后将每种生物的单个菌落转移至装有5毫升脑心浸液的试管中，继续培养18小时。次日，以1,200 × g离心培养物5分钟，弃去上清液。用生理盐水重悬菌体，并将白色念珠菌（C.albicans）和变形链球菌（S.mutans）的OD550调整至0.5。然后将变形链球菌悬液按1:10稀释，以获得等效浓度。用移液器将50微升无菌唾液溶液加入光学底96孔板的各孔中，用于显微镜观察。将该板在37摄氏度下孵育30分钟，然后用100微升无菌生理盐水洗涤3次，并吸净各孔中的液体。向每个孔中加入 100 微升白色念珠菌悬液，在 37 摄氏度下孵育 90 分钟，然后用生理盐水洗涤孔三次。接着，向每个孔中加入 100 微升热灭活的胎牛血清。孵育 2 小时后，再用生理盐水洗涤三次。吸出各孔中的液体，但保留20微升的残留液以避免过大的剪切力。向每孔中加入100微升的变形链球菌（S. mutans）悬液和150微升含5%蔗糖的BHI培养基。然后将培养板在37°C下孵育24小时或更长时间。在培养较老的生物膜时，需每日更换培养基。在跨域生长阶段结束时，用无菌生理盐水洗涤培养板五次。进行比率法pH成像时，使用配备63倍油镜或水镜、543纳米激光线以及光谱成像系统的倒置共聚焦激光扫描显微镜。使用培养箱将显微镜载物台预热至 35 摄氏度。设置检测器以同时检测 576 至 608 纳米的绿色荧光和 629 至 661 纳米的红色荧光。然后选择合适的激光功率和增益，以避免曝光过度或不足。将针孔大小设置为1个空气单位，或光学切片厚度约为0.8微米。然后将图像尺寸设置为512×512像素，扫描速度设置为2，选择“均值”模式，线平均数设为2。制备100微升含0.4%葡萄糖且pH值调至7的无菌生理盐水。然后配制C-SNARF-4储备液，并将染料加入至终浓度为30微摩尔。将跨物种生物膜所在孔中的液体吸出，留下20微升的储液空间，随后加入含葡萄糖的生理盐水和比率型染料。将培养板置于显微镜载物台上并开始成像。在35摄氏度条件下，配制一系列pH值从4.0至7.8、以0.2 pH单位递增的50毫摩尔MES缓冲液。将每种缓冲液各150微升加入光学底96孔板的孔中。将染料以30微摩尔的浓度加入含有缓冲液的孔中，使其平衡5分钟。将显微镜载物台预热至35摄氏度，并采用此前所述的比率法pH成像相同的设置。将96孔板置于显微镜载物台上，并聚焦于孔的底部。对所有缓冲溶液采集绿色和红色通道的图像。以固定时间间隔关闭激光器拍摄图像，以校正检测器的偏移。校准实验需进行三次重复，并将所有图像导出为 TIFF 文件。将绿色和红色图像分别存储在不同的文件夹中，并将两组文件重命名为连续的编号。将图像导入专用的图像分析软件（如 ImageJ）。在激光关闭状态下拍摄的图像中，点击“分析”和“直方图”以确定平均荧光强度。通过点击“process”（处理）、“math”（数学运算）和“subtract”（相减），从生物膜图像中减去该值。然后将这两个图像序列导入daime，并通过点击“segment”（分割）、“automatic segmentation”（自动分割）和“custom threshold”（自定义阈值）对红色通道图像进行基于阈值的分割。将低阈值设置为高于真菌细胞质的荧光强度，高阈值设置为低于真菌细胞壁和细菌的荧光强度。然后，通过点击“segment”和“transfer object layer”，将分割图像序列中的对象层转移至绿色通道图像序列。删除红色和绿色通道序列中的非对象像素。现在，生物膜图像已去除细菌和真菌细胞，可导出为TIFF文件。将图像序列重新导入 ImageJ，然后将红色图像序列除以自身。接着将结果乘以原始图像序列。所得图像序列与原始图像序列相同，只是所有强度为零的像素均被移除。对绿色图像序列重复上述过程。接着，对两个图像序列均使用均值滤波器以补偿检测器噪声。将绿色图像序列除以红色图像序列，从而得到所有目标像素的绿红比值。在培养板中培养24小时和48小时后，形成了稳定的跨生物界生物膜。变形链球菌（S.mutans）的单个细胞和链状结构聚集在真菌菌丝周围，较大的胞外空间表明存在大量胞外基质。利用查找表对胞外空间的pH值进行了可视化显示。生物膜中的胞外pH值在接触葡萄糖后的最初五分钟内迅速下降。此后，酸化速度减缓，通常在15分钟后达到5.5至5.8的范围。由于局部pH值的变化，生物膜内的荧光强度随时间发生变化。在图像分割过程中，选择高阈值和低阈值以充分去除被细菌和真菌细胞覆盖的所有区域。低阈值去除了蓝色区域，高阈值去除了绿色区域。仔细选择图像采集参数对于获得细菌细胞、真菌细胞与生物膜基质之间的良好对比度至关重要。若在流动池中培养跨域生物膜，可在模拟口腔环境的流动条件下监测pH变化。已采用pH比率测定法来鉴定牙科生物膜中pH特别低的局部区域，即所谓的产酸热点区域。

monitoring-extracellular-ph-cross-kingdom-biofilms-using-confocal

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用共聚焦显微镜监测跨王国生物膜中的细胞外pH值

本文描述了在8孔腔室载玻片内培养和观察细菌生物膜的实验步骤...

体外 生物膜在8孔腔室载玻片中的形成

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