微生物相互作用研究的高通量共培养测定

我们的协议提供了一种高通量方法，用于同时筛选大量对微生物相互作用，从而识别感兴趣的相互作用，从而有助于微生物群研究和抗菌发现。这种方法很容易适用于研究各种系统中的微生物相互作用，只要微生物在实验室条件下与培养和蔼可亲。这种技术的主要优点是允许用户在相对较短的时间内筛选大量的微生物相互作用。

这项技术的新使用者应该需要时间，尤其是在接种生物测定板时，因为必须小心尽量减少过度生长或污染至关重要。这种技术的视觉演示至关重要，因为为生物测定板接种疫苗需要精确，以确保生物体不会过度生长，并且共培养物不会受到污染。首先准备一夜文化。

使用血清移液器将三毫升 BHI 汤添加到 14 毫升培养管中。然后使用无菌的一微升接种回路将细菌菌群接种到肉汤中。旋转环，以确保团分散入汤中。

短暂地旋转培养管，并在37摄氏度的摇床上孵育过夜，在250 RPM的摇床上。一旦细菌培养物达到OD 600以上，涡旋它们分裂细胞团。用 1.5% 的 agar 准备 PHI 介质，然后通过高压灭菌消毒。

然后在温控水浴中将介质冷却至55摄氏度，将三毫升熔融的BHI介质喷入板上的12个水井中，确保水井尽可能均匀。然后让阿加在一夜之间设置。通过将无菌的10微升接种环插入隔夜培养物，并在板井的左三分之一上条纹培养物液滴，在生物测定板上对试验体进行接种。

重复，直到板上的所有 12 口孔都接种。在适当的温度下将盘子倒置孵育七天。如果在高于或等于37摄氏度的温度下孵育，或在干燥的气候下，将盘子存放在潮湿的容器中，以防止其干涸。

生物测定板的六天孵育后，如先前所述，准备目标生物体的隔夜培养。通过用 1.8 毫升 BHI 和 200 微升的目标隔夜培养器填充空 12 井板的每个井来准备目标板。将无菌接种图章放入目标板。

轻轻地围绕油井旋转文化，确保它们不会交叉污染相邻的油井。提起接种盖章，并确保每个印戳尖端都有稀释的目标培养力。将接种盖章放在未接种的生物测定板上，轻轻摇动该图章，使培养液滴接种每一个井。

一旦邮票被移除，在井中应可以看到一滴培养液。如果任何水井未接种接种盖章，则使用移液器将稀释过夜培养的三微升印在井上。然后接种前述的生物测定板，但将印戳尖端与12孔板的右侧对齐，确保印戳不会接触现有的细菌菌落。

小心地取下图章，并将其放回目标板上。如果搅拌体在井中不均匀凝固，则来回轻轻摇动邮票，但要小心不要将印戳移入测试生物体生长。对每个生物测定板重复接种，直到所有板接种，然后在适当的温度下倒置孵育板七天。

在共同培养测试和目标生物体一周后，根据视觉评估对相互作用进行评分。用目标生物体生长的井得分，这些生物体的生长与单一培养物的生长无法区分为零。将生长减少的油井得分为一，无增长为二。

此处描述的共培养测定用于评估行为细菌测试生物体对从人类鼻腔分离的葡萄球菌物种目标的抑制活性。共测试了812种配对组合。值得注意的是，皮质杆菌强烈抑制凝血杆菌负性葡萄球菌，特别是与其他皮质细菌相比，这些菌群要么弱弱地抑制了凝血球，要么没有抑制作用。

通过比较基因组学，在科林菌丙酸基因组中确定了用于侧罗磷生产的生物合成基因簇。使用标准和铁补充的BHI介质进行共培养相互作用测定，确定柯林杆菌和凝血杆菌阴性葡萄球菌之间的抑制表型实际上与铁相关。冲压盘子时要小心，这一点很重要。

冲压后仔细检查每个井，并确保接种盖章正确对齐，以防止污染。在确定感兴趣的相互作用后，使用微生物遗传学和基因组学、天然产品分离和表征或成像质谱法的后续研究可用于描述这些相互作用背后的机制。该协议最近被用来揭示人类鼻微生物群之间的侧罗激素介质之间的竞争，并帮助发现了一种新的抗真菌分子，称为青霉素。