Name: 通过高分辨率共聚焦显微镜对3D肿瘤球体入侵的影响表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学习使用高分辨率共聚焦显微镜评估迁移抑制因子对胶质瘤细胞在三维肿瘤球体中迁移的影响。该方法为癌症药物测试提供更贴近肿瘤微环境的研究平台。

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我们感谢 Chris Jones 教授提供了 KNS42 细胞系。本研究中使用的配备 AiryScan 的蔡司 LSM880 共聚焦显微镜，属于通过利兹城市区域企业合作伙伴关系（LEP）增长协议资助的哈德斯菲尔德创新与孵化项目（HIIP）的一部分。显微镜图像图3致谢：Carl Zeiss Microscopy GmbH，microscopy@zeiss.com。

1. 细胞球体的生成
第1天
<ol>
	<li>根据所研究的细胞系要求配制标准培养基。</li>
	<li>所有与组织培养相关的操作均须在组织培养超净台内进行，并采用无菌操作技术。</li>
	<li>用胰酶消化并计数癌细胞。每孔加入20 mL细胞悬液。将细胞悬液置于明确标记的无菌通用管中保存。</li>
	<li>向每个孔中加入预定数量的细胞。初始接种细胞数量及最终所需类球体大小取决于所研究细胞系的增殖速率。 
	注意：对于U251和KNS42等已建立的胶质瘤细胞系9,10，每毫升接种5 × 103个细胞，经4天培养后可形成显微镜下可见的类球体（直径200或800 µm）。</li>
	<li>通过轻柔颠倒混匀通用管中的细胞悬液，避免细胞结团。用移液器将200 µL细胞悬液加入96孔板的每孔中。若无需使用全部孔位，建议在每个空孔中加入200 µL的1×PBS，以防止蒸发。</li>
	<li>将细胞置于37 °C培养箱中正常培养。 
	注意：胶质瘤细胞系等细胞在24小时内即可形成类球体。为使三维细胞结构充分形成，建议继续培养类球体72小时。</li>
</ol>
第2天
<ol start="7">
	<li>24 小时后通过明场显微镜检查细胞。根据细胞系的不同，细胞可能已在孔底部形成可检测到的球状体。 
	注意： 建立的胶质瘤癌细胞系通常在 24 小时内即可形成球状体。患者来源的胶质瘤癌细胞系可能需要 1–2 周时间。</li>
</ol>
2. 胶原侵袭实验
第3天
<ol>
	<li>将胶原蛋白、5倍浓度培养基、1 M NaOH 和一个 20 mL 离心管置于冰上。</li>
	<li>小心缓慢地将 10.4 mL 冷胶原蛋白加入预冷的培养管中。避免产生气泡。此量的胶原蛋白足够用于一块 96 孔板。可按比例放大，但建议每次为每块板单独配制一个 20 mL 管的胶原溶液。</li>
	<li>轻柔加入 1.52 mL 冷的无菌 5 倍浓度培养基。避免产生气泡。</li>
	<li>使用前立即轻柔加入 72 μL 冷的无菌 1 M NaOH。保持溶液在冰上。</li>
	<li>用移液器轻轻混匀。避免产生气泡。充分混匀后溶液颜色会发生变化（由红色变为橙红色，pH 7.4）。混合液在使用前应始终保持在冰上。</li>
	<li>关键步骤：从第 1 天准备的 96 孔板中小心移除 190 μL 上清液。操作时务必避免扰动在孔底形成的球状体。移液时应将移液器倾斜靠近孔壁边缘，而非对准孔中心。</li>
	<li>向每个孔中轻柔加入 100 μL 胶原混合液。为防止扰动球状体，应沿孔壁侧边加入混合液。避免产生气泡。将剩余的胶原混合液保留在 20 mL 管中，置于室温下以观察其聚合情况。</li>
	<li>将培养板放入培养箱中孵育至少 10 分钟，使胶原蛋白完成聚合。作为参考，若剩余的胶原混合液已凝固，呈现半固体、海绵状，则表明球状体已准备好可进行抑制剂处理。</li>
	<li>将药物或抑制剂以 2 倍浓度加入培养基中，然后轻柔地将培养基加入各孔（每孔 100 µL）。同样，应沿孔壁侧边加入培养基，以避免扰动球状体。</li>
	<li>在 T = 0 h、24 h、48 h 和 72 h 时间点，通过明场显微镜观察并拍摄每个球状体以评估药物活性，随后将培养板放回培养箱。 
	注意：根据细胞系的侵袭性行为，自 24 小时起可能观察到细胞从原始球状体核心向外迁移的现象。</li>
</ol>
3. 共聚焦显微镜用胶原包埋类球体及迁移细胞的制备
<ol>
	<li>将培养板放入组织培养罩中，轻轻吸去上清液（200 µL）。再次操作时注意不要扰动球状体，避免触碰胶原蛋白，以免影响胶原塞结构。</li>
	<li>用 100 µL 的 1x PBS 替换上清液。重复此洗涤步骤 3 次。</li>
	<li>吸去最后一次洗涤液，加入含 4% 甲醛的 1x PBS 溶液（每孔 100 µL）。 
	注意：甲醛为潜在致癌物，操作时须遵循健康与安全指南，谨慎处理。</li>
	<li>将 96 孔板置于实验台上，用铝箔覆盖，室温下静置 24 小时。</li>
	<li>小心吸去甲醛溶液，替换为 1x PBS。重复此 1x PBS 洗涤步骤 3 次。</li>
	<li>配制含 0.1% Triton X-100 的 1x PBS 溶液。吸去 1x PBS 洗涤液，每孔加入 100 µL Triton X-100 溶液，室温孵育 30 分钟。同时，用 1x PBS 与 0.05% 脱脂奶粉配制封闭液，并充分混匀。</li>
	<li>吸去 Triton X-100 溶液，用 1x PBS 洗涤 3 次。每孔加入 100 µL 封闭液，孵育 15 分钟。</li>
	<li>按照预设浓度，用封闭缓冲液稀释所需的一抗。此处使用抗小鼠 IgG 乙酰化微管蛋白抗体（1:100）。</li>
	<li>将一抗与封闭缓冲液的混合物在 15,682 × g 条件下离心 5 分钟。小心吸去封闭液，将上清液（25−50 µL）加入各孔中，室温避光孵育 1 小时。</li>
	<li>吸去抗体溶液，用 1x PBS 洗涤 3 次（每孔 100 µL）。</li>
	<li>按照推荐或预设浓度，用封闭缓冲液稀释二抗，并加入其他所需的荧光染料。此处使用 1:500 的抗小鼠荧光染料 488 标记抗体、用于肌动蛋白染色的鬼笔环肽-594（1:500）以及 DNA 染料（DAPI）。</li>
	<li>再次将二抗溶液在 13,000 rpm 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>从各孔中吸去封闭液，加入 25−50 µL 二抗/鬼笔环肽/DAPI 混合液，室温避光孵育 1.5 小时。</li>
	<li>吸去二抗-染料溶液，用 1x PBS 洗涤 3 次（每孔 100 µL）。</li>
	<li>使用塑料移液枪头（200 µL）小心通过负压吸取单个胶原塞，并将其转移至高质量普通载玻片中央。</li>
	<li>在胶原塞上滴加一滴合适的封片剂，确保完全覆盖胶原塞，避免产生气泡。</li>
	<li>盖上适用于成像所用显微镜物镜的最佳厚度的盖玻片，室温避光静置过夜。将载玻片储存于室温、避光环境中。</li>
</ol>
4. 荧光显微镜
<ol>
	<li>使用合适的共聚焦显微镜采集荧光图像。</li>
</ol>

<ol><li>Gandalovičová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs%3A+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li>
<li>Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+in+glioblastoma%3A+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062(2016).</li>
<li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333(2017).</li>
<li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics+Technologies%22%5BJournal%5D)">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li>
<li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82(2018).</li>
<li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microwell-mesh%3A+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253(2018).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li>
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<li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li>
<li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors%2C+a+promising+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li>
<li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li>
<li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+preparation+from+hanging+drops%3A+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li>
<li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29(2012).</li>
<li>Härmä, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426(2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍了一种利用高分辨率共聚焦显微镜鉴定抗迁移药物活性的新型肿瘤细胞球体构建方法。相较于悬滴法等其他技术15，使用低吸附培养板有助于生成可重复且均一的细胞球体，适用于胶原迁移与侵袭实验。本实验方案的关键步骤包括：在将细胞球体包埋于胶原基质前，需彻底移除96孔板中的生长培养基；此后需小心操作含有球体的胶原凝胶块。目前已有数字微流控等新技术出现16，尽管成本较高，但可作为人工更换培养基和液体的替代方案。本方法的主要局限在于，当逐个对单个细胞球体进行明场显微镜成像并手动分析以评估抑制剂药物活性时，过程较为耗时。此外，该流程各步骤所需的试剂价格昂贵，且必须配备高分辨率共聚焦显微镜等专用设备。在开展胶原侵袭实验前，还需预先确定接种所需的最适细胞数量以及形成目标大小细胞球体所需的时间。
靶向癌细胞的药物研发、大规模药物筛选以及药物活性表征以用于药物优化与改进，正日益依赖于三维细胞检测技术。本实验方案可进一步优化并适用于其他实验检测方法，以及多种在其他疾病体系中具有重要意义的细胞类型。迄今为止，显微...

三维球状体技术在临床前药物发现及潜在抗癌药物开发中的应用正日益受到青睐，逐渐取代传统的药物筛选方法；因此，针对抑制细胞迁移和侵袭的抗转移药物（migrastatic drugs）的研发也越来越多。这一癌症治疗领域发展的背后逻辑十分明确：三维球状体检测能够更真实地模拟三维肿瘤结构，比单层细胞培养更能准确反映药物与肿瘤之间的相互作用（动力学），并可在与肿瘤相关的环境中表征药物活性，因而为潜在抗癌药物的筛选提供了更为可靠的模型。此外，多种癌症类型对化疗毒性药物产生耐药性的现象日益普遍，且由于癌细胞具有向远端部位迁移的能力，导致转移频发，癌症患者死亡率居高不下，这也进一步支持将靶向癌细胞迁移能力的化疗药物作为辅助治疗手段纳入未来的临床癌症试验中1。这一需求在高度侵袭性癌症中尤为突出，例如高级别胶质母细胞瘤（GBM）。GBM的治疗通常包括手术、放疗和化疗。然而，即使采用联合治疗，大多数患者在初次诊断后1年内即复发，中位生存期仅为11至15个月2,3。近年来，三维技术领域取得了显著进展：旋转系统、微加工结构、三维支架以及其他独立检测方法正不断优化，以实现大规模常规化检测4,5,6,7。然而，这些检测所得结果必须以有意义的方式进行分析，因为目前对三维数据的解读常常受限于使用二维图像分析系统处理三维数据所带来的挑战。
尽管在图像采集速度和降低光毒性方面具有优势，大多数宽场成像系统仍受限于分辨率8。因此，若使用宽场系统进行成像，除与药物疗效相关的数据读出外，药物作用对迁移细胞三维细胞结构的细微效应不可避免地会丢失。相反，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）能够获取高质量的光学切片图像，并可在采集后通过计算机软件进行三维重建与渲染。因此，CLSM可直接用于复杂三维细胞结构的成像，从而实现对抗迁移抑制剂对三维结构影响的探究，以及对细胞迁移机制的深入分析。这无疑将指导未来迁移抑制类药物的开发。本文描述了一种整合的实验流程，包括类球体生成、药物处理、染色方案以及高分辨率共聚焦显微镜下的表征。

<table><tbody><tr><td>胶原蛋白 I，大鼠尾部，100 mg</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>用于胶质瘤侵袭实验；该产品由多家供应商/制造商提供，需根据预期实验类型和所用细胞系进行选择。对于胶质瘤细胞系，推荐使用大鼠尾部I型胶原蛋白（例如 Corning）。胶原蛋白应于4 &amp;deg;C避光保存，直至使用。不建议混合不同批次的胶原蛋白，以免影响聚合后胶原的一致性。&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>多种</td><td>多种</td><td>用于显微镜成像</td></tr><tr><td>DMEM粉末</td><td>Sigma</td><td>D5648</td><td>用于制备胶质瘤侵袭实验中胶原溶液所需的5倍浓度培养基；&amp;nbsp; 可购买粉末形式，用双蒸水配制，并根据最终生长培养基的组成添加所需添加剂。完整的5倍浓度溶液在使用前应通过注射器滤器系统（0.22 &amp;mu;m）过滤。</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F7524-500ML</td><td>用于胶质瘤细胞系的细胞培养</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>多种</td><td>多种</td><td>用于显微镜成像</td></tr><tr><td>高糖DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965062</td><td>用于胶质瘤细胞系的细胞培养</td></tr><tr><td>抑制剂</td><td>Tocris</td><td>多种</td><td>根据实验设计选择不同种类；抑制剂可从Selleckchem和Tocris等厂家购买。这些厂家提供抑制剂特性的详细说明、相关文献链接以及推荐工作浓度。与所有抑制剂一样，它们可能具有潜在毒性，应按照健康与安全指南操作。抑制剂应按照制造商建议配制成储备液。例如，我们使用迁移抑制剂MI-192来演示此类抑制剂的应用。我们已通过此方法测试了多种迁移抑制剂，并获得了可比的结果。</td></tr><tr><td>封片剂</td><td>多种</td><td>多种</td><td>用于显微成像</td></tr><tr><td>NaOH（1 M）</td><td>多种&amp;nbsp;</td><td>多种</td><td>NaOH可直接购买所需摩尔浓度的溶液，或由固体配制而成。配制后的溶液应使用注射器滤器系统进行过滤除菌。1 M NaOH具有腐蚀性，在配制过程中应小心操作。</td></tr><tr><td>多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>多种</td><td>多种</td><td>用于固定类球体和细胞；配制成4%溶液，注意健康危害，确保在制备侵袭实验用胶原溶液时遵守健康与安全规定</td></tr><tr><td>移液管（刻度移液管，3 mL）</td><td>多种</td><td>多种</td><td>用于侵袭实验和溶液移除</td></tr><tr><td>PBS，无菌组织培养级</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>用于胶质瘤细胞系的细胞培养及染色洗涤</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（抗生素）</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>用于胶质瘤细胞系的细胞培养</td></tr><tr><td>一抗、二抗、DAPI、鬼笔环肽</td><td>多种</td><td>多种</td><td>这些试剂有多个厂家供应，对于标记的二抗，我们推荐使用Alexa Fluor（Molecular Probes）。本实验中，一抗使用小鼠抗乙酰化微管蛋白抗体（1/100，Abcam），二抗使用1/500稀释的抗小鼠Alexa Fluor 488标记抗体（Molecular Probes）。细胞核染色使用DAPI（多个厂家），肌动蛋白染色使用鬼笔环肽（多个厂家），两者均按推荐稀释比例1/500使用。</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>用于制备胶质瘤侵袭实验中5倍浓度的胶原溶液</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td>用于制备胶质瘤侵袭实验中5倍浓度的胶原溶液</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>用于胰酶消化</td></tr><tr><td>超低吸附培养板</td><td>Sigma/Nunc</td><td>CLS7007-24EA</td><td>用于胶质瘤侵袭实验；需要低吸附性培养板，优先选用96孔板以便对研究中的化合物进行大规模筛选。市面上有多种低吸附性培养板可供选择；建议测试多种培养板以获得最佳类球体生成效果。根据我们的经验，Costar超低吸附圆底带盖培养板在胶质瘤癌细胞形成类球体方面表现最佳，可实现100%类球体形成且具有良好的可重复性。这些培养板在我们实验室也成功用于患者来源材料、膀胱癌和卵巢癌细胞的胶质瘤类球体制备。此外，干细胞或前体神经球也可用于此类培养板，以促进标准化神经球-类球体的生成</td></tr><tr><td>移液管（血清移液管，无菌，5 mL和10 mL）</td><td>多种，例如 Costar</td><td>CLS4488-50; CLS4487-50</td><td>用于组织培养和胶原制备</td></tr><tr><td>多种多通道（50 - 250 &amp;mu;L）和单通道移液器（10 &amp;mu;L、50 &amp;mu;L、200 &amp;mu;L、1 mL）</td><td>多种</td><td>多种</td><td>用于细胞和类球体操作</td></tr><tr><td>宽场显微镜</td><td>多种&amp;nbsp;</td><td>多种</td><td>用于观察类球体生成及类球体成像；本实验中使用EVOS FL细胞成像系统（Thermo Fisher Scientific）采集宽场荧光图像</td></tr><tr><td>配备Plan Apochromat 63x 1.4 NA油镜的Zeiss LSM 880共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）</td><td>Zeiss</td><td>厂家报价</td><td>使用配备Plan Apochromat 63x 1.4 NA油镜的Zeiss LSM 880共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）采集共聚焦图像。采用二极管405 nm、458/488/514 nm氩多线激光器和HeNe 594 nm激光器分别激发Phalloidin 594、Alexa Fluor 488和DAPI。每张图像均采集一个代表性光学切片，所有设置（图像采集前后）均保持一致以确保可比性。所有图像随后使用配套的Zen成像软件和Adobe Photoshop进行处理。</td></tr></tbody></table>

通过高分辨率共聚焦显微镜表征抗转移抑制剂对三维肿瘤球体侵袭的影响

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

癌症研究中的药物发现与开发正越来越多地基于三维（3D）形式的药物筛选。研究人员正在发现并评估一些新型抑制剂，这些抑制剂靶向癌细胞的迁移和侵袭能力，从而抑制疾病的转移扩散，可作为胶质瘤等高度侵袭性癌症的辅助治疗手段。因此，亟需获得能够在药物处理后对三维环境中细胞行为进行详细分析的数据。本文所述的方法结合了类球体侵袭实验、高分辨率图像采集以及共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的数据分析，实现了对潜在抗迁移抑制剂MI-192作用下胶质瘤细胞效应的深入表征。类球体由细胞系在低黏附96孔板中生成，用于侵袭实验，随后制备用于CLSM分析。该实验流程相较于其他常用的类球体生成技术，具有操作简便且可重复性高的优势。此外，共聚焦显微镜相比传统宽场显微镜可获得更高的图像分辨率，从而能够在三维环境中识别并分析使用迁移抑制药物MI-192处理后迁移细胞发生的显著形态学变化。

三维球状体技术正在推动对药物-肿瘤相互作用的理解，因为它更能代表癌症特异性的微环境。球状体的生成可通过多种方式实现；本方案采用低黏附96孔板。在测试了多个不同厂家的产品后，选择本实验所用的培养板，因其在球状体成功形成率和均一性方面始终表现最佳。更换步骤（即将培养基替换为胶原基质）是本方案的关键环节；必须小心操作，在不扰动球状体本身的条件下尽可能移除大部分培养基。可采用自动化成像结合宽场显微镜对药物诱导效应进行表征，以消除操作者主观偏差，但目前市面上可用的自动化设备成本仍显著高于本文所述的成像方法。
宽场落射荧光显微镜可用于观察药物活性对细胞迁移和侵袭的影响。然而，宽场显微镜所获得的分辨率不足以对药物对细胞形态的影响进行详细的结果解读（图1）。本文描述了通过可轻松重复的染色方案制备胶质瘤类球体及迁移细胞的过程，随后使用共聚焦显微镜进行成像。从宽场显微镜图像分析中可以明显看出，经MI-192抑制剂...

通过高分辨率共聚焦显微镜，表征组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂在三维（3D）侵袭实验中对胶质瘤癌细胞迁移的抗迁移作用。

癌症研究中的药物发现与开发正越来越多地基于三维形式的药物筛选。针对细胞迁移和……的新抑制剂

本方案表明，我们现在可以在三维癌症模型中详细确定抗迁移抑制剂的作用。该方法的主要优势在于操作简便且集成了多种功能，可一站式完成实验。该技术能够在三维环境下评估抗迁移药物在癌症研究中的效果，使药物测试更贴近肿瘤的实际微环境。该方法可应用于癌症中细胞毒性药物的测试，或例如用于评估辐射对癌细胞增殖和细胞迁移的影响。建议先在普通的96孔板中练习培养基去除步骤以及胶原蛋白替换操作，以熟练掌握相关技术。此外，共聚焦显微镜的操作培训也至关重要。该技术的可视化演示对于研究人员理解类球体所需的精细操作及其在共聚焦显微镜中的应用至关重要。实验第一天，准备好标准培养基，本例中为U251，以用于相应的细胞系。在组织培养罩内，向培养物中加入0.5毫升胰蛋白酶，以消化癌细胞。使用血细胞计数板对癌细胞进行计数，并稀释至每毫升含5 × 10³个细胞的浓度。将细胞悬液置于明确标记的无菌通用管中保存。轻轻倒置混匀以重悬细胞，避免细胞聚集。使用移液器向96孔板的每个孔中加入200 µL细胞培养液。向每个空孔中加入200 µL 1× PBS，以防止蒸发。将细胞置于37°C培养箱中孵育。24小时后，通过明场显微镜观察细胞。胶质瘤癌细胞系等细胞系在24小时内于孔底形成球状体。将球状体继续培养48小时，以形成三维细胞结构。第三天，将胶原蛋白、5倍浓度培养基、1摩尔氢氧化钠和一个20毫升离心管置于冰上。小心且缓慢地将10.4毫升冷胶原蛋白加入预冷的培养管中。避免产生气泡。然后，轻轻加入 1.52 毫升冷的无菌 5 倍浓度培养基，避免产生气泡。使用前立即轻轻加入 72 微升冷的无菌 1 摩尔氢氧化钠，并将溶液置于冰上保存。使用移液器轻轻混匀，避免产生气泡。充分混匀后，培养基颜色会由红色变为橙红色。将混合物置于冰上直至使用。接下来，从第一天制备的96孔板中移除190微升上清液时，应使用移液器倾斜靠近孔壁进行操作。务必小心，避免扰动在孔底部形成的球状体。沿孔壁轻轻向每孔加入100微升胶原混合液，移液时沿孔壁缓慢加入。避免产生气泡及任何类球体的扰动。将剩余的胶原蛋白混合液保留在20毫升离心管中，并置于室温下以评估其聚合情况。将培养板放入培养箱中孵育至少10分钟，以使胶原蛋白充分聚合。当残留的胶原蛋白变为半固体且呈海绵状时，类球体即可进行抑制剂处理。将抑制剂以2倍浓度加入5毫升培养基中。用移液器沿每个孔的孔壁轻轻加入100微升培养基，以避免扰动类球体。在0小时、24小时、48小时和72小时时间点，通过明场显微镜观察并成像每个球状体，以评估药物活性。随后，将培养板放回培养箱中。现在，将培养板置于组织培养超净台中，并轻轻将上清液替换为100微升1×PBS。注意不要扰动类球体，避免触碰胶原蛋白。重复此洗涤步骤三次。移除每个孔中的最后一次洗涤液，并加入100 µL含4%多聚甲醛的1×PBS溶液。将96孔板放置在实验台上，用铝箔覆盖，室温下静置24小时。次日，小心移除甲醛，并加入1× PBS。重复此洗涤步骤三次。然后，将1× PBS洗涤液更换为100微升新配制的Triton X-100溶液，在室温下孵育30分钟。在此期间，在50毫升离心管中用50毫升1× PBS和0.5%脱脂奶粉配制封闭液，并充分混匀。30分钟后，去除Triton X-100，用1×PBS洗涤三次。每孔加入100微升封闭液，孵育15分钟。接着，将抗小鼠IgG乙酰化微管蛋白抗体按1:100的比例用封闭缓冲液稀释。将一抗封闭缓冲液混合物在15,682 ×g 条件下离心5分钟。小心移除每孔中的封闭液，并向每孔中加入25至50 µL来自离心管的抗体封闭缓冲液上清。室温避光孵育1小时。然后，从每个孔中移除抗体溶液，并用 100 µL 的 1× PBS 洗涤三次。将二抗按照推荐浓度用封闭缓冲液稀释，同时加入其他所需的荧光染料。再次将二抗溶液在 15,682 ×g 条件下离心 5 分钟。吸去每孔中的封闭液，加入 25 至 50 微升二抗上清液。室温下避光孵育 1.5 小时。去除二抗染料溶液，用 1× PBS 洗涤三次，每次每孔 100 微升。用塑料200微升移液器通过轻柔抽吸，将单个胶原塞小心转移至玻璃载玻片中央。加入一滴合适的封片剂以覆盖胶原塞。将盖玻片置于样品上方，将载玻片置于室温避光处保存。三维球体技术正在推动对药物-肿瘤相互作用的理解，因为它更能代表癌症特异性的微环境。本研究检测了潜在的抗迁移或促迁移效应。这一点在KNS42细胞系中尤为明显，其对照组和处理组的球体均表现出几乎无迁移现象。在10 µM的最高抑制剂浓度下观察到细胞死亡。U251细胞中可见细胞核断裂和迁移的细胞。U251细胞球体出现从原始球体向外辐射的突起，且随着抑制剂浓度增加，细胞变圆的现象愈加明显。在KNS42细胞中观察到微管塌陷和细胞核碎裂。具有单个细胞突起的片状突起表明KNS42细胞发生迁移。在最低抑制剂浓度下，该表型显著，但随着抑制剂浓度增加而消失。在准备就绪之前，必须将所有试剂保持在冰上。否则，胶原蛋白会在完全加入类球体之前就开始聚合。可以通过共聚焦显微镜生成的图像进行定量分析，以评估例如抗迁移药物对细胞形态的影响。这使我们首次得以证实迁移抑制剂 MI-192 对微管乙酰化水平的影响，并进一步探讨其在细胞迁移方面的作用。在固定步骤中操作甲醛时应格外小心。须遵守常规的健康与安全指南。

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癌症研究

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通过高分辨率共聚焦显微镜表征抗转移抑制剂对三维肿瘤球体侵袭的影响

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