共培养体系中M1型巨噬细胞与4T1小鼠乳腺癌细胞吞噬活性的延时二维成像

本研究的总体目标是获得共培养体系中M1型巨噬细胞对4T1小鼠乳腺癌细胞吞噬活性的延时二维成像。通过荧光显微镜与微分干涉差显微镜相结合的方法，建立并观察活细胞共培养模型。利用成像软件对多点延时视频进行叠加处理，以评估巨噬细胞的吞噬活性，随后进行孵育实验。

本研究旨在探讨巨噬细胞与癌细胞相互作用过程中，巨噬细胞行为及其吞噬活性的调控机制，特别是针对小鼠乳腺癌的研究。本研究的第一部分始于4T1小鼠乳腺癌细胞与RAW 264.7小鼠巨噬细胞的活细胞共培养模型。

实验开始时，培养41株小鼠乳腺癌细胞和RAW 2647小鼠巨噬细胞。首先，解冻一管4T1细胞和RAW 2647细胞。将解冻后的细胞稀释于10毫米的15毫升锥形管中。

接下来，以660 g离心力离心5分钟，获得细胞沉淀。小心吸除培养基，将细胞重悬于8 mL完全培养基中，并将细胞转移至组织培养瓶中。在37°C、5%二氧化碳条件下培养细胞。

在贴壁条件下培养一周后，每天观察培养瓶，并根据需要补充atmil完全培养基。下一步继续进行M1极化的RAW 2647巨噬细胞的免疫染色。此步骤旨在确保M1巨噬细胞完全极化。

当 RAW 264.7 细胞融合度达到 70% 至 80% 时，弃去培养基，并用 PBS 轻轻冲洗两次。用细胞刮轻轻刮下贴壁细胞，将细胞收集至 50 mL 圆锥形离心管中，以制备巨噬细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并通过向已设定的密度中加入剩余溶液，制备每皿 100,000 个细胞的细胞悬液。

将2毫升巨噬细胞悬液分别加入两个成像培养皿中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育细胞2至3小时，以促进细胞贴壁。通过在含有10%胎牛血清的完全培养基中添加100纳克/毫升脂多糖（LPS）和20纳克/毫升干扰素-γ，制备M1极化培养基。

弃去孵育前的巨噬细胞培养上清液，用 PBS 小心地将培养皿中的单层细胞洗涤两次。向其中一个配对的培养皿中加入 2 毫升 M1 极化培养基，使硬脑膜细胞极化为 M1 巨噬细胞表型。免疫染色前，使用 2 毫升 4% 多聚甲醛固定 RAW 细胞和 M1 巨噬细胞，在室温下孵育 50 分钟。

吸除上清液，用 PBS 洗涤细胞单层，至少三次。加入 2 mL 含 50 mmol/L 氯化铵的 PBS 溶液淬灭，在室温下孵育 50 分钟。用含 0.3% Triton X-100 的 PBS 溶液在室温下透化处理 50 分钟。

在室温下，使用含10% FBS的PBS封闭30分钟。加入含1% FBS的PBS中稀释的FITC标记抗iNOS抗体，4°C避光孵育过夜。将1 mL DAPI加入成像培养皿中，37°C避光孵育10分钟，可用铝箔覆盖以避光。

使用 PBS 至少洗涤细胞 3 次，并向对应的培养皿中加入 1 毫升 DMEM，准备进行荧光成像。下一步进行 4T1 小鼠乳腺癌细胞的接种。当 4T1 细胞融合度达到 70% 至 80% 时，弃去培养基，并用 PBS 轻柔冲洗两次。

加入1 mL预热的胰蛋白酶以解离细胞，并在37°C下孵育最多20分钟。当细胞出现脱落时，将脱落的细胞转移至15 mL锥形管中，再加入2 mL预热的完全培养基以灭活胰蛋白酶。

在600 ×g 力量下离心5分钟以获得细胞沉淀。弃去上清液，并将沉淀重悬于10毫升级预运行取样DMEM培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将100,000个细胞接种至毫升级DMEM培养基中。

使用TC处理后进行成像。下一步是利用CFSE染色对活体4T1小鼠乳腺癌细胞进行标记。首先，从之前接种了4T1细胞的成像培养皿中移除现有的培养基。

通过将CFSE染色液用1 mL PBS稀释，配制5 µM的工作浓度染色溶液。向成像培养皿中加入1 mL CFSE染色溶液，在室温或37°C避光条件下孵育细胞20分钟。向细胞和染色溶液中加入等体积的DMEM，并继续孵育5分钟。

下一步是接种 RAW2647 小鼠巨噬细胞并与 4T1 细胞共培养。在对 4T1 细胞进行 CFSE 标记后，用 PBS 洗涤成像培养皿两次。将 2 毫升巨噬细胞悬液接种至含有 4T1 细胞的成像培养皿中。

下一步是将 RAW 264.7 巨噬细胞极化为 M1 表型。向培养皿中加入 2 毫升 M1 极化培养基，使 RAW 细胞分化为 M1 巨噬细胞表型。研究的第二部分是通过延时成像评估 M1 巨噬细胞对 4T1 细胞的吞噬作用。

下一步包括活细胞视频显微镜吞噬作用评估。首先，打开显微镜。将温度设置为37摄氏度。

以及5%的二氧化碳气体。将共培养细胞置于载物台中央，并轻轻拧上顶部腔室。通过操纵杆选择不同的位置，以电动方式移动载物台并捕获图像。

进行活细胞成像时需要考虑多种因素。为了获得高质量的小型视频，必须优化成像曝光时间、时间间隔测量，并实现焦点校正的自动化。

如果视频曝光过度、时间间隔不正确或对焦不准，将导致视频无法使用。一旦发现上述任一情况，均需重复实验。图一显示了用抗iNOS抗体标记的绿色免疫荧光图像。

蓝色为细胞核标记物 DAPI。以及大部分图像的增强版本。视频 1 是展示 M1 巨噬细胞与 4T1 细胞相互作用的代表性活细胞视频。

使用荧光和IC显微镜多通道采集捕获的CFSE染色小鼠乳腺癌细胞共培养图像。视频2为单个共培养培养皿中多点拍摄的活细胞视频显微镜影像，显示诱导型M1巨噬细胞对4T1细胞的吞噬作用。

每隔50分钟采集一次图像，持续13小时。视频3为活细胞视频显微镜录像，展示了一个选定的单坐标点，以深入可视化M1型巨噬细胞对4T1细胞的吞噬作用。红色箭头指示M1型巨噬细胞，黄色圆圈显示部分4T1细胞荧光淬灭并脱离4T1细胞群。

M1 巨噬细胞的运动方式表现为胞质呈伪足状，而 4T1 小鼠记忆性癌细胞则具有上皮样形态。可见巨噬细胞向 4T1 细胞移动，形成细胞间接触，随后 M1 巨噬细胞吞噬 4T1 细胞。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用 4T1 小鼠乳腺癌细胞和 RAW 264.7 巨噬细胞进行活细胞视频显微镜实验；您还应能够建立两种细胞类型的过夜共培养体系，以开展吞噬作用实验。此外，您还应理解 4T1 细胞与经 LPS 和干扰素-γ 激活的巨噬细胞共培养的操作方法。