Name: 使用荧光原位杂交对毛尿胃肠道中的念珠菌的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 了解如何使用荧光原位杂交技术在小鼠胃肠道中可视化白色念珠菌的形态与定位。该方法有助于研究肠道微生物相互作用及真菌致病机制。

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作者感谢Carolina Tropini、Katharine Ng、Justin Sonnenburg和KC Huang在开发FISH技术过程中提供的指导。Teresa O’Meara对稿件提出了有益的修改意见，Miriam Levy协助完成了摄影工作。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）R01AI108992、R01DK113788基金以及传染病发病机制Burroughs Welcome奖的支持。

以下步骤已获得加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 通过口服灌胃法使小鼠胃肠道定植C. albicans
<ol>
	<li>根据当地实验动物管理和使用委员会（IACUC）的批准，为18−21 g的雄性或雌性小鼠（8−10周龄）提供饲养环境。从第一天起使用经高压灭菌的食物和水。 
	注意：使用灭菌的笼具、垫料、食物和水可降低与抗生素耐药性环境细菌污染的风险，这些细菌可能取代肠道中的C. albicans。此外，根据实验目的，应考虑单独饲养动物，因为小鼠具有食粪行为，同笼饲养的动物会共享肠道内容物。</li>
	<li>次日，将高压灭菌的饮用水更换为含有5%葡萄糖、1,500 U/mL青霉素G和2 mg/mL链霉素的高压灭菌水。</li>
	<li>为方便起见，提前配制200倍抗生素储备液（表1），经滤膜除菌后于-20 °C保存。</li>
	<li>让动物持续服用抗生素一周。
	<ol>
		<li>在开始使用抗生素后的第3天和第6天，检测每只动物粪便中是否存在耐抗生素的好氧细菌污染。用一只手固定小鼠，将未加盖的微量离心管靠近肛门，收集至少一个粪便颗粒。</li>
		<li>将每个粪便颗粒重悬于1 mL无菌水中，取100 µL分别涂布于Luria肉汤（LB）、酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YEPD）或脑心浸液（BHI）加血琼脂平板上。在37 °C的标准培养箱（非厌氧条件）中过夜培养，并观察细菌生长情况。 
		注意：平板上应仅有极少菌落生长（0−20个菌落）。若从接受青霉素和链霉素处理的动物中回收到&#62;20个细菌菌落，则很难建立高水平的C. albicans定植，应终止实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灌胃前3天，将冻存的甘油菌种中的C. albicans划线接种至含2%琼脂的YEPD平板上，在30 °C培养2天。</li>
	<li>灌胃前1天，将待测的每种C. albicans菌株各挑取一个单菌落，接种至5 mL液体YEPD培养基中，在30 °C振荡培养过夜。</li>
	<li>灌胃当天早晨，将饱和培养的C. albicans菌液用预热至30 °C的100 mL YEPD培养基稀释至600 nm处的光密度（OD600）为0.1。在30 °C、200 rpm条件下振荡培养4至5小时，直至OD600达到1（对数中期生长）。</li>
	<li>将每份100 mL培养物转移至两个50 mL锥形管中，在室温（RT）下以3,000 × g离心5分钟。 
	注意：C. albicans在室温下增殖相对较慢。若将本方案用于其他物种，可能需要将接种物置于冰上以防止继续生长。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀细胞用每50 mL培养物体积对应的20 mL无菌生理盐水重悬，并将两份重悬液合并至同一锥形管中，再以3,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用20 mL无菌生理盐水重悬细胞，短暂涡旋后取出20 µL用于OD600测定。用无菌生理盐水按1:50稀释后测定。将剩余重悬细胞以3,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液。为达到1 × 108 CFU的接种量，根据OD600测定估算的浓度，将沉淀细胞重悬于无菌生理盐水中，终浓度约为5 × 108 CFU/mL。 
	注意：通常OD600为1时对应约1 × 107酵母细胞/mL。该数值可能因分光光度计不同而有所差异，应予以验证。若需调整其他微生物感染时的接种浓度，应规划接种体积不超过10 µL/g小鼠，以尽量减少动物不适。</li>
	<li>通过血球计数板对1:1,000稀释的菌液进行细胞计数，以确认接种物浓度。根据血球计数板测定的浓度调整实际灌胃的细胞体积。</li>
	<li>使用动物灌胃针（图1A），按照计算好的体积对每只动物进行灌胃。灌胃操作详见步骤1.13.1−1.13.8。 
	注意：灌胃操作应由经验丰富的人员进行培训，并提前熟练掌握。单只动物的成功操作通常不超过1分钟。
	<ol>
		<li>将高压灭菌的动物灌胃针连接至1 mL注射器，吸入一个灌胃剂量的液体，并排除所有气泡，以防剂量不准确。将注射器置于无菌表面上。</li>
		<li>固定待灌胃动物。用优势手握住动物尾根部，非优势手沿背部向前滑动至耳后松弛皮肤处。</li>
		<li>用非优势手的拇指和食指紧紧捏住该处松弛皮肤，即“颈背部抓握”（scruff）。提起动物，用同一只手的小指勾住尾巴，使动物固定于手掌中。轻柔地伸展动物头部，使其头、身体（从而颈部和食道）呈一条直线。 
		注意：若动物身体弯曲或扭转时进行灌胃，可能导致食道穿孔等并发症，甚至导致动物死亡。</li>
		<li>用优势手拿起注射器，使其垂直于动物，弯曲针头朝下（图1B）。用针头球部轻柔钩住口腔内侧角落，沿口腔侧壁缓慢推进至咽喉后部，最后将针头移至中央位置。 
		注意：沿侧向路径插入针头有助于避免动物牙齿和舌头的阻力。</li>
		<li>当针头球部到达咽喉后部时，将针头向上倾斜，使其与动物身体轴线平行（图1C）。 
		注意：此时动物会出现吞咽反射（gag reflex），这是针头位置正确的良好迹象，且该反射有助于引导针头进入食道。若无吞咽反射，针头可能误入气管而非食道。应轻柔撤出针头，并返回步骤1.13.1重新操作。</li>
		<li>让动物自然吞咽接种液，直至仅剩几毫米可见（图1D）。平稳推进针头。 
		注意：若针头无法推进，切勿强行用力，以免损伤食道。有时最后半厘米的推进需要动物出现较强的吞咽动作。若感觉针头卡住，应缓慢撤出并从步骤1.13.4重新开始。</li>
		<li>通过轻推活塞测试针头球部是否位于正确位置（胃内）。若无阻力，继续注入接种液。接种完成后，缓慢撤出针头。</li>
		<li>将动物放回笼中，并持续观察5−10分钟，注意是否有呼吸困难或痛苦表现。确认动物在灌胃后很快恢复正常的活动状态。</li>
		<li>若下一动物使用相同的接种液，应用酒精棉片清洁针头，并返回步骤1.13.1。若更换不同接种液，则应使用新针头并返回步骤1.13.1。 
		注意：灌胃后次日必须检查动物状态。出现痛苦症状（如弓背姿势、呼吸困难）的动物应实施人道安乐死，因其很可能已发生食道破裂、肺部损伤或其他难以恢复的内部伤害。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物灌胃后，对接种物进行系列稀释并涂板，以验证接种剂量。
	<ol>
		<li>制备10倍系列稀释液，最高稀释至1:105。取1:105稀释液的一个灌胃体积，涂布于直径100 mm的沙保葡萄糖琼脂平板上。</li>
		<li>在30 °C培养2天，计数CFU以确认接种剂量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织学用胃肠道组织的制备
注意：本实验方案的此部分内容改编自 Johansson 和 Hansson16。
<ol>
	<li>为每解剖2只动物，在一个大的带螺口盖的塑料瓶中配制500 mL甲醇-氯仿-冰醋酸固定液（methacarn溶液，60%甲醇、30%氯仿、10%冰醋酸）。 
	注意：甲醇和氯仿吸入后有害，应在化学通风橱中操作。冰醋酸具有腐蚀性，应佩戴适当的个人防护装备进行操作。甲醇、氯仿和冰醋酸应作为危险废物妥善处理。</li>
	<li>在实验终点，根据当地实验动物管理与使用委员会（IACUC）批准的方案对动物实施人道安乐死。 
	备注：在抗生素处理的动物中，C. albicans的定植量通常在第5天约为~106 CFU/g，至第25天可达~5 × 107 CFU/g。</li>
	<li>用10%次氯酸钠溶液对解剖器械进行灭菌，并用70%乙醇冲洗。</li>
	<li>将每只动物腹侧朝上固定于解剖板上。使用30 G针头将四肢固定在解剖板上（图2A）。用70%乙醇喷洒动物体表，以清洁毛发并减少组织粘连器械。</li>
	<li>用钝头镊子以非优势手持镊夹住腹部皮肤的一段，用优势手持剪刀在骨盆基部附近切开皮肤及皮下筋膜。沿腹腔两侧呈U形切口向上延伸至肋骨区域。将皮肤掀开以暴露视野。</li>
	<li>使用铅笔预先标记用于组织学分析的胃肠道各段对应的组织学包埋盒。例如，为每只动物分别标记为“胃”、“近端小肠”、“中段小肠”、“远端小肠”、“盲肠”和“大肠”的独立包埋盒。在每个包埋盒底部放置一块泡沫垫（图2A）。 
	备注：图2B展示了建议放入包埋盒中的组织切片区域。</li>
	<li>用钝头镊子轻轻将盲肠从腹腔中取出。使用剪刀切断盲肠与小肠和大肠之间的连接。 
	备注：盲肠组织非常脆弱，容易破裂，操作时应格外小心。</li>
	<li>将整个盲肠放入组织学包埋盒中，确保其无扭曲并平铺放置（图2C）。在上方覆盖第二块泡沫垫，盖紧包埋盒。将包埋盒放入盛有methacarn溶液的螺口瓶中。</li>
	<li>切除一段包含1–2粒粪便颗粒的大肠组织，其长度应小于包埋盒的尺寸。</li>
	<li>将组织片段放入包埋盒中，保持组织平展且无扭曲。覆盖第二块泡沫垫，盖紧包埋盒。将包埋盒放入methacarn溶液中。</li>
	<li>对于需要取样的每一段小肠，切除一段1–2 cm长、含有部分消化内容物的肠段。</li>
	<li>将该肠段放入组织学包埋盒中，保持组织平展且无扭曲。覆盖第二块泡沫垫，盖紧包埋盒。将包埋盒放入methacarn溶液中。</li>
	<li>对于胃组织，切断其与食管和小肠的连接，将胃放入包埋盒中，保持组织平展且无扭曲。覆盖第二块泡沫垫，盖紧包埋盒。将包埋盒放入methacarn溶液中。</li>
	<li>将包埋盒置于methacarn溶液中，在室温下固定至少3小时，但不超过2周。 
	备注：固定后的胃肠道组织可在多个阶段送至商业组织学服务机构。这些组织在切片过程中容易因腔内容物扰动而受损，最佳结果需由经验丰富的技术人员完成。若商业服务机构愿意在石蜡包埋前对组织进行清洗处理，则可在此阶段将包埋盒连同步骤2.16的操作说明一并寄送。</li>
	<li>在预热至70 °C的杂交炉中，将足量石蜡置于大烧杯内开始熔化，确保能覆盖所有组织包埋盒。</li>
	<li>固定完成后，取出泡沫垫，将完整组织段重新放回原包埋盒中。在室温下振荡条件下依次用下列溶液洗涤组织：100%甲醇洗两次，每次35分钟；100%乙醇洗两次，每次25分钟；二甲苯洗两次，每次20分钟。 
	注意：二甲苯易燃、有毒，吸入可造成损害，应在化学通风橱中佩戴适当防护装备操作。二甲苯须按危险废物程序处理。</li>
	<li>用纸巾轻轻吸干包埋盒表面液体，将其置于70 °C杂交炉中的预熔化石蜡中浸渍2小时。确保包埋盒完全充满石蜡且无气泡残留。 
	备注：此步骤使石蜡充分渗透胃肠道组织，稳定组织结构及其内容物。</li>
	<li>从石蜡中取出包埋盒，待多余石蜡流尽后，在室温下保存，直至进行石蜡块包埋。含微量二甲苯的废弃石蜡应作为危险废物处理。 
	备注：Noble实验室采用商业组织学服务进行组织包埋与切片。为常规观察C. albicans酵母相和菌丝相，使用4 µm厚切片。为评估通常跨越多个切面的菌丝片段连接性，可使用8 µm厚切片。根据FISH探针在样本中的穿透能力，也可能使用更厚的切片。</li>
</ol>
3. 新设计探针的验证
注意：以下用于验证 C. albicans 探针的实验方案改编自 Swidsinski 等人17。
<ol>
	<li>划线 C. albicans SC5314 及其密切相关的对照物种（例如， 都柏林假丝酵母，热带假丝酵母) 转接到 YEPD + 2% 琼脂平板上，在 30 °C 培养 1−2 天。</li>
	<li>接种一个单菌落至5 mL液体YEPD培养基中。</li>
	<li>将1 mL悬浮细胞用移液器转移至微量离心管中，在3,000 x g 5 分钟后弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
	<li>用移液器吸取5−10 µL重悬的细胞，滴加到玻璃载片上，铺展成较大的圆形，静置晾干。 
	注意： 若细胞不贴壁，应使用多聚-L-赖氨酸包被的载玻片。</li>
	<li>用PAP笔圈出细胞点样区域，并加入50 µL含2.5%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液覆盖样本。室温孵育10分钟。 
	注意： PFA 具有可燃性，吸入或接触皮肤可能引起健康问题。被 PFA 污染的物品应作为危险废物处理。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 3 次。将液体轻拍至纸巾上，加入 100 µL PBS 覆盖。重复两次。弃去最后一次洗涤液。</li>
	<li>为多日保存制备载玻片。若在同一天进行FISH实验，则跳过本节步骤，直接进入步骤3.9。 
	注意： 最好立即进行杂交，但如果时间紧张，可在储存前先执行步骤3.8。载玻片可在4 °C下保存数天。
	<ol>
		<li>用60%乙醇覆盖该区域，在室温下孵育3分钟，弃去溶液。</li>
		<li>用80%乙醇覆盖该区域，在室温下孵育3分钟，弃去溶液。</li>
		<li>用100%乙醇覆盖该区域，在室温下孵育3分钟，弃去溶液，进行步骤3.9。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将载玻片置于杂交炉中，50 °C下孵育1小时，不加盖。若已执行步骤3.8，则将载玻片于4 °C保存；若未执行，则继续进行步骤4.2，实施杂交实验方案。</li>
</ol>
4. 消化道组织中的FISH染色
<ol>
	<li>脱蜡石蜡包埋的组织切片。
	<ol>
		<li>在杂交炉中，将装有二甲苯的考林瓶预热至 60 °C。</li>
		<li>将载玻片插入盛有二甲苯的瓶中，于 60 °C 孵育 10 分钟。弃去二甲苯洗涤液。保持载玻片在瓶中，将二甲苯倒入废液容器中。</li>
		<li>向瓶中加入新鲜的室温（RT）二甲苯，于 60 °C 孵育 10 分钟。弃去第二次的二甲苯洗涤液。</li>
		<li>用 100% 乙醇充满瓶子，在室温下孵育 5 分钟。取出载玻片并自然晾干。</li>
		<li>将杂交炉设定为 50 °C，用于第 4.2 节中的步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 FISH 探针染色 C. albicans。
	<ol>
		<li>配制 1 mL 新鲜杂交液（20 mM Tris–HCl，pH 7.4，0.9 M NaCl，0.1% 十二烷基硫酸钠 [SDS]，1% 甲酰胺溶于无 RNase 水中）。样品计算参见 表 1。</li>
		<li>将 50 µL 杂交液与 1 µL C. albicans 探针（5’ Cy3- ACAGCAGAAGCCGTGCC 3’；50 µg/mL 溶于无 RNase 水中）混合，使每张载玻片终浓度为 0.5 µg。 
		注意：许多实验室培育的小鼠其微生物群中不含任何真菌。在此情况下，可使用广谱真菌探针（5’ Cy3-CTCTGGCTTCACCCTATTC 3’），该探针可识别大多数真菌物种的 23S rRNA，而不仅限于 C. albicans。根据作者经验，广谱真菌探针的染色亮度高于 C. albicans 特异性探针。</li>
		<li>避光保护溶液，并预热至 50 °C。</li>
		<li>使用 PAP 笔在第 4.1 节的组织切片周围画一圈。</li>
		<li>用移液器吸取 50 μL 含探针的杂交液滴加到固定组织上，并用枪头轻轻铺展覆盖整个组织切片。加盖杂交盖玻片，注意避免产生气泡。</li>
		<li>将载玻片密封于防水杂交盒中，在杂交炉内 50 °C 黑暗条件下孵育 3 小时。</li>
		<li>同时，配制 50 mL FISH 洗涤液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.9 M NaCl 溶于无 RNase 水中）。样品计算参见 表 1。</li>
		<li>将洗涤液转移至 50 °C 预热。</li>
		<li>3 小时后，将洗涤液加入考林瓶中。然后用镊子小心移除载玻片上的盖玻片，并将载玻片放入洗涤液中。</li>
		<li>用铝箔覆盖瓶口，在 50 °C 孵育 20 分钟。</li>
		<li>在此孵育期间，配制黏蛋白-细胞核染色液（20 ng/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 [DAPI]，1.6 µg/mL 异硫氰酸荧光素 [FITC]-凝集素溶于 PBS 中）。样品计算参见 表 1。对于胃和大肠，使用 FITC-荆豆凝集素 1（UEA-1）；对于小肠和盲肠，使用 FITC-UEA-1 与 FITC-麦胚凝集素（WGA）的组合。 
		注意：来自不同物种的凝集素可识别糖蛋白（如黏蛋白）上不同的糖基修饰。此处推荐的凝集素组合是通过实验确定的，适用于不同胃肠道区域黏液的最佳染色效果。</li>
		<li>通过倾倒去除 FISH 洗涤液，并用室温 PBS 重新填充瓶子。立即倒出 PBS 并再次填充。共进行两次洗涤。</li>
		<li>用精细擦拭纸吸去多余的 PBS，并用 PAP 笔在肠道组织切片周围画圈。将载玻片放入不透明塑料容器中，向组织切片加入 50 µL 黏蛋白-细胞核染色液。用铝箔覆盖容器以避光。在 4 °C 孵育 45 分钟。</li>
		<li>将载玻片放入考林瓶中，在室温下用 PBS 快速洗涤两次。</li>
		<li>在纸巾上轻拍去除多余 PBS，再用擦拭纸吸去最后的液滴。</li>
		<li>在每个切片上滴加一滴封片剂，加盖玻璃盖玻片，避免产生气泡。让封片剂均匀扩散至整个盖玻片下方。若需立即成像，可用指甲油在盖玻片四角固定；若需长期保存，则用指甲油沿盖玻片边缘密封。</li>
		<li>使用荧光显微镜观察载玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Cell-Type+Switching+and+Functional+Plasticity+in+the+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host.</a> Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处所述方法可用于可视化 C. albicans 在任何性别或品系的共生定植小鼠的胃肠道中，均可观察到酵母和菌丝。该FISH探针可与分布于真菌细胞质中的23S rRNA发生杂交。本方法改编自先前报道的用于可视化肠道细菌的实验方案20。因为 白色念珠菌 在宿主内形态发生变化，该方法可用于监测真菌细胞形态及定位。例如，我们已利用此方法推翻了酵母菌在整个消化道中占主导地位的假说，并揭示了某些“成丝缺陷型”突变株在体内与体外表型之间的差异12.
存在多种小鼠模型 C. albicans 共生定植。实验小鼠与人类的微生物群存在差异，在小鼠中建立稳定的定植需要使用抗生素或特殊饮食。抗生素处理还可增强 C. albicans 人类定植是播散性疾病的高危因素10本研究中使用的抗生素价格相对低廉，且能可靠地减少细菌微生物群。需要注意的是，抗生素的作用是降低拮抗性细菌物种的负荷，而非将动物体内的所有细菌完全清除。如果研究人员希望研究 白色念珠菌-在无需细菌或避免使用抗生素或特殊饮食的情况下，可用无菌动物替代常规饲养的动物；然而，无菌小鼠存在某些免疫和解剖学异常，因此可能不适用于所有研究目的。
成功的FISH染色有几个关键步骤：推荐的固定方法对于保持胃肠道组织的结构完整性至关重要，特别是肠道腔内容物（如黏液层以及真菌和细菌的三维结构）较为脆弱16。请注意，许多常用的含水固定液会对腔内结构造成严重破坏。本方案推荐使用的固定剂及后续洗涤溶液均不含水，因此必须避免与水接触造成污染。另一个关键步骤是杂交过程，在杂交炉中孵育载玻片时，必须防止杂交溶液蒸发。我们建议将载玻片置于密封防漏的容器中以避免此问题。此外，也可使用密封的杂交舱，例如最初用于微阵列杂交的杂交舱。
A C. albicans-特异性的FISH探针在本方案中进行了描述. 然而，由于许多实验室饲养的小鼠并不含有 C. albicans 或作为其天然肠道微生物群组成部分的其他真菌，泛真菌探针可特异性染色 C. albicans 在实验定植动物中。由于泛真菌探针具有更优的杂交特性和更高的信噪比，使用该探针可能是更理想的选择。若将泛真菌探针用作假特异性探针，则 C. albicans，记录未感染动物中无染色情况非常重要（即，使用抗生素处理但未感染的动物） C. albicans). 对未定植的对照动物进行染色也有助于评估背景染色，这种背景染色可能源于FISH探针与食物颗粒的非特异性结合。总体而言，与其他真菌染色方法（如Calcofluor white染色法（可染色几丁质，即细胞壁成分，其在不同细胞类型中可能有所差异）、GMS染色法或市售抗真菌抗体染色法）相比，FISH探针具有更高的特异性。此外，利用针对不同物种特异性rRNA、带有不同标记的FISH探针，可实现多种生物体的共染色。
该技术的一个局限性在于，某些白色念珠菌（C. albicans）酵母细胞类型在FISH检测中表现得非常相似（例如，不透明型和GUT型细胞类型）。为了区分这些细胞类型，开发针对细胞类型特异性真菌mRNA的杂交探针将具有重要意义。尽管如此，现有的FISH技术已经揭示了在体内和体外条件下评估的C. albicans突变株行为之间存在令人意外的差异12，表明在自然共生环境中存在复杂的相互作用，而当前的体外实验体系尚无法充分模拟这些作用。在更多野生型和突变型宿主中对不同C. albicans菌株开展进一步研究，有望进一步揭示真菌与宿主之间的相互作用机制。特别是，在炎症性肠病模型中对C. albicans进行分析将具有重要指导意义，因为人类炎症性肠病与较高的C. albicans滴度相关21，此外还包括其他C. albicans过度生长和疾病模型。FISH技术还可与免疫组织化学联合使用，以标记特定的宿主细胞。总体而言，本文所述方法为确定C. albicans在哺乳动物胃肠道内的定位和形态提供了一种相对快速且可靠的手段。

Candida albicans 是一种真菌性共生体，同时也是一种机会性人类病原体。这种酵母菌缺乏明确的环境生态位，主要在人类和其他哺乳动物的胃肠道（GI）道、皮肤以及泌尿生殖道内增殖1。尽管早期对 C. albicans 的研究主要集中在其致病潜力上，但近年来多项研究表明，在肠道内以共生方式增殖的该类生物可能在宿主正常健康中发挥重要作用，包括参与宿主免疫系统的发育2,3,4。为了促进对 C. albicans 在哺乳动物肠道内共生关系的研究，我们建立了一种稳定胃肠道定植的小鼠模型，并开发了一种基于荧光原位杂交（FISH）的方法，用于可视化肠腔内的真菌酵母细胞和菌丝。
除少数例外情况外5，实验室饲养的小鼠通常对消化道真菌定植具有抵抗性。这种定植抗性被认为由特定的细菌种类介导；然而，通过使用抗生素处理动物6,7，或采用化学成分明确的饮食（据信可改变细菌种类组成）8,9，可克服这种抗性。类似地，在人类中，广谱抗生素的使用与C. albicans的过度生长和播散相关10。我们的小鼠定植模型利用广谱抗生素，在免疫功能正常、常规饲养的小鼠中建立C. albicans的定植。在经口灌胃接种108个菌落形成单位（CFUs）的C. albicans前一周，将青霉素和链霉素加入动物的饮水中，持续给药一周。只要继续提供含抗生素的饮水，C. albicans就会在胃肠道内持续增殖，粪便中的滴度可达106−108 CFUs/g。尽管真菌定植水平较高，动物仍保持健康状态，体重增长速度与未感染的对照组相同。该模型已成功用于筛选和鉴定多种C. albicans共生相关因子11,12。
与其他真菌界成员一样，C. albicans 具有极强的形态可塑性13。在体外条件下，已观察到其可在至少六种单细胞酵母形态之间转换，同时还可形成多细胞的菌丝和假菌丝。其中，酵母相向菌丝相的转化是其最明确的毒力特征之一，且在大多数哺乳动物疾病模型以及人类感染组织中，菌丝和假菌丝均占主导地位。为了确定 C. albicans 在小鼠消化道内的定位及其细胞形态，我们开发了一种荧光原位杂交（FISH）技术，用于对固定组织切片中的酵母和菌丝进行染色。该技术所用探针为荧光标记的DNA寡核苷酸，可与真菌23S核糖体RNA（rRNA）杂交，而该rRNA广泛分布于真菌细胞质中。由于宿主组织以保留肠道三维结构的方式进行固定，包括宿主黏膜、消化物质、肠道腔内的细菌微生物群以及黏液层，因此在染色后，该技术可实现真菌细胞相对于这些解剖标志物的精确定位。与传统的真菌组织学染色方法（如过碘酸-希夫染色法（PAS）或戈莫里六胺银染色法（GMS））以及市售的抗真菌抗体相比，该FISH技术具有明显优势，因为这些试剂并不特异针对 C. albicans。此外，常规固定剂会去除黏液层，并破坏肠道腔内其他成分的结构14,15。
本文提供了建立小鼠胃肠道中高程度C. albicans定植的详细操作步骤，包括对安乐死动物进行消化道解剖、以保持管腔结构完整性的方式进行组织固定，以及利用荧光原位杂交（FISH）技术检测宿主组织内的C. albicans。除了野生型和C. albicans突变株外，灌胃技术还可用于递送其他微生物。该组织固定方法适用于任何需要保存肠道内容物的研究。FISH 操作可在一天内完成，并可通过使用多种不同标记的探针来实现多种真菌物种的定位。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td>可由任意供应商提供替代品</td></tr><tr><td>BHI 血琼脂</td><td></td><td></td><td>可由任意供应商提供替代品</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. albicans&lt;/em&gt; FISH 探针</td><td>IDT DNA 技术公司</td><td>定制订购</td><td></td></tr><tr><td>杂交孵育用腔室</td><td></td><td></td><td>防水腔室，用于减少蒸发</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>&gt;=99.5%</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>可由任意供应商提供替代品</td></tr><tr><td>精密擦拭纸巾</td><td>金佰利公司（Kimberley-Clark）</td><td>34256CT</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021-5KG</td><td>可由任意供应商提供替代品</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>饲喂针头</td><td>Cadence, Inc.</td><td>7910</td><td>金属材质；20 X1-1/2&quot; W/2-1/4；可高压灭菌</td></tr><tr><td>FITC-UEA-1</td><td>Sigma</td><td>L9006-1MG</td><td>其他荧光染料可选</td></tr><tr><td>FITC-WGA</td><td>Sigma</td><td>L4895-2MG</td><td>其他荧光染料可选</td></tr><tr><td>泡沫垫</td><td>Fisher</td><td>22038221</td><td>订购适合盒式夹具尺寸的泡沫垫</td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Sigma</td><td>47671</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MK881746</td><td>ACS 试剂，&gt;=99.5%</td></tr><tr><td>玻璃 Coplin 染色缸</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td>最多可并排容纳 10 张载玻片</td></tr><tr><td>组织学盒式夹具</td><td>Simport</td><td>M512</td><td>深型夹具，避免盲肠组织被压扁</td></tr><tr><td>杂交盖玻片</td><td>Sigma</td><td>GBL712222</td><td>无 RNase</td></tr><tr><td>杂交炉</td><td></td><td></td><td>可由任意供应商提供替代品</td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td></td><td></td><td>可由任意供应商提供替代品</td></tr><tr><td>Lee 培养基</td><td></td><td></td><td>按 Lee 等人 1975 年所述方法配制</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>179337</td><td>ACS 试剂，&gt;=99.8%</td></tr><tr><td>小鼠</td><td>查尔斯河实验室（Charles River Laboratories）</td><td>028</td><td>成年 BALB/c 小鼠；18–21 克（8–10 周龄）</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher</td><td>50-980-487</td><td>16% 溶液</td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Sigma</td><td>P3558-1KG</td><td>用于组织包埋的 Paraplast 石蜡</td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>加州大学旧金山分校细胞培养设施培养基生产部（UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit）</td><td>CCFAL003</td><td>无钙、无镁；可由任意供应商提供替代品</td></tr><tr><td>青霉素 G</td><td>Sigma</td><td>PENNA-100MU</td><td></td></tr><tr><td>沙保葡萄糖琼脂</td><td></td><td></td><td>可由任意供应商提供替代品</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Baxter</td><td>2F7123</td><td>无菌，可由任意供应商提供替代品</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>可由任意供应商提供替代品；保持无 RNase</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>可由任意供应商提供替代品；保持无 RNase</td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Sigma</td><td>S9137-100G</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP 笔</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td>可由任意供应商提供替代品</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>可由任意供应商提供替代品；保持无 RNase</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>不含 DAPI</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma</td><td>214736</td><td>试剂级</td></tr><tr><td>YEPD 培养基</td><td></td><td></td><td>可由任意供应商提供替代品</td></tr></tbody></table>

使用荧光原位杂交技术在小鼠胃肠道中可视化 candida albicans

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans 是人类及许多其他哺乳动物肠道微生物群中的真菌组分。尽管在大多数定植宿主中 C. albicans 不引起症状，但这种共生菌库仍可作为感染性疾病的储存源，且肠道内真菌高滴度与炎症性肠病相关。本文介绍一种在稳定胃肠道定植小鼠模型中可视化 C. albicans 细胞形态及其定位的方法。通过向经口服抗生素处理的动物单次给予 C. albicans 建立定植模型。肠道组织片段以特定方式固定，以保存管腔内容物（微生物和黏液）以及宿主黏膜的结构。最后，使用针对真菌rRNA的探针进行荧光原位杂交，以标记 C. albicans 及其菌丝。该方案的一个关键优势在于，能够在胃肠道定植过程中同时观察 C. albicans 的细胞形态及其与宿主结构的空间关系。

按照所提供的操作说明，该技术的结果将是宿主上皮、黏液以及胃肠道组织切片中 C. albicans 的细胞核呈现荧光标记。野生型 Candida albicans 细胞应表现为圆形的单细胞酵母形态，或为高度伸长、有时分枝的多细胞菌丝形态（菌丝中的细胞分裂不会明显可见）。C. albicans 的突变株还可能表现为较小、轻微伸长的“灰色”酵母，或较大、轻微伸长的“GUT”（胃肠道诱导转变）酵母或“不透明”（opaque）酵母。
图1展示了用于灌胃的喂食针，以及灌胃过程中针头的关键位置。图2展示了一种典型的小鼠器官解剖装置，以及小鼠胃肠道各段的外观。
图3 显示不同样本的FISH染色结果 C. albicans 体外扩增及小鼠模型中的细胞类型。 图3A 显示固定、通透处理的体外扩增菌丝的荧光与相差图像。菌丝形成通过液体Lee氏培养基诱导18 含2% N-乙酰葡萄糖胺，pH 6.8 37 °C. 图3B 显示固定、通透处理的体外扩增酵母细胞的荧光与相差图像。 图3C，D 分别显示固定并透化的体外扩增的GUT细胞和不透明细胞。GUT细胞与不透明细胞在形态上难以区分，仅在扫描电子显微镜下观察时可辨差异。请注意，若体外扩增的细胞透化不充分，荧光原位杂交（FISH）染色效果将不理想。图中示例为染色弱且弥散的情况。 图3C为了获得最佳结果，应针对每种待研究的细胞类型和物种，通过实验经验确定细胞固定和通透的条件。幸运的是，用于成像的推荐方案 C. albicans 在组织切片中可实现更一致的通透化效果。
图3E-G展示了小鼠大肠中的C. albicans，分别使用C. albicans特异性探针（图3E）或广谱真菌探针（图3F,G）进行染色。在这些图像中，C. albicans呈红色，宿主细胞核呈蓝色，黏液层呈绿色。大肠中同时存在圆形的酵母细胞和高度伸长的菌丝（白色箭头所示）。请注意，使用广谱真菌探针染色信号更强。图3G展示了在同一部位使用广谱真菌探针染色的ume6突变株。Ume6编码一种转录因子，在体外条件下是菌丝形成所必需的19。有趣的是，该突变株在体外表现出的酵母锁定表型在肠道内并未重现，提示宿主内可能存在冗余因子被激活12。图4展示了野生型C. albicans在小鼠胃肠道不同区段的形态，包括紧邻宿主黏膜的区域以及肠腔更中心的区域。
<img alt="啮齿类动物灌胃装置；注射器插入及给药过程，辅助口服物质递送。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：灌胃过程中关键的喂食针位置。（A）喂食针。（B）喂食针的球部插入舌侧。（C）喂食针保持直立并插入食管。（D）喂食针插入胃内，鼻部上方可见数毫米。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于按节段进行胃肠道分析的解剖装置，包含甲醇-乙酸-乙醇固定液（methacarn）、乙醇和组织包埋盒。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：解剖布局示例。（A）解剖板及工具。（B）完整取出的胃肠道。从近端（食管）到远端（肛门）依次为：I. 胃；II. 近端小肠；III. 中段小肠；IV. 远端小肠；V. 盲肠；VI. 大肠。粉红色虚线框标示需固定的组织区域。（C）组织在包埋盒中的摆放位置。罗马数字与B图中对应。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示蛋白质定位的细菌和细胞结构的荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：经FISH染色的 C. albicans代表性图像。 (A) 在含2% N-乙酰葡糖胺、pH 6.8的液体Lee’s培养基中培养的C. albicans菌丝的FISH染色结果18。(B) 在YEPD + 2% 琼脂平板上培养的C. albicans圆形酵母细胞的FISH染色结果。(C) 在YEPD + 2% 琼脂平板上培养的C. albicans GUT细胞（ySN1045）的FISH染色结果。(D) 在YEPD + 2% 琼脂平板上培养的C. albicans不透明细胞的FISH染色结果。(E) 大肠中的野生型C. albicans（ySN250），使用C. albicans特异性探针染色。(F) 大肠中的野生型C. albicans，使用广谱真菌探针染色。(G) 大肠中的Ume6突变株（ySN1479），使用广谱真菌探针染色：红色为C. albicans，蓝色为宿主上皮细胞核，绿色为黏蛋白。箭头表示菌丝，箭头指示酵母细胞。比例尺 = 20 µm。图像F和G改编自Witchley等人的研究12。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="原位荧光显示静态肠道微生物群；示意图；消化道中的上皮和管腔区域。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：FISH染色的 C. albicans 在不同肠道区段中的形态。 显示野生型 C. albicans 在小鼠胃肠道各指定区段的分布情况。在每个区室中，图像分别展示邻近宿主黏膜的区域以及肠道管腔的中央区域。染色使用广谱真菌探针进行。比例尺 = 20 µm。图像改编自Witchley等12。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">抗生素储备液（200倍）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素G</td>
			<td>181 mg/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>链霉素</td>
			<td>400 mg/µL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Methacarn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>储备液</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>体积</td>
			<td>单位</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甲醇</td>
			<td>60%</td>
			<td>300</td>
			<td>mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯仿</td>
			<td>30%</td>
			<td>150</td>
			<td>mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>冰醋酸</td>
			<td>10%</td>
			<td>50</td>
			<td>mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">杂交溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>储备液</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>体积</td>
			<td>单位</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 7.4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>20</td>
			<td>µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>0.9 M</td>
			<td>180</td>
			<td>µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10</td>
			<td>µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% 甲酰胺</td>
			<td>1.00%</td>
			<td>10</td>
			<td>µL（使用间保存于-20 °C，分装小份）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无RNase水</td>
			<td></td>
			<td>780</td>
			<td>µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">FISH洗涤液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 7.4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>1</td>
			<td>mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>0.9 M</td>
			<td>9</td>
			<td>mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无RNase水</td>
			<td></td>
			<td>40</td>
			<td>mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">黏蛋白-细胞核染色液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, 10 µg/mL</td>
			<td>20 ng/mL</td>
			<td>2</td>
			<td>µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>凝集素, 40 µg/mL</td>
			<td>1.6 µg/mL</td>
			<td>40</td>
			<td>µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td>958</td>
			<td>µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本实验方案中常用溶液的体积与浓度。

本实验方案的目的是在哺乳动物胃肠道中观察白色念珠菌（Candida albicans）的细胞形态及其定位。

使用荧光原位杂交技术在小鼠胃肠道中可视化 Candida albicans

白色念珠菌是人类及许多其他哺乳动物肠道微生物群中的真菌组分。尽管白色念珠菌在大多数情况下不会引起症状……

该方案为我们迄今为止理解白色念珠菌如何定植于哺乳动物胃肠道提供了部分最佳见解。例如，直到最近，我们尚不清楚白色念珠菌在肠道内的具体定位，也不了解其众多形态形式中哪一种存在于这一生态位中。该技术的主要优势在于，它能够在不破坏真菌与宿主结构或与微生物群中细菌之间三维相互作用的前提下，实现对白色念珠菌在其自然环境中的可视化观察。由于肠道环境十分复杂，在实验室中对其进行建模非常困难，因此能够找到一种直接在宿主模型中研究白色念珠菌生物学特性的方法令人十分满意。包括白色念珠菌（Candida albicans）在内的某些肠道微生物组分被认为可能在炎症性肠病等疾病中发挥作用。该技术有望用于诊断从患者获取的活检标本中特定微生物的存在。掌握灌胃技术和在不撕裂器官的情况下解剖胃肠道节段的能力，对于获得最佳实验结果至关重要。首先，根据计算出的剂量，对每只动物进行指定接种物的灌胃。将已灭菌的动物喂食针头连接至1毫升注射器，并用注射器吸取一次灌胃所需的体积，确保排尽所有气泡。将注射器置于无菌表面。固定动物时，用惯用手抓住动物尾根部，用非惯用手沿动物背部向前滑动，捏住耳后方的松弛皮肤。用拇指和食指将颈背部皮肤紧紧捏成一撮。用一只手抓住动物颈背部的皮肤，将其翻转，并用同一只手的小指勾住尾巴，使动物固定在手掌中。轻轻拉伸动物头部，使其与身体呈一条直线。然后用惯用手拿起注射器，将其垂直于动物身体持握，弯曲的针头朝下。使用针头的球状端轻轻钩住口腔内侧的角落，沿口腔侧壁将针头推进至咽喉后部，然后将针头移至中央位置。当针头球端到达动物咽喉后部时，将针头向上倾斜，使其与动物身体的轴线平行，并使其顺滑地滑入食道。如果针头无法顺利滑入咽喉，可能是位置不当，应撤回针头，重新调整位置后再尝试。轻柔推进针头，使动物将针头吞入，直至仅剩几毫米可见。通过轻轻推动推杆来检测针头球部是否位于胃内，若无阻力，继续注入接种物。接种物注射完毕后，缓慢拔出针头，并将动物放回笼中。继续观察动物5到10分钟，注意是否有呼吸困难或痛苦的迹象，并确认其在灌胃后不久恢复正常的活动状态。如果下一动物将使用相同的接种物，请用酒精棉片清洁针头。如果使用不同的接种物，则应更换针头。使用钝头镊子夹住腹部皮肤的一段，用剪刀在靠近骨盆底部处切开皮肤及皮下筋膜。沿腹膜腔两侧呈U形向上延伸切口至肋骨区域，然后将皮肤掀开暴露术野。用钝头镊子轻轻夹住盲肠并将其从腹膜腔中拉出，同时使用剪刀切断盲肠与小肠及大肠之间的连接组织。将整个盲肠放入组织学包埋盒中，确保其未扭曲并平铺放置。在上方放置第二块泡沫垫，然后盖上包埋盒。随后将包埋盒放入装有甲醇-卡诺固定液（methacarn）的螺旋盖瓶中。切除含有一个至两个粪便颗粒且长度小于包埋盒的大肠节段。将组织放入包埋盒中，保持其平整且无扭曲。覆盖第二块泡沫垫，盖上包埋盒，并将其置于甲醇-乙酸-乙醇固定液（methacarn）中。对于需要取样的每一段小肠，切除包含部分消化物的1至2厘米肠段。将组织放入包埋盒中，覆盖第二块泡沫垫，盖上包埋盒盖子，并将其置于甲醇-乙酸固定液（methacarn）中。切除胃时，需切断其与食管和小肠的连接。将组织放入包埋盒中，并将包埋盒置于甲醇-氯仿-乙酸固定液（methacarn）中。室温下在固定液中浸泡至少三小时，但不超过两周。固定完成后，取出泡沫垫，并将每块完整的组织切片放回其对应的包埋盒中。然后用100%甲醇清洗组织两次，每次35分钟；再用100%乙醇清洗两次，每次25分钟；最后用二甲苯清洗两次，每次20分钟。将包埋盒在纸巾上轻轻吸干，放入预熔的石蜡中，在70摄氏度的杂交炉中孵育两小时。随后将包埋盒从石蜡中取出，让多余的石蜡流尽，并在室温下保存，直至包埋于石蜡块中。将载玻片插入盛有二甲苯的预热容器中，以脱去石蜡包埋的组织切片中的石蜡。在60摄氏度下孵育10分钟，然后弃去二甲苯溶液。向容器中加入新鲜的室温二甲苯，重复孵育步骤。然后用100%乙醇充满容器，并在室温下孵育5分钟。孵育结束后，将玻片从容器中取出，空气干燥。为了用FISH探针对白色念珠菌（C.albicans）进行染色，首先使用Pat Pen在组织切片周围画一个圆圈。用移液器吸取50 µL含有杂交液的探针，滴加到固定组织上，并用移液器吸头轻轻铺匀。用杂交盖玻片覆盖液体，注意避免产生气泡。然后将切片密封于防水的杂交盒中，在杂交炉内避光、50 °C条件下孵育3小时。孵育结束后，将洗涤液加入考普林罐中。用镊子小心地从载玻片上取下盖玻片，并将载玻片放入洗涤液中。用铝箔覆盖罐子，在50摄氏度下孵育20分钟。接着，倒出清洗液，向玻片缸中重新加入 PBS 进行清洗。立即倒掉 PBS 并更换新鲜 PBS，重复此步骤，共清洗两次。用无尘擦拭纸吸去 PBS，然后用防水标记笔在肠组织切片周围画圈。将切片放入不透明的塑料容器中，并向组织切片区加入50微升黏蛋白核染色液。用铝箔覆盖容器，在4摄氏度下孵育45分钟。孵育结束后，将切片放入考普林瓶中，用PBS洗涤两次。用纸巾轻轻吸去多余的 PBS，再用擦镜纸吸走最后的液滴。在每个样本上滴加一滴封片剂，盖上玻璃盖玻片，注意避免产生气泡。让封片剂在盖玻片下充分展开。用指甲油在盖玻片四角固定，然后使用荧光显微镜观察载玻片。该方案可用于在体外及宿主组织中对白色念珠菌（C. albicans）进行荧光标记。体外培养的菌丝、圆形酵母细胞、肠道细胞以及不透明细胞经固定、通透处理后，通过荧光显微镜和相差显微镜加以区分。在小鼠大肠中观察到圆形酵母细胞和高度伸长的菌丝。宿主组织使用针对白色念珠菌的特异性探针或广谱真菌探针进行染色。白色念珠菌呈红色，宿主细胞核呈蓝色，黏液层呈绿色。在小鼠胃肠道的不同节段中均检测到白色念珠菌，包括紧邻宿主黏膜的区域以及肠道管腔更中央的区域。对于此前未进行过灌胃操作的科研人员而言，在尝试该方法前接受专门培训至关重要。在完成鱼类染色后，可采用免疫荧光技术对宿主黏膜的其他特征进行染色。这有助于表征宿主的组织损伤或免疫反应。该技术使我们能够进一步阐明白色念珠菌突变体的真菌细胞形态与在宿主体内存活能力之间的关系，从而加深对白色念珠菌生物学的理解，在开发治疗策略时可加以利用。

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