M1巨噬细胞-4T1小鼠乳腺癌细胞在共培养中噬菌体活性的时移2D成像

本研究的总体目标是获得M1巨噬细胞4T1小鼠乳腺癌细胞中吞咽活性的延时2D成像。利用荧光和差分干扰对比显微镜的组合建立和观察生命细胞共培养模型。巨噬细胞对噬菌体活动的评价是图像;在孵育前，利用成像软件将多点时间推移视频翻倍。

我们进行的问题，即将满足在巨噬细胞的行为及其吞噬活动与癌细胞的磨练的需要和好处。具体来说，在研究中是小鼠乳腺癌。本研究的第一部分从4T1小鼠乳腺癌细胞和RARA2647小鼠巨噬细胞的活细胞共培养模型开始。

通过培养41个小鼠乳腺癌细胞和RARA2647小鼠巨噬细胞开始实验。首先，解冻一小瓶4T1和RAL2647细胞。在15磨锥形管中将解冻的细胞稀释10毫米。

接下来，以660克力离心细胞5分钟，获得细胞颗粒。小心吸气介质，在 8 磨完整介质中重新悬浮细胞，将细胞转移到组织培养瓶中。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞。

经过一周的栽培，每天监测烧瓶，并根据需要补充完整的介质。下一步继续M1极化RARA2647巨噬细胞的免疫污染。此步骤是确保 M1 巨噬细胞完全极化。

由于 RAW 2647 的汇合已达到 70% 到 80%，因此丢弃培养介质并用 PBS 轻轻冲洗两次。准备巨噬细胞收集，用细胞刮刀轻轻分离粘附细胞，并转移到50磨锥形管。使用血细胞计对细胞进行计数，通过将剩余的溶液添加到坐姿密度中，准备每盘10万个细胞的悬浮细胞。

将 2 磨的巨噬细胞悬浮液放入两个成像盘中。在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育细胞2至3小时，使细胞保持粘附。通过将每磨 LPS 添加 100 尼利格拉姆和每磨干扰素伽马 20 尼利格拉姆，准备 M1 极化介质，并辅以 10% FBS 的完整介质。

丢弃在巨噬细胞中孵育的培养物，并使用 PBS 小心地清洗盘中的单层。将 2 磨的 M1 极化介质添加到匹配菜中，让 dura 细胞注入 M1 巨噬细胞芬娜型。在免疫之前，使用2磨4%的半成醛修复RAU和M1巨噬细胞，并在室温下孵育50分钟。

拆下上一液，使用PBS清洗细胞单层，至少三次。在PBS中用2磨50毫米氯化铵进行淬火，在室温下孵育50分钟。在PBS中使用0.3%Triton X-100进行渗透，在室温下50分钟。

在 PBS 室温度下使用 10% FBS 进行 30 分钟的阻塞步进。在PBS中与抗 iNOS 抗体结合 FITC 孵育，在 4 摄氏度下过夜孵育 1% FBS。在37摄氏度的黑暗条件下，用铝箔覆盖，将1磨DAPI孵育成成像盘10分钟。

使用 PBS 清洗细胞至少 3 次，并将 1 磨 DMEM 添加到匹配盘中，并准备好进行荧光成像。下一步进行4T1小鼠乳腺癌细胞的种子。当 4T1 细胞的汇合达到 70% 到 80% 时，丢弃培养基，并用 PBS 温和冲洗两次。

加入1磨预热的三辛，使细胞去联，并在37摄氏度下孵育长达20分钟。一旦细胞出现脱连接，将去连接的细胞转移到15磨锥形管上。并添加2磨预热完整介质，以灭活管子看到。

以 600 g 力离心 5 分钟，获得细胞颗粒。在 10 磨前运行采样 DMEM 介质中去除上重颗粒并重新悬浮颗粒。使用血细胞计计算细胞数值，将10万个细胞种子放入磨削 DMEM 中。

进入成像这些与TC治疗。下一步是使用CFSE染色标记活的4T1小鼠乳腺癌细胞。首先，从以前用4T1细胞播种的成像盘中去除现有介质。

通过稀释 1 磨 PBS 中的 CFSE 染色液来准备 CFSE 染色溶液，使 5 个 macrmal 工作同意。将 1 磨 CFSE 染色溶液加入成像培养皿中，在室温下孵育细胞 20 分钟，或在黑暗中 37 摄氏度。向细胞添加等值的DMEM加染色溶液，并允许播种5分钟。

下一步是播种RA RAW2647小鼠巨噬细胞，并与4T1共同培养。4T1细胞CFSE水平后，使用PBS清洗成像盘两次。种子 2 磨巨噬细胞悬浮成 4T1 成像盘。

下一步是将RARA 4627巨噬细胞极化成M1芬娜型。将 2 磨的 M1 极化介质添加到想象盘中，让 RAW 细胞注入 M1 巨噬细胞的芬娜型中。研究的第二部分是M1巨噬细胞噬细胞的延时评估。

下一步包括活细胞显微吞噬细胞病评估。首先，打开显微镜。将温度设定在 37 摄氏度。

还有5%的二氧化碳气体将共培养细胞放在舞台中央，轻轻拧在顶室上。使用操纵手柄通过选择要捕获的不同位置来驱动舞台。

在进行活细胞成像时需要考虑许多因素。获取一个很小的视频。它需要优化成像曝光、时间测量和自动化对焦校正。

如果视频曝光过度、时间间隔不正确以及焦点不对，则视频将无法使用。如果检测到其中一个因素，则需要重复实验。图一显示了免疫荧光在绿色中与抗 iNOS 一起转动。

蓝色核标记 DAPI 。和大多数图像的增强版本。电影 1 是理解 M1 巨噬细胞和 4T1 的代表性活细胞电影。

CFSE染色大多数乳腺癌细胞共同培养捕获使用多通道采集荧光和IC显微镜。电影 2 活细胞视频显微镜电影从多点在一个单一的夫妻菜。通过诱导M1巨噬细胞显示4T1的噬菌体。

图像以 50 分钟间隔捕获，间隔 13 小时。电影 3 活细胞视频显微镜电影，选择单个坐标点，以显示 M1 巨噬细胞对 4T1 的噬菌体进行深度可视化。红色箭头显示M1巨噬细胞，黄色圆圈显示一些4T1细胞淬火氟烯和4T1细胞的戈夫曼。

M1巨噬细胞移动学描述为波球质质是4T1小鼠记忆癌有上皮形态。巨噬细胞可以看见移动添加4T1细胞以建立细胞对细胞的接触。然后是每个M1巨噬细胞的4T1细胞的吸收。

看完这段视频后，你应该对如何进行活细胞视频显微镜实验有一个很好的理解;用4T1小鼠乳癌和RA RAW 2647 merad巨噬细胞。你也应该能够设置两种细胞类型的夜间联合培养， 以执行吞噬论文。您还应了解 4T1 与 LPS 和干扰素伽马巨噬细胞的共培养者。