Name: 鼠头的生物力学试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学习使用定制3D打印夹具对小鼠肌腱进行高效可重复的拉伸生物力学测试方法。该技术将测试时间从数小时缩短至数分钟，并消除了传统方法中常见的夹持伪影，适用于多种肌腱类型。

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本研究由美国国立卫生研究院/国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH / NIAMS）资助（项目编号：R01 AR055580，R01 AR057836）。

动物实验已获得哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会的批准。本研究使用的小鼠品系为 C57BL/6J，购自杰克逊实验室（美国缅因州巴尔港）。小鼠饲养于无病原体屏障环境中，并可自由获取食物和水。
1. 用于夹持骨骼的定制化3D打印夹具的开发
<ol>
	<li>骨图像采集与三维骨模型构建
	<ol>
		<li>解剖目标骨骼，为创建三维模型和打印三维骨夹具做准备；本方案以肱骨和跟骨为例。 
		注意：用于力学测试的骨-肌腱-肌肉标本的详细解剖步骤见第2.1.1节。以下步骤应遵循以分离骨骼，用于制作3D打印骨夹具。
		<ol>
			<li>肱骨解剖：根据IACUC批准的程序处死小鼠。去除上肢皮肤，清除肱骨表面所有肌肉，分离肘关节和盂肱关节，并小心去除附着在肱骨上的所有结缔组织。</li>
			<li>跟骨解剖：根据IACUC批准的程序处死小鼠。去除下肢皮肤，分离跟腱-跟骨连接处以及跟骨与其他足部骨骼之间的关节，并小心去除附着在跟骨上的所有结缔组织。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对完整骨骼进行显微计算机断层扫描（microcomputed tomography），例如扫描肱骨和跟骨样本。 
		注意：根据所用扫描仪不同，设置参数会有所差异。在本研究使用的扫描仪（材料表）中，推荐设置为：55 kVP能量，Al 0.25滤光片，分辨率为6 μm。
		<ol>
			<li>将琼脂糖粉末加入超纯水中，微波加热1–3分钟，直至琼脂糖完全溶解。建议先加热30–45秒，停止并摇匀，再继续加热至沸腾。将琼脂糖填充至冻存管体积的四分之三。让琼脂糖冷却约5–10分钟。</li>
			<li>将骨骼插入琼脂糖凝胶中（以防止扫描过程中产生运动伪影）。将装有骨骼的冻存管放入扫描仪中。 
			注意：在本研究使用的扫描仪中，所有扫描均使用16位自动样品更换器。该扫描仪可根据样品的大小和形状自动选择放大倍数。&#160;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将显微CT扫描的投影图像重建为横截面图像。使用实验人员扫描仪/软件组合推荐的参数。 
		注意：在本研究使用的程序（材料表）中，建议使用以下重建参数：平滑度：0–2，束硬化校正：45，环状伪影减少：4–9，并以16位TIFF格式重建切片。</li>
		<li>创建三维&#160;模型，并保存为大多数3D打印机和快速原型系统兼容的标准STL格式。在本研究使用的程序（材料表）中，执行以下操作：
		<ol>
			<li>选择命令 文件 &#62; 打开 以打开文件数据集。打开对话框 文件 &#62; 首选项，并选择 高级 选项卡。</li>
			<li>使用自适应渲染算法构建三维模型。该算法可最小化面片三角形数量，并提供更平滑的表面细节。将局部性参数设为10；该参数定义用于寻找物体边界的邻近点的像素距离。将容差最小化至0.1，以减小文件大小。 
			注意：打开数据集后，图像将显示在“原始图像”页面中。</li>
			<li>为指定感兴趣体积（VOI），手动选择两张图像，作为所选VOI范围的顶部和底部。</li>
			<li>进入第二页 感兴趣区域。在单张横截面图像上手动选择感兴趣区域。 
			注意：所选区域将以红色高亮显示（即肱骨横截面积）。</li>
			<li>每隔10–15张横截面图像重复上一步骤。</li>
			<li>进入第三页 二值选择。在直方图菜单中，点击 来自数据集。将显示数据集中所有图像的亮度直方图分布。同样在直方图菜单中，点击 创建3D模型 文件菜单。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将骨骼的三维模型以STL文件格式保存。</li>
		<li>优化网格：调整网格以减小STL文件大小，并使其与任何实体建模计算机辅助设计程序兼容。在本研究使用的程序（材料表）中，按以下步骤操作：
		<ol>
			<li>导入网格并全选以进行编辑。从 编辑 工具集中选择 减少&#160;。然后，从“减少目标”工具集中选择 &#160;三角形预算。减少三角形数量并确认更改。&#160;通过选择“导出为…”将新减小的文件以STL格式重新保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定制化骨夹具设计
	<ol>
		<li>冈上肌腱-肱骨
		<ol>
			<li>使用实体建模计算机辅助设计程序创建与肱骨匹配的定制夹具模型（图1，补充文件）。 
			注意：本研究使用的程序列于 材料表 中。</li>
			<li>在实体建模程序中打开肱骨的STL格式文件，并保存为零件文件。 
			注意：在本研究使用的软件（材料表）中，三维骨对象以SLDPRT格式保存。</li>
			<li>打开零件文件，并手动创建三个解剖学相关的平面（即矢状面、冠状面、横断面）。
			<ol>
				<li>手动定义矢状面，使其穿过大结节处的冈上肌腱附着点。确保三维块体包含该矢状面作为对称平面。如有需要，可添加或切除块体材料以实现此目的。 
				注意：该对称平面可确保当标本插入夹具时，肌腱及其附着点位于夹具的中心轴上。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>沿三个平面（即高度、宽度、长度）测量骨骼的尺寸。</li>
			<li>测量3D打印夹具将要安装的力学测试夹具的尺寸。</li>
			<li>首先设计一个实心块体零件（例如实心圆柱体）。
			<ol>
				<li>确保块体的每个尺寸至少比肱骨尺寸大5 mm。</li>
				<li>考虑力学测试夹具的设计限制（即确保3D打印夹具可在力学测试夹具中自由组装和拆卸）。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>创建一个包含两个组件的装配体模型：实心块体和右侧或左侧肱骨。定义骨骼在块体内的方向（即肌腱与骨骼之间的角度）。确保整个骨骼体积完全位于块体内。</li>
			<li>使用肱骨作为模具在块体中创建空腔。若使用 材料表 中指定的软件，请按以下步骤操作：
			<ol>
				<li>将设计零件（肱骨）和模具基体（圆柱块）插入临时装配体中。在装配体窗口中，选择块体，然后从 装配体 工具栏中点击 编辑组件。</li>
				<li>点击 插入 &#62; 特征 &#62; 空腔。选择 统一缩放，并将各方向的缩放值设为0%。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>抑制骨骼零件，并将装配体保存为零件。</li>
			<li>打开零件（带空腔的圆柱体）。沿矢状面切割该零件，以创建两个对称组件，分别从前侧和后侧贴合骨骼（例如两个半圆柱体，如 图1 所示）。 
			注意：设计两个组件，分别从前侧和后侧贴合骨骼。前侧组件包括一个从肱骨头前侧延伸至冈上肌腱附着点的半球形空腔。后侧组件的空腔形状与肱骨后部一致（即肱骨头后侧、三角肌粗隆、内上髁和外上髁）。</li>
			<li>将每个组件保存为独立的零件文件。</li>
			<li>对于前侧组件，通过定义适当的公差，确保肱骨头完全嵌入零件的空腔中。 
			注意：在本研究中，使用 材料表 中指定的软件，建议按以下步骤操作：
			<ol>
				<li>创建旋转切除以平滑空腔的网格几何形状。通过模拟空腔几何形状并添加定位间隙来绘制切除草图。 
				注意：该间隙允许骨骼与前侧组件之间自由组装和拆卸。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>修改后侧组件，模仿空腔几何形状创建带有间隙的切除，如前侧组件所述。</li>
			<li>从后侧组件顶部开始，沿横断面进行切割，直至大/小结节的嵴部。 
			注意：如 图1 和 图2 所示，后侧组件包含一个在肌腱附着处形成开口的切割。</li>
			<li>在两个组件之间创建紧密配合，以实现自由组装和拆卸。 
			注意：在本研究中，夹具设计采用了具有松动运行间隙的孔-轴配合。</li>
			<li>为对侧肢体（即左侧或右侧）的夹具每个组件创建三维镜像模型。</li>
			<li>在夹具底部添加刻痕，以区分左右侧。</li>
			<li>将所有夹具零件以STL标准文件格式保存，为3D打印做准备。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>跟腱-跟骨
		<ol>
			<li>遵循上述冈上肌腱-肱骨头夹具的相同步骤。 
			注意：由于左右跟骨的解剖结构几乎对称，因此仅需一套夹具即可用于跟腱-跟骨连接。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠肌腱的生物力学测试
<ol>
	<li>标本制备与横截面积测量
	<ol>
		<li>解剖目标肌肉-肌腱-骨骼标本，为拉伸力学测试做准备。本研究中，从8周龄C57BL/6J小鼠中分离出冈上肌-肌腱-肱骨标本（N=10，5只雄性，5只雌性）和腓肠肌-跟腱-跟骨标本（N=12，6只雄性，6只雌性）。
		<ol>
			<li>冈上肌-肌腱-肱骨标本的解剖
			<ol>
				<li>按照IACUC批准的程序处死小鼠。将小鼠置于俯卧位，在前肢肘部上方至肩部的皮肤处做切口。</li>
				<li>用钝性解剖法小心去除皮肤，使肩部肌肉组织暴露。去除肱骨周围的组织，直至暴露骨骼，并能用镊子牢固夹持。</li>
				<li>用镊子夹住肱骨，小心去除三角肌和斜方肌，以暴露喙肩弓。识别肩锁关节，并用手术刀片小心将锁骨与肩峰分离。</li>
				<li>注意不要损伤冈上肌腱及其骨性附着点，使用手术刀片将其从肩胛骨附着处分离。继续注意保护冈上肌腱及其骨性附着点，将肱骨头从关节盂中分离；使用手术刀片切开关节囊以及小圆肌、肩胛下肌和冈下肌的肌腱。</li>
				<li>解离肘关节，使肱骨与尺骨、桡骨分离。分离出肱骨-冈上肌腱-肌肉标本，并清除肱骨及肱骨头上的多余软组织。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>跟腱-跟骨标本的解剖
			<ol>
				<li>按照IACUC批准的程序处死小鼠。将小鼠置于俯卧位。注意不要损伤跟腱及其骨性附着点，用钝性解剖法去除皮肤，使踝关节和膝关节周围的肌肉组织暴露。</li>
				<li>使用手术刀片，从跟腱-跟骨附着点开始，小心地将腓肠肌从其近端附着点分离。</li>
				<li>小心地将跟骨与周围相邻骨骼解离。分离出跟腱-跟骨标本，并清除多余的软组织。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用显微计算机断层扫描（microcomputed tomography）测定肌腱的横截面积。 
		注：本研究使用的扫描仪（材料表）推荐设置为：55 kVP能量下扫描，Al 0.25滤波器，分辨率为5 μm。
		<ol>
			<li>将琼脂糖粉末溶于超纯水中，微波加热1–3分钟，直至琼脂糖完全溶解。建议先微波加热30–45秒，暂停并摇匀，再继续加热至沸腾。将琼脂糖注入冻存管至约四分之三满。让琼脂糖冷却约5–10分钟。</li>
			<li>将标本倒置插入冻存管中，使其悬浮于琼脂糖内。 
			注：仅骨骼部分应浸入琼脂糖凝胶中，肌腱和肌肉应悬于凝胶外部。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>扫描完成后，使用手术刀片小心去除肌腱上的肌肉组织。将标本插入3D打印夹具中。 
		注：夹具可重复使用。切勿在夹具中使用胶水或环氧树脂；骨骼通过过盈配合固定。</li>
		<li>将肌腱夹在折叠的薄层滤纸（2 cm × 1 cm）之间并用胶水固定，再使用薄膜夹具夹紧该结构。将带有标本的3D打印夹具安装至测试夹具中。</li>
		<li>将样品及夹具置于37 °C的磷酸盐缓冲盐水（PBS）测试浴中（即小鼠体温23）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>拉伸测试
	<ol>
		<li>在材料试验机上进行拉伸力学测试。 
		注：本研究使用的试验机（材料表）推荐测试方案如下：
		<ol>
			<li>将标距长度定义为肌腱附着点至上方夹具的距离。</li>
			<li>在0.05 N至0.2 N之间进行5次预加载循环。</li>
			<li>保持120秒。</li>
			<li>以0.2%/s的速率进行至断裂的拉伸测试。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>采集载荷-变形数据。</li>
		<li>将应变计算为相对于肌腱初始标距长度的位移。</li>
		<li>将应力计算为力除以肌腱初始横截面积（由microCT测量获得）。</li>
		<li>若关注黏弹性行为，可在断裂拉伸测试前进行应力松弛实验，并利用数据计算准线性黏弹性模型中的参数，如A、B、C、tau1和tau224。</li>
		<li>从载荷-变形曲线中计算刚度（曲线线性部分的斜率）、最大载荷以及屈服功（曲线下至屈服载荷的面积）。
		<ol>
			<li>通过在载荷-变形曲线上选择一段使线性最小二乘回归的R2值最大化的数据点窗口，确定线性部分25。</li>
			<li>将刚度确定为载荷-位移曲线线性部分的斜率25,26。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从应力-应变曲线中计算模量（曲线线性部分的斜率）、强度（最大应力）和回弹性（曲线下至屈服应力的面积）。 
		注：采用RANSAC算法，屈服应变（x值）定义为拟合曲线偏离预期应力值（y值）超过0.5%时的第一个点。屈服应力为对应于屈服应变的y值。 
		注：除本研究中描述的单调拉伸至断裂外，循环加载可提供有关肌腱疲劳和/或黏弹性特性的关键信息。例如，Freedman等人报道了小鼠跟腱的疲劳特性27。</li>
		<li>完成拉伸测试后，对整个骨骼进行显微计算机断层扫描，例如扫描肱骨和跟骨样本。 
		注：本研究使用的扫描仪（材料表）推荐设置为：55 kVP能量下扫描，Al 0.25滤波器，分辨率为6 μm。
		<ol>
			<li>重复步骤1.1.2.1–1.1.2.2。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>重复步骤1.1.3。</li>
		<li>使用与扫描仪兼容的3D可视化软件，生成扫描对象的容积渲染3D模型。 
		注：本研究使用的软件列于材料表中。</li>
		<li>通过观察3D模型确定失效模式及失效部位面积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>统计分析：所有样本结果以均值±标准差（SD）表示。组间比较采用双尾非配对学生t检验。显著性水平设为 p &#60; 0.05。 
	注：本研究使用的统计软件列于材料表中。</li>
</ol>

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<li>Talan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+temperature+of+C57BL%2F6J+mice+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Body temperature of C57BL/6J mice with age.</a> Experimental Gerontology. 19, 25-29 (1984).</li>
<li>Newton, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+testing+angle+on+the+biomechanical+properties+of+the+rat+supraspinatus+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">The influence of testing angle on the biomechanical properties of the rat supraspinatus tendon.</a> Journal of Biomechanics. 49, 4159-4163 (2016).</li>
<li>Schwartz, A. G., Lipner, J. H., Pasteris, J. D., Genin, G. M., Thomopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+loading+is+necessary+for+the+formation+of+a+functional+tendon+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Muscle loading is necessary for the formation of a functional tendon enthesis.</a> Bone. 55, 44-51 (2014).</li>
<li>Gimbel, J. A., Van Kleunen, J. P., Williams, G. R., Thomopoulos, S., Soslowsky, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+durations+of+immobilization+in+the+rat+result+in+enhanced+mechanical+properties+of+the+healing+supraspinatus+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Long durations of immobilization in the rat result in enhanced mechanical properties of the healing supraspinatus tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129, 400-404 (2006).</li>
<li>Freedman, B. R., Sarver, J. J., Buckley, M. R., Voleti, P. B., Soslowsky, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+and+structural+response+of+healing+Achilles+tendon+to+fatigue+loading+following+acute+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Biomechanical and structural response of healing Achilles tendon to fatigue loading following acute injury.</a> Journal of Biomechanics. 47, 2028-2034 (2014).</li>
<li>Deymier, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiscale+structural+and+mechanical+effects+of+mouse+supraspinatus+muscle+unloading+on+the+mature+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">The multiscale structural and mechanical effects of mouse supraspinatus muscle unloading on the mature enthesis.</a> Acta Biomaterialia. 83, 302-313 (2019).</li>
<li>Killian, M. L., Thomopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scleraxis+is+required+for+the+development+of+a+functional+tendon+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Scleraxis is required for the development of a functional tendon enthesis.</a> FASEB Journal. 30, 301-311 (2016).</li>
<li>Schwartz, A. G., Long, F., Thomopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enthesis+fibrocartilage+cells+originate+from+a+population+of+Hedgehog-responsive+cells+modulated+by+the+loading+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Enthesis fibrocartilage cells originate from a population of Hedgehog-responsive cells modulated by the loading environment.</a> Development. 142, 196-206 (2015).</li>
<li>Bell, R., Taub, P., Cagle, P., Flatow, E. L., Andarawis-Puri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+of+supraspinatus+tendon+insertion+site+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model of supraspinatus tendon insertion site healing.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33, 25-32 (2014).</li>
<li>Connizzo, B. K., Bhatt, P. R., Liechty, K. W., Soslowsky, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+Alters+Mechanical+Properties+and+Collagen+Fiber+Re-Alignment+in+Multiple+Mouse+Tendons%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Diabetes Alters Mechanical Properties and Collagen Fiber Re-Alignment in Multiple Mouse Tendons.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42, 1880-1888 (2014).</li>
<li>Eekhoff, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+Distinct+Tendons+From+Elastin+Haploinsufficient+Mice+Exhibit+Mild+Stiffening+and+Tendon-Specific+Structural+Alteration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Functionally Distinct Tendons From Elastin Haploinsufficient Mice Exhibit Mild Stiffening and Tendon-Specific Structural Alteration.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139, 111003(2017).</li>
<li>Mikic, B., Bierwert, L., Tsou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achilles+tendon+characterization+in+GDF-7+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Achilles tendon characterization in GDF-7 deficient mice.</a> Journal of Orthopaedic Research. 24, 831-841 (2006).</li>
<li>Sikes, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+hyaluronan+synthase+1%2C+but+not+3%2C+impairs+formation+of+the+retrocalcaneal+bursa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Knockout of hyaluronan synthase 1, but not 3, impairs formation of the retrocalcaneal bursa.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36, 2622-2632 (2018).</li>
<li>Wang, V. M., Banack, T. M., Tsai, C. W., Flatow, E. L., Jepsen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+in+tendon+and+knee+joint+biomechanics+among+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Variability in tendon and knee joint biomechanics among inbred mouse strains.</a> Journal of Orthopaedic Research. 24, 1200-1207 (2006).</li>
<li>Wang, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+tendon+function+is+adversely+affected+by+aggrecan+accumulation+due+to+the+knockout+of+ADAMTS5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Murine tendon function is adversely affected by aggrecan accumulation due to the knockout of ADAMTS5.</a> Journal of Orthopaedic Research. 30, 620-626 (2011).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+mineralization+is+progressive+and+associated+with+deterioration+of+tendon+biomechanical+properties%2C+and+requires+BMP-Smad+signaling+in+the+mouse+Achilles+tendon+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Tendon mineralization is progressive and associated with deterioration of tendon biomechanical properties, and requires BMP-Smad signaling in the mouse Achilles tendon injury model.</a> Matrix Biology. 52-54, 315-324 (2016).</li>
<li>Rooney, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibuprofen+differentially+affects+supraspinatus+muscle+and+tendon+adaptations+to+exercise+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ibuprofen differentially affects supraspinatus muscle and tendon adaptations to exercise in a rat model.</a> American Journal of Sports Medicine. 44, 2237-2245 (2016).</li>
<li>Galasso, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+of+Life+and+Functional+Results+of+Arthroscopic+Partial+Repair+of+Irreparable+Rotator+Cuff+Tears%5BTitle%5D)+AND+%22Arthroscopy+-+Journal+of+Arthroscopic+and+Related+Surgery%22%5BJournal%5D)">Quality of Life and Functional Results of Arthroscopic Partial Repair of Irreparable Rotator Cuff Tears.</a> Arthroscopy - Journal of Arthroscopic and Related Surgery. 33, 261-268 (2017).</li>
<li>Sarver, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+tendon+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Sex differences in tendon structure and function.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35, 2117-2126 (2017).</li>
<li>Razmjou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disability+and+satisfaction+after+Rotator+Cuff+decompression+or+repair%3A+A+sex+and+gender+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Musculoskeletal+Disorders%22%5BJournal%5D)">Disability and satisfaction after Rotator Cuff decompression or repair: A sex and gender analysis.</a> BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 66(2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

小鼠动物模型常用于研究肌腱疾病，但其力学特性的表征在文献中仍具有挑战性且鲜有报道。本实验方案的目的是描述一种高效且可重复的小鼠肌腱拉伸测试方法。新方法将测试单个样本所需时间从数小时缩短至数分钟，并消除了以往方法中常见的主要夹持伪影。
本方案中描述的多个步骤对于有效固定小鼠冈上肌腱和跟腱以进行力学测试至关重要。首先，步骤 1.1.4 对于创建所需骨骼的三维模型是必要的；然而，由于该扫描通常使用高分辨率，生成的文件可能过大，无法直接用于实体建模程序。本方案所用软件成功减小了文件大小（步骤 1.1.6），同时保留了对象的几何结构，尽管其他软件也可能实现类似效果。其次，每个解剖部位在设计夹具时均有特定的设计要求。对于冈上肌腱夹具的设计，关键在于：(i) 固定肱骨头以防止生长板在测试中发生破坏（步骤 1.2.1.12）；(ii) 设计合适的间隙配合，避免测试过程中肱骨从模具中脱出（步骤 1.2.1.12.1）；以及 (iii) 调整肱骨的方向，使其长轴与肌腱长轴形成 180° 角（步骤 1.2.1.7）。对于跟腱夹具的设计，关键在于：(i) 设计合适的间隙配合，能够牢固夹持较小的跟骨，防止测...

肌腱疾病在老年人群、运动员及活跃人群中十分常见且患病率很高1,2,3。在美国，每年报告的结缔组织损伤达1640万例4，占所有与损伤相关门诊就诊次数的30%3,5,6,7,8。最常受累的部位包括肩袖、跟腱和髌腱9。尽管已探索了多种非手术和手术治疗方法，包括抗炎药物、康复治疗和手术修复，但治疗效果仍不理想，功能恢复有限，且失败率较高5,6。这些不尽人意的临床结果推动了基础与转化研究，以期深入理解肌腱病的发病机制，并开发新的治疗策略。
拉伸生物力学性能是定义肌腱功能的主要定量指标。因此，对肌腱病及其治疗效果的实验室表征必须包括对肌腱拉伸性能的严格测试。已有大量研究描述了测定大鼠、绵羊、狗和兔等动物模型肌腱生物力学性能的方法10,11,12。然而，针对小鼠肌腱生物力学性能的研究较少，主要原因是小鼠组织体积小，难以在拉伸测试中有效夹持。由于小鼠模型在肌腱病机制研究中具有诸多优势，包括可进行基因操作、试剂选择广泛以及成本低廉，因此亟需建立准确且高效的小鼠组织生物力学测试方法。
为了准确测试肌腱的力学性能，必须有效夹持组织，避免在夹持界面发生滑脱或人为撕裂，以及生长板断裂。在许多情况下，尤其是对于较短的肌腱，一端夹持骨骼，另一端夹持肌腱。通常通过将骨骼包埋在环氧树脂13或聚甲基丙烯酸甲酯14,15等材料中来固定骨骼。肌腱通常被夹在两层砂纸之间，用氰基丙烯酸酯胶水粘合，并使用压缩夹具固定（若横截面较扁平）或在冷冻介质中固定（若横截面较大）15,16,17。这些方法已被用于小鼠肌腱的生物力学测试，但由于样本尺寸微小以及生长板具有持续的弹性且永不骨化18，实际操作中仍存在挑战。例如，小鼠肱骨头的直径仅有几毫米，使得骨骼夹持极为困难。具体而言，小鼠冈上肌肌腱-骨样本的拉伸测试常常导致生长板处发生断裂，而非肌腱本身或肌腱止点处断裂。同样，跟腱的生物力学测试也具有挑战性。尽管小鼠跟腱比其他小鼠肌腱更大，但跟骨较小，使得该骨骼的夹持困难。可选择去除骨骼后直接夹持两端肌腱；然而，这种方法无法测试肌腱与骨连接处的力学性能。其他研究团队报道了使用定制夹具夹持跟骨19,20、通过夹钳锚定21、包埋于自固化塑料骨水泥中22或采用锥形槽结构22等方法，但这些已有方法仍受限于重复性差、夹持失败率高以及制备过程繁琐等问题。
本研究的目的是建立一种准确且高效的实验方法，用于小鼠肌腱的拉伸生物力学测试，以冈上肌腱和跟腱为例进行说明。通过结合源自天然骨解剖结构的三维重建、实体建模和增材制造技术，开发出一种新型的骨端夹持方法。这些夹具可有效固定骨骼，防止骨骺生长板损伤，缩短样本制备时间，并提高测试的可重复性。该新方法可轻松适用于其他小鼠肌腱，以及大鼠和其他动物肌腱的测试。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>费希尔科技</td><td>BP160-100</td><td>将1g琼脂糖溶解于100 ml超纯水中，配制成1%琼脂糖溶液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bruker microCT&amp;nbsp;</td><td>Bruker BioSpin Corp</td><td>Skyscan 1272&amp;nbsp;</td><td>作者使用</td></tr><tr><td>ElectroForce&amp;nbsp;</td><td>TA Instruments</td><td>3200</td><td>测试平台</td></tr><tr><td>乙醇 200 证明</td><td>费希尔科技</td><td>A4094</td><td>稀释至70%，并按方案建议使用</td></tr><tr><td>用于连接夹具的固定装置</td><td>定制</td><td></td><td>作者使用</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>金佰利公司</td><td>&amp;nbsp;S-8115</td><td>按方案建议使用</td></tr><tr><td>MicroCT CT-Analyser (Ctan)</td><td>Bruker BioSpin Corp</td><td></td><td>作者用于可视化和分析微计算机断层扫描图像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MilliQ水（超纯水）</td><td>默克生命科学</td><td>QGARD00R1（或相关纯化系统）</td><td>100 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Meshmixer</td><td>欧特克公司</td><td>http://www.meshmixer.com/</td><td>作者使用的免费工程软件，用于优化网格</td></tr><tr><td>Objet EDEN 260VS&amp;nbsp;</td><td>Stratasys LTD</td><td></td><td>精密原型制作</td></tr><tr><td>Objet Studio</td><td>Stratasys LTD</td><td></td><td>作者与3D打印机配合使用</td></tr><tr><td>PBS - 磷酸盐缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10010031</td><td>2.5 L 的10% PBS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>S&amp;T 镊子</td><td>精细科学工具公司</td><td>00108-11</td><td>作者使用</td></tr><tr><td>手术刀片 - #11</td><td>精细科学工具公司</td><td>10011-00</td><td>作者使用</td></tr><tr><td>手术刀柄 - #3</td><td>精细科学工具公司</td><td>10003-12</td><td>作者使用</td></tr><tr><td>SkyScan 1272</td><td>Bruker BioSpin Corp</td><td></td><td>作者用于可视化和分析微计算机断层扫描图像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Skyscan CT-Vox</td><td>Bruker BioSpin Corp</td><td></td><td>作者用于可视化和分析微计算机断层扫描图像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SkyScan NRecon</td><td>Bruker BioSpin Corp</td><td></td><td>作者用于可视化和分析微计算机断层扫描图像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SolidWorks CAD</td><td>Dassault Syst&amp;egrave;mes</td><td>SolidWorks 研究订阅版</td><td>作者使用的实体建模计算机辅助设计软件</td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>乐泰</td><td>234790</td><td>按方案建议使用</td></tr><tr><td>测试浴槽</td><td>定制</td><td></td><td>作者使用</td></tr><tr><td>薄膜夹具&amp;nbsp;</td><td>定制</td><td></td><td>作者使用</td></tr><tr><td>VeroWhitePlus</td><td>Stratasys LTD</td><td>NA</td><td>作者使用的3D打印材料</td></tr><tr><td>WinTest&amp;nbsp;</td><td>WinTest 软件</td><td></td><td>作者用于数据采集</td></tr></tbody></table>

小鼠肌腱的生物力学测试

Biomechanical Testing of Murine Tendons

肌腱疾病十分常见，可影响各个年龄段的人群，且常导致严重功能障碍。常规治疗方法（如抗炎药物、康复治疗和手术修复）往往效果不佳。为了明确肌腱功能并验证新疗法的有效性，必须准确测定动物模型中肌腱的力学特性。目前，小鼠动物模型已广泛用于研究肌腱疾病及评估新的肌腱病治疗方法；然而，测定小鼠肌腱力学特性的过程仍存在挑战。本研究开发了一种新的肌腱力学测试系统，该系统包含3D打印的夹具，可分别精确匹配肱骨和跟骨的解剖结构，用于对冈上肌腱和跟腱进行力学测试。这些夹具基于天然骨骼解剖结构的3D重建、实体建模和增材制造技术而设计。新方法消除了人为夹持失效现象（例如在生长板处断裂而非肌腱本身断裂），缩短了整体测试时间，并提高了实验的可重复性。此外，该新方法可便捷地适用于其他小鼠肌腱以及其他动物肌腱的测试。

采用3D打印夹具对8周龄小鼠的冈上肌腱和跟腱进行力学测试。所有经过机械测试的样本均在止点处发生断裂，这一结果通过显微CT扫描、肉眼观察以及拉伸试验后的视频分析得以确认。图3展示了本实验室此前与当前用于冈上肌腱测试方法的一一对应比较。在先前的方法28,29,30中，将肱骨嵌入环氧树脂中，并在肱骨头上方放置一个回形针，以期防止骨骺板骨折。环氧树脂完全固化需要4–6小时（图3），因此在典型的一天内仅能完成6–8个样本的测试。该方法的另一局限性在于，回形针放置效果依赖操作者技术，从而影响对骨骺板骨折的防护。使用这些早期方法所得测试结果变异程度较高，大多数参数的变异系数高达约30%，且骨骺板断裂的发生率约为10%–20%。如图3所总结，采用新方法后，样本制备时间缩短至5–10分钟，使得...

本方案描述了利用定制的3D打印夹具对小鼠肌腱进行高效且可重复的拉伸生物力学测试方法。

肌腱疾病很常见，可影响各个年龄段的人群，且常导致严重功能障碍。标准治疗方法包括抗炎药物、康复治疗……

本方案描述了一种通过可重复使用的定制3D打印夹具对小鼠肌腱进行生物力学测试的高效且可重复的方法。新方法将测试样本所需时间从数小时缩短至数分钟，并消除了以往方法中常见的主要夹持伪影。该方法不仅限于冈上肌腱和跟腱。该方法可轻松适用于测试其他小鼠肌腱以及来自较大型动物的肌腱。为确保该方法的可重复性和高效性，对于本文未描述的夹具，可能需要进行多轮设计原型构建与验证。首先，对琼脂糖凝胶中的完整骨骼进行显微计算机断层扫描。重建为横截面图像后，选择“文件”菜单中的“打开”命令以打开文件数据集。打开“首选项”对话框并选择“高级”选项卡。使用自适应渲染算法构建三维模型，以获得更平滑的表面细节。使用 10 作为局部性参数，该参数定义用于寻找物体边界的相邻像素点之间的距离。将容差最小化至 0.1 以减小文件大小。为指定感兴趣体积（VOI），手动选择两张图像作为所选 VOI 范围的顶部和底部，然后转到第二页“感兴趣区域”。在单个横截面图像上手动选择感兴趣区域。每隔 10 到 15 个横截面图像重复选择一次感兴趣区域。接下来，进入第三页“Binary Selection”（二值选择）。在“直方图”菜单中，单击“来自数据集”以显示该数据集中所有图像亮度的直方图分布。同样在“直方图”菜单中，单击“创建 3D 模型文件”菜单。将骨组织的 3D 模型保存为 STL 文件格式。在 Meshmixer 软件中，导入网格并选择“全部”以进行编辑。从工具集编辑中选择“生成”，然后从目标缩减工具集中选择“三角形预算”。减少三角形数量并接受更改。通过选择“另存为”将新简化后的文件以STL格式重新保存。为设计冈上肌腱肱骨模型，使用实体建模的计算机辅助设计程序创建与肱骨匹配的夹具定制模型。在实体建模程序中打开肱骨的STL格式文件，并将其另存为SLDPRT格式的零件文件。然后打开该零件文件，手动创建三个具有解剖学意义的平面，例如矢状面、冠状面和横断面。单击“文件”菜单中的“新建”以创建实体块组件。再次单击“文件”菜单中的“新建”以创建包含两个组件的装配模型，这两个组件分别为实体块和右侧或左侧的肱骨。定义骨骼在实体块中的方向，确保肌腱与骨骼之间的夹角为180度。确保整个骨组织体积位于块内。在装配窗口中，选择该块，然后单击装配工具栏中的“编辑组件”。依次单击“插入”、“特征”、“型腔”。选择“统一缩放”，并输入 0% 作为在所有方向上缩放的数值。抑制骨骼部件，并将装配体保存为部件。打开带空腔的圆柱部件。绘制草图，确保仅在肱骨头上方保留0.5毫米。从“特征”中选择“拉伸切除”。沿矢状面切割装配体，以生成两个对称的部件，分别与骨骼的前侧和后侧贴合。沿矢状面切割装配部件，以制成两个分别适配骨骼前侧与后侧的对称组件。必须确保肱骨头部分，以防止生长板失效，并设计紧密的间隙，避免在测试过程中肱骨从模型中脱出。按照文稿中所述步骤完成后侧组件和前侧组件的制作。将两个组件分别保存为独立的零件文件。然后按“插入图案”、“镜像”，并选择“镜像”以针对对侧肢体的夹具每个组件创建3D镜像模型。选择前表面作为镜像平面。选择要镜像的主体部分。选择镜像平面，并创建包含所有材料的草图。在“特征”中选择“拉伸切除”，以移除原始部分，仅保留镜像后的部分。单击部件底部，并将其用作平面以创建草图。点击“草图文本”并添加 L 或 R。这将在夹具底部刻上标记，以区分左侧和右侧。将所有夹具部件保存为 STL 标准文件格式，以备 3D 打印使用。为了分离冈上肌肌腱和肱骨标本，首先将已处死的小鼠置于俯卧位，从前肢肘部上方沿肩部方向在皮肤上做一切口。使用镊子通过钝性解剖仔细去除皮肤，使肩部肌肉组织暴露可见。去除肱骨周围的组织，直至暴露骨骼。 用镊子夹住肱骨，小心去除三角肌和斜方肌，以暴露喙肩弓。辨认肩锁关节，用手术刀片小心地将锁骨与肩峰分离。注意不要损伤冈上肌腱及其骨性附着点，使用手术刀片将肌肉从其肩胛骨附着处剥离。将肱骨头从关节盂分离，并切开关节囊以及冈下肌、肩胛下肌和小圆肌的肌腱。解离肘关节，使肱骨与尺骨、桡骨分离。分离出肱骨-冈上肌腱肌肉标本，并清除肱骨及肱骨头上的多余软组织。为了分离跟腱，需先将已处死的小鼠置于俯卧位，并定位跟骨。注意不要损伤跟腱及其在骨骼上的附着点，用钝性解剖方法去除皮肤，暴露踝关节和膝关节周围的肌肉组织。使用手术刀片，从跟腱与跟骨的附着处开始，小心地将腓肠肌从其近端附着点分离。小心地将跟骨与周围相邻的骨骼分离，分离出跟腱-跟骨标本，并清除多余的软组织。为测定肌腱的横截面积，将骨骼倒置插入充满琼脂糖凝胶的冷冻管中，使骨骼位于琼脂糖凝胶内，而肌腱和肌肉部分露在凝胶外。使用显微计算机断层扫描（microcomputed tomography）完成后，用手术刀片轻轻将肌肉从肌腱上剥离。将骨骼插入3D打印的夹具中，并将其固定在测试网格上。将肌腱插入折叠的薄层滤纸之间，用薄膜夹具夹紧并粘合。将样品和夹具放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的测试浴中，在37摄氏度条件下进行力学测试。本研究中，采用可重复使用的3D打印夹具夹持骨骼，使试样制备时间从数小时缩短至数分钟。使用当前方法对冈上肌腱进行拉伸测试时，获得的典型载荷-变形曲线消除了生长板断裂等主要夹持伪影。基于非配对t检验（P值小于0.05），冈上肌腱和跟腱的力学性能显示出性别间的显著差异。显微CT成功测量了冈上肌腱沿跟腱长度方向的横截面积。需要注意的是，每个解剖部位都有实现有效夹持所必需的特定设计标准。因此，每个夹具的设计应相应地进行调整。除了进行直至断裂的拉伸测试外，这些夹具还可用于循环加载测试，以获取有关肌腱疲劳特性和黏弹性特性的信息。由于多种原因，文献中对小鼠肌腱力学性能的表征并不常见，这些原因包括难以夹持这些微小组织、费力且耗时的样本制备方法以及生长板骨折等问题。本方案提供了一种高效且可重复的小鼠肌腱测试方法，可有效消除因夹持导致的人为失效，并将每日可测试的样本数量提高至原来的三倍。

Research

科研

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本文介绍了一种可用于肌腱修复的“Q”缝合技术，并探讨其对修复后肌腱间隙形成和抗张强度的影响。研究表明，Q缝合技术能够有效增强肌腱的抗张能力和修复强度。...

使用Q缝线增强修复指屈肌腱抵抗间隙形成和抗张强度的能力

本文介绍了一种用于测量肌腱离体组织内局部二维组织应变的开源数字图像相关算法。该技术的准确性已通过多种方法得到验证，并可供公众使用。...

测量肌腱中的局部组织应变 通过 开源数字图像相关法

我们介绍一种定制的实验平台和组织培养方案，该方案可重现由跟腱止点撞击引起的纤维软骨变性，同时在小鼠后肢离体组织中维持细胞长期存活，为探索腱组织撞击的力学生物学机制提供了一个合适的模型。...

用于研究跟腱撞击力学生物学的小鼠后肢离体模型

本方案介绍了一种用于在大鼠跟腱中诱导可量化且可控的疲劳性损伤的测试系统，以建立一种由过度使用引起的跟腱病的体内模型。该操作包括将大鼠踝关节固定于一个关节驱动装置上，通过自行编写的MATLAB脚本控制装置对踝关节进行被动背屈运动。...

一种用于过劳诱导肌腱病体内模型的被动踝关节背屈测试系统

本文介绍了一种类组装体模型系统，用于模拟承重肌腱核心组织与含有在疾病和损伤中被激活的细胞群体的外部区室之间的肌腱细胞间相互作用。作为一个重要的应用实例，我们展示了如何利用该系统探究与疾病相关的外部内皮细胞的激活过程。...

构建肌腱类组装体以研究疾病与修复中的细胞间串扰

本文概述了一种通过细胞自组装构建细胞来源组织环的多功能方法。将平滑肌细胞接种至环形琼脂糖孔中，细胞可在7天内聚集并收缩，形成坚固的三维（3D）组织。毫米尺度的组织环适用于力学测试，并可作为组织组装的基本单元。...

定向细胞自组装构建细胞来源组织环用于生物力学分析与组织工程

学习使用定制3D打印夹具对小鼠肌腱进行高效可重复的拉伸生物力学测试方法。该技术将测试时间从数小时缩短至数分钟，并消除了传统方法中常见的夹持伪影，适用于多种肌腱类型。

小鼠肌腱的生物力学测试

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