Name: 在Vivo光学钙成像学习诱导突触可塑性在果蝇黑色素增生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 学习在体光学钙成像技术，用于研究黑腹果蝇学习诱导的突触可塑性。该方法结合经典嗅觉条件反射，实时观察突触钙动态，揭示记忆形成的细胞机制。

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本工作由德国研究基金会通过合作研究中心SFB 889&#34;感觉信息处理机制&#34;以及研究单位FOR 2705&#34;脑回路解析：Drosophila蘑菇体的结构、可塑性及行为功能&#34;资助。

1. 转基因果蝇，Drosophila melanogaster
<ol>
	<li>将携带目标 Gal4 和 UAS 构建体的雌性处女蝇与雄性果蝇（均在 25 °C、60% 相对湿度、12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下培养）进行杂交25，以获得特定目标神经元表达遗传编码钙指示剂的果蝇。</li>
	<li>将上述杂交所得的雌性子代培养至羽化后 3–6 天龄。优先选用雌性果蝇，因其体型略大。</li>
</ol>
2. 果蝇活体钙成像的准备工作
<ol>
	<li>选取一只雌性果蝇，置于冰上麻醉，时间不超过5分钟。</li>
	<li>使用精细镊子将果蝇放入成像室中（如图1c所示）。确保果蝇的胸部和腿部与室底部的电线接触，并使头部平放。用透明胶带固定果蝇位置。 
	注意：本实验方案需要使用定制的成像室，该成像室可固定果蝇，使其头囊暴露以便操作，同时允许气味刺激传递至触角，并对胸部和腿部施加电击（图1）。</li>
	<li>使用安装在手术刀柄上的外科刀片（见材料表），在果蝇头部周围的胶带上切出一个窗口，保留触角覆盖，仅暴露胸部最前端部分。</li>
	<li>用蓝光固化胶围绕果蝇头部的侧面和后部进行封固，使用凹凸钳夹持昆虫针小心操作。使用蓝光LED灯照射使胶体固化。</li>
	<li>检查胶体是否完全固化，并清除果蝇头部背侧残留的未硬化胶体。</li>
	<li>滴加一滴任氏液24（见材料表），覆盖暴露的头部角质层。</li>
	<li>使用极细刃的刺切刀片切开角质层。为最有效地去除角质层，首先以单眼为起点，在头部后端横向切割；然后沿眼睛内侧向上两侧切割，形成一个可被镊子轻松撕除的角质层瓣。</li>
	<li>移除可能遮挡目标脑区的多余角质层。</li>
	<li>使用精细镊子小心清除脑组织背侧表面的任何气管，避免损伤脑组织本身。根据需要移除并更换任氏液24（见材料表），以清除组织碎片，保持视野清晰。</li>
	<li>将皮下注射式气味递送针头置于距果蝇头部约1 cm的位置。确保无任何物体阻碍气味向触角的传递。</li>
	<li>在显微镜下，通过皮下注射式气味递送针头将成像室连接至气味递送系统。</li>
	<li>为使果蝇充分从麻醉和手术中恢复，并适应气流环境，此阶段需进行10分钟的静息期。</li>
</ol>
3. 体内钙成像
<ol>
	<li>使用配备有红外激光器和水浸物镜的多光子显微镜（参见材料表），并将显微镜安装在防震台上。为观察基于GFP的钙指示剂，将激光器调至920 nm的激发波长，并安装GFP带通滤光片。</li>
	<li>使用粗调Z轴旋钮，沿脑组织的Z轴方向进行扫描，定位目标脑区。使用裁剪功能，将扫描范围聚焦于该区域以缩短扫描时间，并旋转扫描视野，使头部前部朝下。</li>
	<li>将帧尺寸调整为512 × 512像素，扫描速度设为&#62; 4 Hz，并调整扫描区域（Y方向），确保覆盖目标神经元。</li>
</ol>
4. 通过嗅觉条件化观察气味诱发的钙瞬变
<ol>
	<li>使用一种能够以时间精确方式递送多种气味刺激的气味递送系统19,26。
	<ol>
		<li>使用一台额外的计算机来控制该设备，并与成像显微镜软件通信，以在实验过程中协调气味刺激与图像采集。</li>
		<li>启动一个预编程的宏程序包（例如安装在显微镜控制软件中的VBA宏程序包，参见材料表），该程序包能够连接图像采集软件和气味递送程序，并对外部输入触发信号作出响应（该信号由另一个程序中启动气味递送协议时提供）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以512 × 512像素的分辨率和4 Hz的帧率，开始监测&#34;训练前&#34;/未经训练的果蝇对气味刺激引发的钙瞬变。递送持续2.5秒的气味刺激，在气味开始前额外采集6.25秒的图像（以建立F0基线值），并在气味结束后再额外采集12.5秒的图像。依次对第二种和第三种气味分子重复此过程。</li>
	<li>在此测量结束后继续进行3分钟的经典条件化训练（&#34;训练&#34;）。
	<ol>
		<li>从&#34;训练前&#34;阶段呈现的气味中选择一种作为CS+气味，另一种作为CS-气味。使用计算机控制的气味递送系统呈现CS+气味，持续60秒，同时施加12次90 V的电击。</li>
		<li>在60秒的间歇后，单独呈现CS-气味60秒。使用的气味分子为4-甲基环己醇和3-辛醇。在训练阶段不呈现第三种气味分子（例如1-辛烯-3-醇），因其仅在训练前（步骤4.2）和训练后（步骤4.4）作为对照使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在完成训练阶段（步骤4.3）3分钟后，再次重复&#34;训练前&#34;的气味刺激方案（步骤4.2），测量&#34;训练后&#34;的气味诱发钙瞬变。 
	注：此步骤的时间点应反映记忆形成后感兴趣的时间（例如，在条件化步骤后3–4分钟执行此步骤以研究短期记忆）。通常，果蝇在此制备状态下可存活数小时。</li>
	<li>将成像文件以适当格式（例如Tiff）保存，以便后续进行图像分析。</li>
</ol>
5. 图像分析
<ol>
	<li>为分析图像，请在图像分析软件（如 Fiji）中打开 Tiff（或类似）文件27。</li>
	<li>使用运动校正算法对图像序列进行对齐，以确保 X 和 Y 方向的移动最小化。若记录在 Z 轴方向显示明显移动，则应舍弃该记录。</li>
	<li>选择软件中的工具，在待检测区域周围标记感兴趣区域（ROI）。标记应尽可能精确，以减少背景荧光的干扰。</li>
	<li>使用软件相应工具从选定的 ROI 中提取时间序列荧光强度数据，生成每个记录帧对应的数据值文件。</li>
	<li>使用数据分析程序打开数据，计算每条气味响应曲线的 ΔF/F0 值。其中 F0 表示气味刺激开始前 2 秒内的平均荧光强度，ΔF 表示某一帧原始荧光强度与 F0 的差值。基于这些数值，计算每一帧的 ΔF/F0 值，并将其对时间作图，以反映气味刺激期间相对荧光强度的变化。</li>
</ol>

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<li>Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+calcium+imaging+using+DNA-encoded+fluorescence+sensors+in+transgenic+fruit+flies%2C+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster.</a> Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

解析学习与记忆背后的神经环路是神经科学领域的一个重要目标。其遗传可及性 果蝇 行为测试的广泛性和便捷性使其成为研究此类现象的理想工具。本文介绍了一种方法，可实现对单个果蝇在嗅觉条件化过程中发生的亚细胞水平调控进行可视化观察。通过开展训练前和训练后的气味诱导钙动力学成像，该方法最初由本研究团队建立。17，可以在同一动物体内直接比较对新异气味和习得气味的反应，从而研究目标神经元的可塑性。这使得本方案相较于其他方法具有优势 大规模 评估（用于经典的嗅觉条件反射实验），因为可以在个体水平上对训练前和训练后的状态进行定量评估，从而能够确定个体间的差异。此外，在显微镜下直接进行的训练程序在很大程度上等同于行为实验中常用的经典嗅觉条件反射范式，且不涉及人工的光遗传学神经刺激。当然，操作小型果蝇、在不损伤脑组织的同时精细地打开头壳并保持感觉器官完整，需要经过细致而反复训练才能获得的专业技能，这一点与电生理学等生理学评估技术所要求的熟练程度相似。
此外，还展示了利用局部钙指示剂在单个神经元水平上研究可塑性的潜力——这...

阐明信息在大脑中通过学习获取的位置和方式，并随后作为记忆存储，是神经科学领域最具挑战性的任务之一1。神经科学研究提出了突触传递的改变是学习与记忆形成神经基础的概念2,3。人们假设，在学习过程中，参与感知刺激时活跃的神经元集合之间的突触连接会发生改变，使得其联合活动模式可在记忆提取期间被重新激活，从而指导未来的行为反应4。这些&#34;记忆印迹细胞&#34;及其突触通常分布在不同的脑区和信息处理层级中，这使得难以将观察到的突触传递变化明确归因于特定任务或刺激的学习过程。为了定位并可视化那些与特定学习任务具有因果关联的突触变化，需要一个合适的模型系统，能够精确限定相关突触的位置。
对于此类研究，Drosophila melanogaster 尤为合适，因为它兼具相对简单的脑结构、丰富的行为表现以及良好的实验可操作性。在已确立的模式生物中，Drosophila 的神经复杂性介于线虫 C. elegans 与可进行遗传操作的哺乳动物（如小鼠）之间。C. elegans 具有固定数量的神经元（约300个）和有限的行为谱。而哺乳动物则拥有数以百万计的神经元以及极为复杂的行为能力。果蝇的脑包含约100,000个神经元，显著小于大多数脊椎动物的脑，且其中许多神经元可被单独识别5。然而，Drosophila 能表现出广泛而复杂的行为，包括强大的联想性嗅觉学习与记忆形成能力，该能力最早在40多年前即被描述6。在这一经典条件反射实验过程中，将一群果蝇暴露于一种气味作为条件刺激（CS+），同时给予电击作为非条件刺激（US）；随后再呈现另一种气味（CS-），但不伴随任何惩罚。通过这种方式，动物学会回避与惩罚相关联的气味，这种学习效果可在后续的双选实验中进行检测，即让果蝇在两种气味 CS+ 与 CS- 之间做出选择。针对 Drosophila 中该行为背后的神经基础的研究已确定，蘑菇体（MB）是记忆“印迹”（&#34;engram&#34;）形成的主要脑区7,8,9,10，因此，该脑区的神经环路一直是深入研究的重点，旨在揭示记忆印迹是如何被获取与存储的（近期综述见11,12）。
Drosophila 的蘑菇体（MB）每半球包含约 2,000 个内在神经元（Kenyon 细胞），这些神经元的轴突呈平行排列13。嗅觉投射神经元的轴突延伸至外侧前脑和蘑菇体的萼部，后者是蘑菇体的主要树突输入区域，并接收来自触角叶的嗅觉输入。Kenyon 细胞的长而平行的轴突束构成柄部和叶状结构。大多数 Kenyon 细胞发生分支，其中一条侧支向脑中线延伸，形成水平方向的 β/β' 叶，另一条侧支向背前方向延伸，形成垂直方向的 α/α' 叶。另一类 Kenyon 细胞则形成蘑菇体的水平 γ 叶13，学习过程及随后的短期记忆形成可能定位于此区域10。蘑菇体的叶状结构既接收传入输入，也发出传出输出，这两类连接通常局限于 Kenyon 细胞轴突上的特定区室化亚区域14,15,16。特别是，已发现传入的多巴胺能 MB 输入神经元在关联性嗅觉学习中介导基于价值的、例如惩罚性的强化效应15,17。从蘑菇体叶发出的具有刻板模式且可个体识别的传出输出神经元，整合大量 Kenyon 细胞的信息，投射至多个不同的脑区，并携带指导行为的趋近性或回避性信息15。这种神经结构启发了关于关联性记忆印迹组织方式的概念：气味通过稀疏激活的 Kenyon 细胞群体实现相对精确的编码；当这些 Kenyon 细胞群体的活动与由惩罚性刺激诱发的多巴胺释放同时发生时，会调节 Kenyon 细胞突触前膜到蘑菇体输出神经元之间的信号传递，从而使动物在后续行为中回避该特定气味10,12。我们利用这一相对精确且定位明确的记忆印迹作为典型范例，说明如何测定并监测这些依赖学习的突触活动变化。
该值的 果蝇 作为一种模式系统，其高度依赖于无与伦比的遗传工具箱，该工具箱可实现外源基因的表达，从而在复杂神经回路中对单个神经元进行识别、监测和操控18神经元活动监测技术（例如本文讨论的钙成像）的发展使得研究人员能够确定神经元在特定刺激下的活动模式。通过将特异性的Gal4驱动的遗传编码钙指示剂（GECIs）表达与嗅觉刺激相结合，可以可视化目标神经元在气味刺激下引发的钙动力学变化19在本实验方案中，通过将该技术与经典条件反射范式相结合，可在学习背景下研究这些嗅觉反应。利用基因编码的钙离子指示剂（GECIs），不仅可将学习诱导的可塑性限定于特定单个神经元，还可进一步限定于神经元的特定亚区室。Pech 等。20 建立了一套工具，可实现这一目标。通过靶向 GCaMP321 通过与脊椎动物突触素（Synaptophysin）的连接，靶向突触前或突触后成分 dHomer，分别地20- 这些位点的差异性调节可以被区分。这种定位在此背景下相较于大多数在胞质溶胶中广泛分布的GECI（例如GCaMP）具有优势22，GCaMP321，或 GCaMP623 - 因为这可以区分出突触前和突触后瞬时信号与神经元激活所引起的整体整合性钙内流。这有助于揭示学习与记忆形成过程中发生或引发的突触可塑性的位置与类型。例如，本文提供的实验方案展示了该工具的价值：通过将钙离子传感器特异性地表达于突触后，解析在嗅觉关联学习过程中蘑菇体输出神经元的调控机制。在单个果蝇中，通过监测嗅觉训练前后气味诱发的神经活动，可直接比较对气味的 naïve 反应与习得性反应。果蝇被固定在同一成像室中，先后暴露于多种不同气味；随后接受厌恶性关联训练，其中某一种气味与电击配对（成为条件刺激，CS）+）并呈现另一种无强化的气味（成为条件刺激，CS）-最后，将果蝇再次暴露于与第一步相同的气味中。使用双光子显微镜观察钙动力学变化。

<table><tbody><tr><td>1-辛烯-3-醇</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>O5284</td><td>用作气味剂的化学物质</td></tr><tr><td>3-辛醇</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>218405</td><td>用作气味剂的化学物质</td></tr><tr><td>4-甲基环己醇</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>153095</td><td>用作气味剂的化学物质</td></tr><tr><td>EGFP带通滤光片（525/50 nm）</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明胶带</td><td>Tesa SE, Norderstedt, Germany</td><td></td><td>标准透明胶带</td></tr><tr><td>凹凸钳口</td><td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td><td>10053-09</td><td>带凹凸钳口的刀片夹持器</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td><td>11412-11</td><td>尖端尺寸为0.1 × 0.06 mm的镊子</td></tr><tr><td>皮下注射针头</td><td>Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany</td><td>4665120</td><td>1.20×40 mm</td></tr><tr><td>昆虫细针</td><td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td><td>26002-10</td><td>直径0.1 mm，尖端0.0125 mm</td></tr><tr><td>Kentoflow</td><td>Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK</td><td>953683</td><td>蓝色光固化胶水</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Carl Roth GmbH &amp; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>0656.1</td><td>标准载物片 76 × 26 mm</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>M8410</td><td>用作气味剂的稀释剂</td></tr><tr><td>锁模钛宝石激光器 Chameleon Vision 2</td><td>Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>可调谐红外飞秒激光器</td></tr><tr><td>配备BiG探测器的多光子显微镜LSM 7MP</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td><td></td><td>多光子显微镜，多家公司提供类似设备</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20x（NA = 1.0）水浸物镜</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td><td>421452-9900-000</td><td>物镜 W &quot;Plan-Apochromat&quot; 20x/1.0 DIC M27 70mm</td></tr><tr><td>Ringer溶液</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>5 mM KCl, 130 mM NaCl, 2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5 mM Hepes-NaOH, 36 mM 蔗糖, pH = 7.4</td></tr><tr><td> stab刀</td><td>Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA</td><td>72-1551</td><td>5.0 mm直形限深刀片</td></tr><tr><td>外科手术刀片</td><td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td><td>0303</td><td>产品编号 11</td></tr><tr><td>外科手术刀柄</td><td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td><td>0907</td><td>产品编号 7S/S</td></tr><tr><td>Visual Basic for Applications (VBA) 软件，用于接收来自气味递送装置和电刺激装置（电源）的触发信号&lt;br/&gt;，以与控制显微镜的蔡司ZEN软件进行交互&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;</td><td>定制编写，可根据要求提供</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td></tr></tbody></table>

在体光学钙成像观察学习诱导的突触可塑性在 drosophila melanogaster 中的研究

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

几十年来，对多种模式生物的研究已形成了当前关于突触可塑性在学习与记忆形成中起基础作用的概念。由学习引发的突触传递改变通常分布在大脑的众多神经元及多个信息处理层级中。因此，亟需能够在神经元群体中可视化学习依赖性突触可塑性的方法。果蝇 黑腹果蝇 是研究学习相关神经回路的极具优势的模式生物。本文所述方案展示了一种在体监测联想性嗅觉记忆形成过程的方法，即可实时观察突触活动及其变化。利用该生物体系中丰富的遗传学工具 果蝇可以特异性地在特定细胞群体甚至单个细胞中表达基因编码的钙指示剂。通过固定果蝇并打开其头壳，可在给予嗅觉刺激的同时观察这些细胞中的钙动力学变化。此外，我们还展示了一种实验装置，可同时对果蝇身体施加电击。该系统使得果蝇在经历经典嗅觉条件化训练——即原本中性的气味通过与电击惩罚关联而被习得——的同时，利用双光子显微镜实时观察该气味（以及其他未经训练的气味）在脑内的神经表征。本实验室先前已报道了突触定位钙传感器的构建，使得荧光钙信号可被限制于突触前或突触后区室。双光子显微镜能够实现精细结构的空间分辨。我们以整合蘑菇体信息的神经元为例进行说明，蘑菇体是昆虫脑中的高级神经中枢。总体而言，本实验方案提供了一种方法，用于研究在嗅觉学习过程中因神经元活动改变而发生的突触连接变化。

使用上述方案获取的图像示例如图2所示。dHomer-GCaMP3在一种蕈形体输出神经元中表达，该神经元的树突支配蕈形体γ叶的第1区室（该神经元称为MVP228,29），并通过split-Gal4品系MB112C16实现遗传靶向。此外，图中还展示了细胞质钙指示剂与突触后特异性定位钙指示剂在亚细胞定位上的差异。比较图2a与图2f可明显观察到dHomer-GCaMP3传感器14具有特异性的区室化表达——在神经元的轴突区室中无表达，而在树突区室中可见点状信号。在表达dHomer-GCaMP3的果蝇中（图2，下层面板），可以观察到清晰但幅度较低的气味反...

本文介绍了一种可在果蝇（Drosophila）学习与记忆过程中可视化突触前和/或突触后钙信号的实验方案。该方法结合了定位于突触的钙离子传感器进行活体钙成像，并采用经典的嗅觉条件化范式，从而能够揭示此类联想学习背后的突触可塑性机制。

在体光学钙成像观察学习诱导的突触可塑性在 Drosophila melanogaster 中的研究

多年来，对多种模式生物的研究已形成了当前关于突触可塑性是学习和记忆形成基础的概念。

该技术可实时观察黑腹果蝇中突触钙活动，以此作为学习与记忆形成相关细胞过程的生理参数。通过比较果蝇在关联训练前后对气味的神经元反应，我们能够直接关联突触活动与单个果蝇中记忆痕迹的形成。为获得转基因果蝇，使特定目标神经元表达基因编码的钙指示剂，需将携带目标GAL4和UAS构建体的雌性处女蝇与雄蝇杂交，并将雌性子代培养至羽化后3至6天。为准备果蝇成像，使用精细镊子将经冰麻醉的果蝇放入定制的成像室中。在解剖显微镜下调整果蝇胸部和足部，使其与成像室底部的金属导线接触，并使头部平躺。用透明胶带将果蝇固定在位，再使用外科手术刀片在头部周围的胶带上切出一个窗口，保留触角被胶带覆盖，仅暴露胸部最前端的部分。使用由凹凸钳夹持的昆虫针，将蓝色光固化胶小心地围绕果蝇头部的侧面和背面。然后使用蓝色LED灯照射以固化胶水。待胶水完全固化后，清除果蝇头部背侧残留的未硬化胶水，并在头部暴露的角质层上滴加一滴林格氏液。使用刃口极细的刺刀，从后头的单眼处开始，沿头部后部切开角质层，并沿眼内侧向上两侧切割，形成一个可用镊子轻易撕去的角质层瓣。去除可能遮挡目标脑区的多余角质层，并用精细镊子小心清除背侧表面的任何气管，注意避免损伤脑组织本身。根据需要移除并更换任氏液，以清除区域内的组织碎片。将一根皮下注射式气味递送针头放置在果蝇头部约一厘米处，注意确保没有任何物体阻碍气味传递至触角。然后通过该皮下注射式气味递送针头将成像室与气味递送系统连接。让果蝇恢复10分钟，以从麻醉和手术中苏醒。为了可视化基于GFP的钙离子指示剂，调节安装在防震台上的多光子显微镜的激光器，该显微镜配备红外激光器和水浸物镜，将激发波长调至920纳米，并安装GFP带通滤光片。使用粗调Z轴调节旋钮，沿脑组织的Z轴方向扫描，以定位目标脑区。利用裁剪功能将扫描范围聚焦于目标区域，以缩短扫描时间。然后旋转扫描视图，使头部的前部朝下。接着将帧大小调整为 512 × 512 像素，并选择待扫描的区域。根据每帧的计算扫描时间，确保帧速率达到至少 4 赫兹。为了观察气味诱发的钙瞬变，启动一个预设的宏程序包，该程序包能够连接图像采集软件与气味递送程序，并在显微镜软件中开始持续6.25秒的测量，以建立F0基线值。在气味递送系统中，递送持续2.5秒的气味刺激，此处通过特定气味杯阀门开启和关闭时触发LED灯亮起作为指示。气味刺激结束后，继续记录12.5秒。然后以相同方式重复递送第二种和第三种气味物质。在此装置中进行关联性条件化时，使用计算机控制的气味递送系统，在60秒内呈现条件刺激-阳性气味，同时施加12次90伏电击。经过60秒的间歇后，单独呈现条件刺激-阴性气味60秒，不施加电击。在训练阶段结束后三分钟，通过重复训练前的气味刺激方案，再次测量训练后气味诱发的钙瞬变。然后将成像文件以适当的格式保存，用于后续图像分析。此处可观察到按照上述方法获取的代表性蘑菇体输出神经元图像。特异性定位于区室的 dHomer-GCaMP3 传感器在神经元的轴突区室中不表达，因此在树突区室中呈现出点状信号。在表达 dHomer-GCaMP3 的果蝇中，尽管信号幅度较低，但仍可观察到清晰的气味反应，而相比之下，表达胞质 GCaMP6f 的果蝇则表现出更强的响应。此处展示了一只单个果蝇的代表性钙信号轨迹，反映了不同个体样本之间在噪声水平和信号幅度上可能存在的差异。该技术使得在亚细胞水平上观察嗅觉表征如何被调节，以及记忆阶段如何通过条件刺激形成成为可能。这类实验对于拓展我们对复杂脑结构（如蘑菇体）的理解，以及阐明关联性记忆如何在分布式的神经元群体中存储至关重要。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在Vivo光学钙成像学习诱导突触可塑性在果蝇黑色素增生

我们介绍一种已建立的技术，用于测量和分析活体黑腹果蝇（Drosophila...

Drosophila 嗅觉中枢对气味刺激反应的钙成像

本视频介绍 体内 钙成像在 果蝇...

Drosophila 体内 钙成像：神经元活动功能成像的一种方法

本视频演示了一种利用突触定位的钙离子传感器在果蝇中进行体内钙成像的方法。内容涵盖了为显微镜观察准备果蝇、实施嗅觉条件化训练以及可视化气味诱导的钙离子内流的各个步骤。...

体内钙成像利用突触定位钙传感器在黑腹果蝇中的应用

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离体钙成像研究Drosophila脑对神经肽的反应

来源： Lark, A. R., et. al.，基于生物发光钙指示剂GFP-aequorin的活体功能脑成像方法。 J. Vis. Exp.

用于研究钙瞬变的生物发光成像 果蝇 脑结构

本文描述了一种可调节的 离体 Ca成像的实验方案2+ 卵子激活过程中 果蝇.

成像钙离子 果蝇 在卵子激活时

本文展示了如何在活体运动神经末梢上进行单分子光激活定位显微镜成像 黑腹果蝇...

体内 果蝇运动神经突触前末梢的单分子示踪

在此，我们介绍一种实验方案 离体 在表达GCaMP6的成年个体中进行钙成像 果蝇 以监测癫痫样活动。该方案为研究成人中的发作事件提供了一种有价值的工具 果蝇 通过 离体...

Ex Vivo 钙成像用于癫痫的Drosophila模型

钙成像方法能够记录在向喙器施加溶液时清醒果蝇大脑中由味觉诱导的反应。以黑腹果蝇（Drosophila...

体内 钙成像技术用于研究成年 Drosophila 味觉诱导的神经反应

研究学习和记忆等认知过程中细胞活动的一个重要障碍是使用麻醉剂 体内 成像前准备。麻醉在多种模型中会损害短期记忆和认知功能，包括 果蝇 本研究介绍了一种制备成年 果蝇 用于 体内 无麻醉成像...

在活体成像未麻醉的果蝇成虫中的神经活动

我们介绍了利用表面组织粘合剂固定样品，对Drosophila幼虫嗅觉神经元进行钙成像的实验方案。该方法提高了实验稳定性，有助于开展可靠的活体（in-vivo）和离体（ex-vivo）实验。通过定制的R语言脚本分析钙信号，为深入的神经生理学研究提供了高效平台。...

体内与离体条件下对三龄Drosophila melanogaster幼虫嗅觉环路神经元的钙成像

学习在体光学钙成像技术，用于研究黑腹果蝇学习诱导的突触可塑性。该方法结合经典嗅觉条件反射，实时观察突触钙动态，揭示记忆形成的细胞机制。

在体光学钙成像观察学习诱导的突触可塑性在 Drosophila melanogaster 中的研究

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