利用共聚焦显微镜监测跨物种生物膜中的胞外pH

本方案介绍了一种易于操作的方法，用于培养由变形链球菌（Streptococcus mutans）和白色念珠菌（Candida albicans）组成的跨域生物膜。随后基于共聚焦显微镜的pH比率测定技术，可准确监测这些生物膜胞外基质内部的pH变化情况。

选择合适的图像采集参数对于获得具有足够对比度的图像数据以进行后续分析至关重要。pH 比值测定法是一种快速、精确且经济的方法，可用于实时研究跨物种生物膜中的横向和纵向 pH 梯度。pH 比值测定法也可用于纯真菌和细菌生物膜中。

该方法有助于加深我们对生物膜中微生物代谢的理解。生物膜培养步骤将由本实验室技术员 Anette Aakjaer Thomsen 演示。在37摄氏度、有氧条件下，于血琼脂平板上培养 S.mutans 和 C.albicans。

然后将每种生物的单个菌落转移至装有5毫升脑心浸液的试管中，继续培养18小时。次日，以1,200 × g离心培养物5分钟，弃去上清液。用生理盐水重悬菌体，并将白色念珠菌（C.albicans）和变形链球菌（S.mutans）的OD550调整至0.5。

然后将变形链球菌悬液按1:10稀释，以获得等效浓度。用移液器将50微升无菌唾液溶液加入光学底96孔板的各孔中，用于显微镜观察。将该板在37摄氏度下孵育30分钟，然后用100微升无菌生理盐水洗涤3次，并吸净各孔中的液体。

向每个孔中加入 100 微升白色念珠菌悬液，在 37 摄氏度下孵育 90 分钟，然后用生理盐水洗涤孔三次。接着，向每个孔中加入 100 微升热灭活的胎牛血清。孵育 2 小时后，再用生理盐水洗涤三次。

吸出各孔中的液体，但保留20微升的残留液以避免过大的剪切力。向每孔中加入100微升的变形链球菌（S. mutans）悬液和150微升含5%蔗糖的BHI培养基。然后将培养板在37°C下孵育24小时或更长时间。

在培养较老的生物膜时，需每日更换培养基。在跨域生长阶段结束时，用无菌生理盐水洗涤培养板五次。进行比率法pH成像时，使用配备63倍油镜或水镜、543纳米激光线以及光谱成像系统的倒置共聚焦激光扫描显微镜。

使用培养箱将显微镜载物台预热至 35 摄氏度。设置检测器以同时检测 576 至 608 纳米的绿色荧光和 629 至 661 纳米的红色荧光。然后选择合适的激光功率和增益，以避免曝光过度或不足。

将针孔大小设置为1个空气单位，或光学切片厚度约为0.8微米。然后将图像尺寸设置为512×512像素，扫描速度设置为2，选择“均值”模式，线平均数设为2。

制备100微升含0.4%葡萄糖且pH值调至7的无菌生理盐水。然后配制C-SNARF-4储备液，并将染料加入至终浓度为30微摩尔。将跨物种生物膜所在孔中的液体吸出，留下20微升的储液空间，随后加入含葡萄糖的生理盐水和比率型染料。

将培养板置于显微镜载物台上并开始成像。在35摄氏度条件下，配制一系列pH值从4.0至7.8、以0.2 pH单位递增的50毫摩尔MES缓冲液。将每种缓冲液各150微升加入光学底96孔板的孔中。

将染料以30微摩尔的浓度加入含有缓冲液的孔中，使其平衡5分钟。将显微镜载物台预热至35摄氏度，并采用此前所述的比率法pH成像相同的设置。将96孔板置于显微镜载物台上，并聚焦于孔的底部。

对所有缓冲溶液采集绿色和红色通道的图像。以固定时间间隔关闭激光器拍摄图像，以校正检测器的偏移。校准实验需进行三次重复，并将所有图像导出为 TIFF 文件。

将绿色和红色图像分别存储在不同的文件夹中，并将两组文件重命名为连续的编号。将图像导入专用的图像分析软件（如 ImageJ）。在激光关闭状态下拍摄的图像中，点击“分析”和“直方图”以确定平均荧光强度。

通过点击“process”（处理）、“math”（数学运算）和“subtract”（相减），从生物膜图像中减去该值。然后将这两个图像序列导入daime，并通过点击“segment”（分割）、“automatic segmentation”（自动分割）和“custom threshold”（自定义阈值）对红色通道图像进行基于阈值的分割。将低阈值设置为高于真菌细胞质的荧光强度，高阈值设置为低于真菌细胞壁和细菌的荧光强度。

然后，通过点击“segment”和“transfer object layer”，将分割图像序列中的对象层转移至绿色通道图像序列。删除红色和绿色通道序列中的非对象像素。现在，生物膜图像已去除细菌和真菌细胞，可导出为TIFF文件。

将图像序列重新导入 ImageJ，然后将红色图像序列除以自身。接着将结果乘以原始图像序列。所得图像序列与原始图像序列相同，只是所有强度为零的像素均被移除。

对绿色图像序列重复上述过程。接着，对两个图像序列均使用均值滤波器以补偿检测器噪声。将绿色图像序列除以红色图像序列，从而得到所有目标像素的绿红比值。

在培养板中培养24小时和48小时后，形成了稳定的跨生物界生物膜。变形链球菌（S.mutans）的单个细胞和链状结构聚集在真菌菌丝周围，较大的胞外空间表明存在大量胞外基质。利用查找表对胞外空间的pH值进行了可视化显示。

生物膜中的胞外pH值在接触葡萄糖后的最初五分钟内迅速下降。此后，酸化速度减缓，通常在15分钟后达到5.5至5.8的范围。由于局部pH值的变化，生物膜内的荧光强度随时间发生变化。

在图像分割过程中，选择高阈值和低阈值以充分去除被细菌和真菌细胞覆盖的所有区域。低阈值去除了蓝色区域，高阈值去除了绿色区域。仔细选择图像采集参数对于获得细菌细胞、真菌细胞与生物膜基质之间的良好对比度至关重要。

若在流动池中培养跨域生物膜，可在模拟口腔环境的流动条件下监测pH变化。已采用pH比率测定法来鉴定牙科生物膜中pH特别低的局部区域，即所谓的产酸热点区域。