Name: M1巨噬细胞-4T1小鼠乳腺癌细胞在共培养中噬菌体活性的时移2D成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 了解M1巨噬细胞对4T1小鼠乳腺癌细胞的吞噬活性，使用活细胞共培养模型结合荧光显微镜和微分干涉相差显微镜进行实时成像。该方法有助于研究肿瘤微环境中巨噬细胞的动态行为。

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本研究由马来西亚博特拉大学（Universiti Putra Malaysia）Geran Putra Berimpak（GBP）项目资助：9542800。我们感谢马来西亚农业生物技术研究所（Agro-Biotechnology Institute, Malaysia, ABI）的实验室及显微成像设施提供的支持。特别感谢 Mohd Daniel Hazim 在本研究实验视频的编辑与录制过程中提供的帮助。

注意：第1−6节描述了4T1小鼠乳腺癌细胞与RAW 264.7小鼠巨噬细胞的共培养模型。第7节描述了M1型巨噬细胞吞噬4T1细胞的延时评估。
1. 培养4T1小鼠乳腺癌细胞和RAW 264.7小鼠巨噬细胞
<ol>
	<li>将一管冷冻保存的第6代4T1和RAW 264.7细胞置于37 °C或细胞系正常生长温度的水浴中轻轻振荡，使其解冻。 
	注意：解冻过程应迅速，约在2分钟内完成。为避免污染，将冻存管从水浴中取出后，用70%乙醇喷洒进行去污处理。为避免基因漂移，尤其是巨噬细胞，应使用较低的传代次数（即小于20代）。</li>
	<li>将解冻后的细胞加入15 mL锥形离心管中，用10 mL完全DMEM培养基稀释，然后在600 × g 条件下离心5分钟，以获得细胞沉淀。 
	注意：本实验方案全程使用含10%（v/v）胎牛血清（FBS）、200 U/mL青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的完全DMEM培养基。</li>
	<li>小心吸除上清液，将细胞沉淀用8 mL完全培养基重悬，并转移至25 cm2组织培养处理过的培养瓶中。将4T1和RAW 264.7细胞均在37 °C、5% CO2条件下，用完全DMEM培养基进行培养。 
	注意：应轻柔地重悬细胞沉淀，并将细胞悬液逐滴加入培养瓶中，以避免细胞死亡。</li>
	<li>培养1周以使细胞充分贴壁后，每日观察培养瓶情况，并根据需要添加8 mL完全DMEM培养基。</li>
</ol>
2. M1 极化的 RAW 264.7 巨噬细胞免疫染色
<ol>
	<li>当 RAW 264.7 细胞融合度达到 70−80% 时，弃去培养基，并用至少 2 mL 的 PBS 轻柔冲洗 2 次。 
	注意：在接种 RAW 264.7 细胞前，确保未发生细胞分化（即出现树突样表型和/或细胞体积增大）。若观察到细胞形态改变，应弃去该培养物，并从早期传代冻存管中复苏新的细胞系。</li>
	<li>使用细胞刮轻轻刮下贴壁细胞，将细胞悬液转移至 15 mL 圆底离心管中，以制备巨噬细胞用于后续收集。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，并用完全 DMEM 培养基制备浓度为 1 × 105 个细胞/皿的细胞悬液。</li>
	<li>将 2 mL 巨噬细胞悬液接种至两个成像培养皿中。于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2−3 小时，以促进细胞贴壁。</li>
	<li>通过向完全 DMEM 培养基中添加 100 ng/mL LPS 和 20 ng/mL IFN-γ，制备 M1 极化培养基10,11。</li>
	<li>弃去巨噬细胞的培养上清液，并用至少 1 mL 的 PBS 小心洗涤培养皿中的单层细胞 2 次。</li>
	<li>向其中一个成像培养皿中加入 2 mL M1 极化培养基，诱导 RAW 264.7 细胞转化为 M1 巨噬细胞表型，并于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2–3 小时。 
	注意：将 RAW 264.7 巨噬细胞接种于补充有 10% FBS 的 DMEM 培养基的成像培养皿中，作为抗 iNOS 抗体染色的对照组。分别标记成像培养皿为 RAW（对照组）和 M1 巨噬细胞（经 LPS 和 IFN-γ 极化）。</li>
	<li>免疫染色前，使用 2 mL 4% 多聚甲醛固定 RAW 264.7 细胞和 M1 巨噬细胞，在 37 °C（室温，RT）条件下孵育 15 分钟。</li>
	<li>移除上清液，并用 1 mL PBS 至少洗涤细胞单层 3 次。</li>
	<li>加入含 50 mM 氯化铵的 PBS 溶液 2 mL 进行淬灭，在室温下孵育 15 分钟。</li>
	<li>使用含 0.3% Triton X-100 的 PBS 溶液 2 mL 在室温下透化 15 分钟。</li>
	<li>移除上清液，并用 1 mL PBS 至少洗涤细胞单层 3 次。</li>
	<li>使用含 10% FBS 的 PBS 溶液 2 mL 在室温下封闭 30 分钟。 
	注意：免疫染色中的封闭步骤旨在最大程度减少抗体在细胞内的非特异性结合。</li>
	<li>移除上清液，并用 1 mL PBS 至少洗涤细胞单层 3 次。</li>
	<li>加入含抗 iNOS-FITC 抗体和 1% FBS 的 PBS 溶液 2 mL，在 4 °C 条件下避光孵育过夜。 
	注意：根据生产商推荐的稀释比例使用合适的抗体。从此时起，用铝箔覆盖培养皿以避光保护。</li>
	<li>移除上清液，并用 1 mL PBS 至少洗涤细胞单层 3 次。</li>
	<li>向成像培养皿中加入 1 mL 300 nM 的 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液，在 37 °C 黑暗条件下孵育 10 分钟（用铝箔覆盖避光）。</li>
	<li>用 1 mL PBS 洗涤细胞至少 3 次，并向成像培养皿中加入 1 mL 完全 DMEM 培养基。 
	注意：细胞现已准备好进行荧光成像。显微镜需配备倒置平台以及适用于所选染料（本实验中为 FITC 和 DAPI）的激发滤光片。</li>
	<li>开启显微镜并加载成像软件。将成像培养皿置于显微镜载物台上，调节焦距以观察 RAW 264.7 细胞和 M1 巨噬细胞。通过调节透射光强度和曝光时间，优化相差、FITC 和 DAPI 图像的显示效果。 
	注意：当所有观察点均清晰对焦且各通道参数已优化后，开始成像。</li>
	<li>采集相差、FITC 和 DAPI 图像（图 1）。</li>
</ol>
3. 接种4T1小鼠乳腺癌细胞
<ol>
	<li>当4T1细胞融合度达到70−80%时，弃去培养基，用至少2 mL PBS轻柔冲洗2次。加入1 mL预热的胰蛋白酶以解离细胞，并在37 °C下孵育最多20分钟。 
	注意：在显微镜下观察细胞。脱离的细胞将呈圆形。</li>
	<li>细胞脱落后，将其转移至15 mL锥形管中，并加入2 mL预热的完全DMEM培养基以灭活胰蛋白酶。通过移液枪轻柔吹打细胞层表面，使细胞充分分散并回收。随后在600 × g 条件下离心5分钟，获得细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL预热的完全DMEM培养基中。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，并在两个经组织培养处理的35 mm玻璃底成像培养皿中，每皿接种1 × 105 个4T1细胞，加入2 mL完全DMEM培养基。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。 
	注意：在一个成像培养皿中使用M1极化培养基培养4T1细胞，并标记为4T1-Inducer（对照组）。此步骤旨在确保4T1细胞在接触诱导剂时能正常生长。</li>
</ol>
4. 使用CFSE染色法标记活体4T1小鼠乳腺癌细胞
<ol>
	<li>首先，从 4T1 细胞成像培养皿中移除现有培养基。用 1 mL PBS 至少清洗细胞单层 2 次。</li>
	<li>将 CFSE 用 1 mL PBS 稀释，配制 5 µM 的 CFSE 染色液。向每个成像培养皿中加入 1 mL 5 µM CFSE 染色液，并在室温或 37 °C 避光孵育 20 分钟。 
	注意：根据制造商的建议和预实验结果，使用适当的 CFSE 工作浓度，以获得最佳染色效果。若将 CFSE 用 PBS 稀释，标记效率会更高。</li>
	<li>向细胞中加入等体积含 10% FBS 的完全 DMEM 培养基与染色液，以终止染色反应，并在室温避光孵育 5 分钟。</li>
	<li>弃去含 CFSE 的溶液，并用等体积的培养基清洗细胞 1 次。 
	注意：4T1 细胞现已完成荧光标记。</li>
	<li>将 4T1-CFSE 标记的细胞放回标准培养条件（室温，5% CO2）下继续培养。</li>
</ol>
5. 接种 RAW 264.7 小鼠巨噬细胞并与 4T1 共培养
<ol>
	<li>当 RAW 264.7 细胞融合度达到 70−80% 时，弃去培养基，并用至少 2 mL 的 PBS 轻轻冲洗 2 次。</li>
	<li>使用细胞刮轻轻刮下贴壁细胞，使巨噬细胞脱离，收集至 15 mL 锥形管中，以备后续处理。</li>
	<li>用血细胞计数板计数细胞，并根据接种密度，用完全 DMEM 培养基稀释剩余细胞悬液，制备成浓度为 1 × 105 个细胞/mL 的细胞悬液。 
	注意：共培养体系中细胞过度融合可能会显著降低吞噬作用。本研究中，巨噬细胞与癌细胞的接种比例调整为 1:1。该比例可根据肿瘤细胞的侵袭性及巨噬细胞来源进行调整。</li>
	<li>在共培养前，弃去前一天接种的 4T1 细胞（步骤 4.5）的培养上清液，并用至少 1 mL 的 PBS 小心洗涤单层细胞 2 次。</li>
	<li>将 1 × 105 个 RAW 264.7 细胞接种至含有 2 mL 完全 DMEM 培养基的 4T1 成像培养皿中。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2−3 小时，以促进细胞贴壁。将该成像培养皿标记为 4T1-M1 共培养体系。 
	注意：4T1（对照）细胞未与巨噬细胞共培养。</li>
</ol>
6. RAW 264.7 巨噬细胞的 M1 极化
<ol>
	<li>通过在添加了10% (v/v) 胎牛血清的完全DMEM培养基中加入100 ng/mL LPS和20 ng/mL IFN-γ，制备M1极化培养基10,11。</li>
	<li>弃去先前孵育的巨噬细胞（步骤5.5）的培养上清液，并用至少1 mL PBS小心地将培养皿中的单层细胞洗涤2次。</li>
	<li>然后，向成像培养皿中加入2 mL M1极化培养基，并在37 °C、5% CO2条件下孵育，使RAW 264.7细胞诱导为M1型巨噬细胞表型。 
	注意：M1型巨噬细胞可能需要2−3小时的孵育时间才能完成极化。需预先开展实验，以确定合适的孵育时间，确保巨噬细胞完全极化。</li>
</ol>
7. 吞噬作用的活细胞视频显微镜观察
注意：进行活细胞成像以获得可重复的视频时，需要考虑多种因素，包括图像曝光的优化、时间测量以及自动聚焦校正。
<ol>
	<li>实验前，打开恒温器将细胞培养箱温度设为 37 °C，并通入 5% CO2。 
	注意：显微镜系统需配备倒置载物台、载物台顶部培养箱、湿度控制（95%）及气体培养系统。该配置对于长期活细胞视频显微观察至关重要。</li>
	<li>开启显微镜（包括压电载物台），并加载显微成像软件。</li>
	<li>将接种于 35 mm 玻璃底成像培养皿中的共培养细胞置于载物台中央，并轻轻旋紧顶部腔室。使用操纵杆通过选择成像位置来驱动载物台移动。</li>
	<li>观察样品时，选择物镜转盘上的相差滤光片。初步观察样品后，定位合适的视野，并将样品调至清晰对焦。 
	注意：成像软件支持全自动物镜选择、完美对焦系统（Perfect Focus System）、延时序列、多通道图像采集及多点图像采集功能。</li>
	<li>为设置 CFSE 标记和微分干涉差（DIC）成像的多通道荧光，打开成像软件的采集对话框，选择 [Lambda] 选项卡（图 2）。 
	注意：对于 13 小时的延时成像，应使用相差通道。</li>
	<li>选择 [Lambda] 选项卡 | [Optical Configuration]，然后分别选中 [10X DIC]（用于微分干涉差成像）和 [GFP-R]（用于绿色荧光滤光片）的复选框。在 [Lambda] | [Focus] 列中，选中 [10X DIC] 复选框，将其设为对焦参考通道。</li>
	<li>打开成像软件的采集对话框，点击 [XYZ Time …] 按钮，并选择 [XY] 选项卡。</li>
	<li>使用电动载物台的操纵杆移动至图像采集点，同时观察实时图像，或通过目镜选择其他位置。然后点击 [Point Name] 列下的复选框，为每个位置设置图像采集点（见 图 3）。 
	注意：自动载物台支持在不同 XY 坐标处进行多点图像采集，以获取多个视野。</li>
	<li>对屏幕上观察到的每个样品进行精细对焦。使用 自动对焦校正 控件进行调节。</li>
	<li>使用软件设置延时图像采集。在成像软件的采集对话框中，勾选 [Time] 选项卡（见 图 4）。</li>
	<li>设定 [Interval]（一个时间点开始到下一个时间点开始的间隔）和 [Duration]（实验总时长）。时间单位可从下拉菜单中选择，包括毫秒（ms）、秒（s）、分钟（m）或小时（h）。 
	注意：荧光与 DIC 多通道延时成像的成像周期长度可能因本实验所用荧光染料而异。若标记细胞暴露时间过长，可能发生光漂白。</li>
	<li>勾选 [Save to File] 复选框以保存采集的图像。在 [Time schedule] 选项卡下，点击 [Run now] 按钮，开始采集多点时间序列图像（见 图 5）。 
	注意：在成像软件中，图像以 nd2 文件格式保存。每个延时序列之后可单独保存为 MP4 文件格式。</li>
</ol>

<ol><li>Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+based+Machine+Learning+for+identification+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).</li>
<li>Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization%3A+Tumor-associated+macrophages+as+a+paradigm+for+polarized+M2+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes.</a> Trends in Immunology. , (2002).</li>
<li>Lee, K. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+KY+%22M1+and+M2+polarization+of+macrophages+a+mini-review%22">M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review</a>. 2 (1), 1-5 (2019).</li>
<li>Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+phagocytic+activity+in+live+macrophages-tumor+cells+cocultures+by+Confocal+and+Nomarski+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy.</a> Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).</li>
<li>Tauber, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metchnikoff+and+the+phagocytosis+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metchnikoff and the phagocytosis theory.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).</li>
<li>Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Tumor+Stroma%3A+Cellular+Components%2C+Phenotypic+Heterogeneity%2C+Intercellular+Communication%2C+Prognostic+ImplicationsTherapeutic+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities.</a> Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).</li>
<li>Larionova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+tumor-associated+macrophages+and+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy.</a> OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).</li>
<li>Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+Random+Migration+of+Cells+Using+Time-lapse+Video+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3585(2012).</li>
<li>Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+Assays+to+Study+Glioblastoma+Brain+Tumor+Stem+Cell+Migration+and+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58152(2018).</li>
<li>Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+basic+protein+charge+isomers+change+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization.</a> Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burden+of+multiple+sclerosis+2015%3A+Methods+of+data+collection%2C+assessment+and+analysis+of+costs%2C+quality+of+life+and+symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+Journal%22%5BJournal%5D)">The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms.</a> Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).</li>
<li>Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+tumor+cytolysis+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of tumor cytolysis by macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).</li>
<li>Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+migratory+properties+of+M1%2C+M2%2C+and+resident+macrophages+are+regulated+by+%CE%B1d%CE%B22and+%CE%B1m%CE%B22integrin-mediated+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).</li>
<li>McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+macrophage+phenotype+by+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modulation of macrophage phenotype by cell shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).</li>
<li>Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+monitoring+of+live+cell+proliferation+in+presence+of+PVP-Hypericin%3A+A+new+strategy+using+ms+pulses+of+LED+and+the+fluorescent+dye+CFSE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE.</a> Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案包含两个步骤：1）4T1 小鼠乳腺癌细胞与 M1 极化巨噬细胞的共培养，以及 2）利用延时显微镜评估巨噬细胞的吞噬活性。活细胞共培养技术广泛应用于吞噬作用和迁移实验。此处的活细胞共培养模型是一种简单且可灵活调整的体外实验方法（图 2），该方法使用荧光染料 CFSE 标记 4T1 靶细胞，以便在活细胞成像过程中准确追踪不同类型的细胞。通过多点延时二维成像技术，在共培养 13 小时之前对 M1 巨噬细胞的吞噬活性进行延时活细胞成像分析。
使用4T1小鼠乳腺癌细胞和M1小鼠巨噬细胞建立了活细胞共培养模型。为了区分不同类型的细胞，采用CFSE荧光染料对4T1细胞进行染色（见第4节）。CFSE可用于追踪细胞并监测细胞分裂。CFSE可被动扩散进入细胞，因此CFSE染色是一种合适的细胞示踪方法，可用于可视化靶向细胞的吞噬作用。当吞噬性巨噬细胞消化并吞噬癌细胞时，会摄取CFSE染料，最终呈现荧光12,13。必须先将4...

巨噬细胞是免疫防御的第一道防线，在协调针对病原体和外来物质（包括癌细胞）的免疫反应中发挥重要作用。它们是一类特化的吞噬细胞，能够清除和消除体内的无用颗粒。巨噬细胞具有多种防御功能，例如清除凋亡细胞和微生物，并募集其他免疫细胞1。巨噬细胞可根据环境信号分化为两种不同类型：M1型和M2型巨噬细胞2。M1极化巨噬细胞（即经典活化巨噬细胞）由细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）和脂多糖（LPS）激活，参与炎症反应、病原体清除、高效吞噬作用以及抗肿瘤免疫3,4。M2型巨噬细胞与肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）密切相关，具有抗炎作用并可促进肿瘤发展4。
吞噬作用（phagocytosis）一词源自古希腊语 phagein，意为“吞噬”，kytos 意为“细胞”，-osis 表示“过程”&#34;过程&#34;5。吞噬作用是一种受体介导的过程，由吞噬细胞（包括巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞）执行，可杀灭并吞噬入侵的病原体，清除外来颗粒以及凋亡细胞碎片。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）存在于多种肿瘤的间质中，包括乳腺癌，并具有促肿瘤功能6,7，从而导致对吞噬作用的抵抗。巨噬细胞对肿瘤细胞吞噬作用的具体机制目前尚未完全阐明。
本研究介绍了一种两步法：1）将4T1小鼠乳腺癌细胞与M1极化型巨噬细胞进行共培养，2）利用活细胞视频显微镜评估巨噬细胞的吞噬活性。采用CFSE荧光染料对4T1小鼠乳腺癌细胞进行染色，该染色可标记4T1细胞，从而在同一个成像培养皿中将其与共培养的M1巨噬细胞区分开来。RAW 264.7巨噬细胞通过LPS和IFN-γ诱导极化为M1表型。为确保极化完全，使用与FITC偶联的抗iNOS抗体进行免疫荧光染色。随后，采集多点时间序列图像，以观察共培养体系中的多个事件，包括吞噬作用。
深入理解肿瘤细胞与巨噬细胞之间的相互作用可能为癌症免疫治疗提供新的途径。活细胞成像技术能够在实时环境中详细观察细胞动态，已被广泛应用于神经科学、发育生物学和药物发现等领域中的细胞迁移、表型筛选、细胞凋亡和细胞毒性研究8,9。尽管本研究中所提出的肿瘤模型为乳腺癌，但该方法同样适用于多种靶细胞与不同效应细胞的研究。

<table><tbody><tr><td>与FITC偶联的抗iNOS抗体</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>REA982</td><td>150 &amp;micro;g/1 mL</td></tr><tr><td>羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td>25 mg</td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>DMEM/高糖培养基</td><td>HyClone</td><td>SH30003.04</td><td>670.0 g</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Tico Europe</td><td>FBSEU500</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>脂多糖</td><td>Sigma</td><td>L4516-1MG</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>小鼠重组干扰素-γ</td><td>Stemcell Technologies</td><td>78021</td><td>100 &amp;micro;g</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Cellgro</td><td>30-003-CI</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>10个/包</td></tr><tr><td>胰蛋白酶EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-052-CI</td><td>1X, 100 mL</td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L移液器吸头</td><td>WhiteBox</td><td>WB-301-01-052</td><td>5000个/箱</td></tr><tr><td>2 mL血清移液管</td><td>JET BIOFIL</td><td>GSP012002</td><td>无热原</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L移液器吸头</td><td>WhiteBox</td><td>WB-301-02-302</td><td>20,000个/箱</td></tr><tr><td>25 cm²细胞培养瓶</td><td>Corning</td><td>CLS430639</td><td>组织培养处理</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Dynamica</td><td>FA15C</td><td>型号：Velocity 14R</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Nuaire</td><td>NU-565-400</td><td>型号：Home/LabGard&amp;reg; ES TE NU-565 II级B2型生物安全柜</td></tr><tr><td>CO₂/空气混合器</td><td>Chamlide（Live Cell Instrument）</td><td>FC-R-20</td><td>FC-5（CO₂/空气混合器）配流量计</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>NEST</td><td>710001</td><td>220 mm</td></tr><tr><td>CO₂细胞培养箱</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td>型号：MCO-19M(UV)</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Nikon Ti-Eclipse</td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>Ibidi</td><td>81218-200</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>NIS元素软件</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>可在线下载</td><td></td></tr><tr><td>移液器控制器</td><td>CappAid</td><td>PA-100</td><td>CappController移液器控制器，0.1–100 mL</td></tr><tr><td>恒温器</td><td>Shinko</td><td>已停产</td><td>JCS-33A 48 × 48 × 96.5 mm</td></tr></tbody></table>

共培养体系中m1型巨噬细胞与4t1小鼠乳腺癌细胞吞噬活性的延时二维成像

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）已被确认为促进肿瘤生长、侵袭、转移以及对癌症治疗产生耐药性的重要组成部分。然而，肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤的影响具有双重性，其作用取决于肿瘤微环境，并可根据环境变化可逆地改变其表型特征，既可能抑制免疫细胞的细胞毒活性，也可能增强抗肿瘤免疫反应。目前对巨噬细胞的分子作用及其与肿瘤细胞（例如吞噬作用）的相互作用研究尚不充分。因此，免疫细胞（M1/M2亚型TAM）与癌细胞在肿瘤微环境中的相互作用已成为癌症免疫治疗研究的重点。本研究建立了一种诱导型M1巨噬细胞与小鼠乳腺4T1癌细胞的活细胞共培养模型，利用相差、荧光及微分干涉相差（DIC）显微镜的时间延时视频功能，评估巨噬细胞的吞噬活性。该方法可实现对吞噬过程的多时间点活细胞成像观察与记录。在用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）染色4T1细胞后，可通过荧光显微镜观察M1巨噬细胞对4T1细胞的吞噬过程。本文详细描述了如何在单个成像培养皿中进行巨噬细胞与肿瘤细胞的共培养、M1巨噬细胞的极化，以及在13小时共培养期间记录巨噬细胞吞噬4T1细胞的多时间点事件。

4T1小鼠乳腺癌细胞系共培养模型的延时二维（2D）图像显示，在13小时期间，M1型巨噬细胞吞噬4T1细胞的过程。为确保M1型巨噬细胞完全极化，需进行免疫荧光染色验证。结果（图1）表明，100 ng/mL脂多糖（LPS）和20 ng/mL IFN-γ的浓度可将RAW 264.7巨噬细胞极化为M1状态。通过荧光染料标记靶细胞，而效应细胞不标记，可建立活细胞共培养模型（视频1）。在13小时15分钟的时间间隔内，记录了M1型巨噬细胞与4T1细胞共培养时的吞噬活性（视频2）。为评估单个35 mm玻璃底成像培养皿中的多个事件，共采集了六个多位点视频（视频2中的A−F）。视频3展示了M1型巨噬细胞对4T1细胞的吞噬过程。视频4选自本实验中拍摄的深度视频示例，视频5展示了M1型巨噬细胞对4T1细胞的摄取过程。
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本研究对巨噬细胞针对癌细胞（特别是4T1小鼠乳腺癌细胞）的吞噬活性进行了成像。通过荧光显微镜与微分干涉差显微镜联用，建立并观察了活细胞共培养模型。利用成像软件对这一评估过程进行成像，生成了多点时间延时视频。

共培养体系中M1型巨噬细胞与4T1小鼠乳腺癌细胞吞噬活性的延时二维成像

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）已被确认为肿瘤生长、侵袭、转移以及对癌症治疗产生耐药性的重要组成部分……

本研究的总体目标是获得共培养体系中M1型巨噬细胞对4T1小鼠乳腺癌细胞吞噬活性的延时二维成像。通过荧光显微镜与微分干涉差显微镜相结合的方法，建立并观察活细胞共培养模型。利用成像软件对多点延时视频进行叠加处理，以评估巨噬细胞的吞噬活性，随后进行孵育实验。本研究旨在探讨巨噬细胞与癌细胞相互作用过程中，巨噬细胞行为及其吞噬活性的调控机制，特别是针对小鼠乳腺癌的研究。本研究的第一部分始于4T1小鼠乳腺癌细胞与RAW 264.7小鼠巨噬细胞的活细胞共培养模型。实验开始时，培养41株小鼠乳腺癌细胞和RAW 2647小鼠巨噬细胞。首先，解冻一管4T1细胞和RAW 2647细胞。将解冻后的细胞稀释于10毫米的15毫升锥形管中。接下来，以660 g离心力离心5分钟，获得细胞沉淀。小心吸除培养基，将细胞重悬于8 mL完全培养基中，并将细胞转移至组织培养瓶中。在37°C、5%二氧化碳条件下培养细胞。在贴壁条件下培养一周后，每天观察培养瓶，并根据需要补充atmil完全培养基。下一步继续进行M1极化的RAW 2647巨噬细胞的免疫染色。此步骤旨在确保M1巨噬细胞完全极化。当 RAW 264.7 细胞融合度达到 70% 至 80% 时，弃去培养基，并用 PBS 轻轻冲洗两次。用细胞刮轻轻刮下贴壁细胞，将细胞收集至 50 mL 圆锥形离心管中，以制备巨噬细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并通过向已设定的密度中加入剩余溶液，制备每皿 100,000 个细胞的细胞悬液。将2毫升巨噬细胞悬液分别加入两个成像培养皿中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育细胞2至3小时，以促进细胞贴壁。通过在含有10%胎牛血清的完全培养基中添加100纳克/毫升脂多糖（LPS）和20纳克/毫升干扰素-γ，制备M1极化培养基。弃去孵育前的巨噬细胞培养上清液，用 PBS 小心地将培养皿中的单层细胞洗涤两次。向其中一个配对的培养皿中加入 2 毫升 M1 极化培养基，使硬脑膜细胞极化为 M1 巨噬细胞表型。免疫染色前，使用 2 毫升 4% 多聚甲醛固定 RAW 细胞和 M1 巨噬细胞，在室温下孵育 50 分钟。吸除上清液，用 PBS 洗涤细胞单层，至少三次。加入 2 mL 含 50 mmol/L 氯化铵的 PBS 溶液淬灭，在室温下孵育 50 分钟。用含 0.3% Triton X-100 的 PBS 溶液在室温下透化处理 50 分钟。在室温下，使用含10% FBS的PBS封闭30分钟。加入含1% FBS的PBS中稀释的FITC标记抗iNOS抗体，4°C避光孵育过夜。将1 mL DAPI加入成像培养皿中，37°C避光孵育10分钟，可用铝箔覆盖以避光。使用 PBS 至少洗涤细胞 3 次，并向对应的培养皿中加入 1 毫升 DMEM，准备进行荧光成像。下一步进行 4T1 小鼠乳腺癌细胞的接种。当 4T1 细胞融合度达到 70% 至 80% 时，弃去培养基，并用 PBS 轻柔冲洗两次。加入1 mL预热的胰蛋白酶以解离细胞，并在37°C下孵育最多20分钟。当细胞出现脱落时，将脱落的细胞转移至15 mL锥形管中，再加入2 mL预热的完全培养基以灭活胰蛋白酶。在600 ×g 力量下离心5分钟以获得细胞沉淀。弃去上清液，并将沉淀重悬于10毫升级预运行取样DMEM培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将100,000个细胞接种至毫升级DMEM培养基中。使用TC处理后进行成像。下一步是利用CFSE染色对活体4T1小鼠乳腺癌细胞进行标记。首先，从之前接种了4T1细胞的成像培养皿中移除现有的培养基。通过将CFSE染色液用1 mL PBS稀释，配制5 µM的工作浓度染色溶液。向成像培养皿中加入1 mL CFSE染色溶液，在室温或37°C避光条件下孵育细胞20分钟。向细胞和染色溶液中加入等体积的DMEM，并继续孵育5分钟。下一步是接种 RAW2647 小鼠巨噬细胞并与 4T1 细胞共培养。在对 4T1 细胞进行 CFSE 标记后，用 PBS 洗涤成像培养皿两次。将 2 毫升巨噬细胞悬液接种至含有 4T1 细胞的成像培养皿中。下一步是将 RAW 264.7 巨噬细胞极化为 M1 表型。向培养皿中加入 2 毫升 M1 极化培养基，使 RAW 细胞分化为 M1 巨噬细胞表型。研究的第二部分是通过延时成像评估 M1 巨噬细胞对 4T1 细胞的吞噬作用。下一步包括活细胞视频显微镜吞噬作用评估。首先，打开显微镜。将温度设置为37摄氏度。以及5%的二氧化碳气体。将共培养细胞置于载物台中央，并轻轻拧上顶部腔室。通过操纵杆选择不同的位置，以电动方式移动载物台并捕获图像。进行活细胞成像时需要考虑多种因素。为了获得高质量的小型视频，必须优化成像曝光时间、时间间隔测量，并实现焦点校正的自动化。如果视频曝光过度、时间间隔不正确或对焦不准，将导致视频无法使用。一旦发现上述任一情况，均需重复实验。图一显示了用抗iNOS抗体标记的绿色免疫荧光图像。蓝色为细胞核标记物 DAPI。以及大部分图像的增强版本。视频 1 是展示 M1 巨噬细胞与 4T1 细胞相互作用的代表性活细胞视频。使用荧光和IC显微镜多通道采集捕获的CFSE染色小鼠乳腺癌细胞共培养图像。视频2为单个共培养培养皿中多点拍摄的活细胞视频显微镜影像，显示诱导型M1巨噬细胞对4T1细胞的吞噬作用。每隔50分钟采集一次图像，持续13小时。视频3为活细胞视频显微镜录像，展示了一个选定的单坐标点，以深入可视化M1型巨噬细胞对4T1细胞的吞噬作用。红色箭头指示M1型巨噬细胞，黄色圆圈显示部分4T1细胞荧光淬灭并脱离4T1细胞群。M1 巨噬细胞的运动方式表现为胞质呈伪足状，而 4T1 小鼠记忆性癌细胞则具有上皮样形态。可见巨噬细胞向 4T1 细胞移动，形成细胞间接触，随后 M1 巨噬细胞吞噬 4T1 细胞。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用 4T1 小鼠乳腺癌细胞和 RAW 264.7 巨噬细胞进行活细胞视频显微镜实验；您还应能够建立两种细胞类型的过夜共培养体系，以开展吞噬作用实验。此外，您还应理解 4T1 细胞与经 LPS 和干扰素-γ 激活的巨噬细胞共培养的操作方法。

time-lapse-2d-imaging-phagocytic-activity-m1-macrophage-4t1-mouse

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科研

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