Name: 在五个脊椎动物群中可靠隔离中枢神经系统微血管 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 了解中枢神经系统微血管分离技术，用于神经科学研究，可在一天内完成，无需超速离心或酶解。该方法适用于五种脊椎动物群，支持比较不同脑区微血管结构。

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Cruz-Orengo 博士获得了加州大学戴维斯分校兽医学院启动资金的支持。

本研究的所有操作均遵循加州大学戴维斯分校（UC）动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指南。加州大学戴维斯分校的动物护理由多个独立机构监管，并自1966年以来一直获得国际实验动物评估和认证协会（AAALAC）的全面认证。猪的中枢神经系统（CNS）组织来自加州大学戴维斯分校动物科学系肉类科学实验室。猕猴的中枢神经系统（CNS）组织来自加州国家灵长类研究中心病理学部门（NIH P51OD011107）。实验室工作人员未对猪和猕猴实施任何麻醉、安乐死或尸检操作，因此在这些方面无特殊建议。
注意：该方法已针对多个物种进行了验证，但所提供的实验方案更直接适用于小鼠和猪的组织。涉及视叶的部分细节不适用于哺乳动物样本。所有生物危害材料必须在相应的生物安全水平（BSL）设施中进行处理。所有急性毒物必须在通风柜下操作。所有生物危害医疗废物和急性毒物废物必须妥善处置。
1. 准备
<ol>
	<li>至少提前一天配制溶液（表1）。 
	注意：70 kDa 分子量（MW）的葡聚糖很难溶解。建议将溶液用石蜡膜或铝箔覆盖后过夜搅拌，效率更高。本方案需根据所研究的样本类型使用两种不同的 MV-2 溶液。在处理小型无脑回样本时，18% 葡聚糖可有效将髓鞘与微血管沉淀物分离。然而，在处理大型有脑回样本的中枢神经系统组织，以及小型样本的下丘脑和垂体时，18% 葡聚糖会在界面处产生髓鞘弥散条带。使用 20% 葡聚糖可避免此弥散现象。</li>
	<li>通过向每孔加入 50 µL 多聚-D-赖氨酸制备多孔载玻片，并在室温（RT）下干燥 2 小时，最好在二级生物安全柜（BSC-2）中进行。切勿过度干燥。用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗两次后，置于冰箱中保存，待用。</li>
</ol>
2. 小型无脑回脊椎动物标本的中枢神经系统组织解剖
注意：本文以一只10周龄、约25克重的雄性C57BL6/J小鼠为例，演示该实验方案的应用。
<ol>
	<li>为每个样本准备两个15 mL锥形管和一个1.7 mL微量离心管，分别加入5 mL和1 mL的MV-1溶液。将管子置于冰上保存。</li>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮、赛拉嗪和乙酰丙嗪麻醉混合物（剂量为每公斤体重100/10/3 mg），并用70%乙醇喷洒。通过轻触眼睛检查眨眼反射、轻捏足部检查足底反射，确认反射消失以验证麻醉效果。</li>
		<li>使用诱导麻醉箱，通过吸入5%异氟烷对鸽子进行麻醉。</li>
		<li>将鱼类和蛙类分别置于含1%三卡因的鱼类饲养用水或两栖类林格氏液（材料表）中进行麻醉。</li>
		<li>在实施安乐死后，将蜥蜴置于4 °C环境中冷却以进行麻醉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用手术剪将动物断头，用镊子剥离皮肤暴露颅骨，并用拉格朗日剪从枕骨大孔处剪开（图1A）。</li>
	<li>用解剖刀将脑组织取出，并转移至含有MV-1溶液的15 mL锥形管中。将管子置于冰上保存。</li>
	<li>用镊子从颅骨的蝶鞍中取出垂体，并转移至含有MV-1溶液的1.7 mL微量离心管中。将管子置于冰上保存。</li>
	<li>去除皮肤和肌肉以暴露脊柱，切除四肢、肋骨和内脏器官（图1B）。</li>
	<li>采用以下两种方法之一解剖脊髓，然后将其转移至含有MV-1溶液的5 mL锥形管中。将管子置于冰上保存。
	<ol>
		<li>使用拉格朗日剪从颈椎椎间孔开始，沿头端向尾端方向剪开，进行椎板切除术，直至腰段脊髓。</li>
		<li>使用18 G针头和装有MV-1溶液的10 mL注射器，从腰段椎间孔由尾端向头端方向进行冲洗（图1C,D）。 
		注意：该方法仅适用于非常小的样本，主要是啮齿类动物（&#60;100 g）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用弹簧剪将硬脊膜从脊髓上剪下，并用双齿镊去除残留的脑膜（图2）。</li>
	<li>将脑组织转移至培养皿中，在解剖显微镜下用双齿镊去除脑膜（图2A–C）。</li>
	<li>使用镊子、虹膜剪和弹簧剪切除嗅球和丘脑。用双齿镊从所有脑室中清除脉络丛。务必彻底清除所有脉络丛。 
	注意：脉络丛和嗅球是主要的污染源。与血脑屏障不同，这些毛细血管高度有孔，若未清除，将严重影响后续实验结果。</li>
	<li>使用镊子分离不同的中枢神经系统区域：大脑皮层、小脑、脑干、视叶（哺乳动物样本无此结构）和下丘脑。</li>
</ol>
3. 从大型具有脑回的脊椎动物标本中解剖中枢神经系统组织
注意：本实验方案使用从屠宰场获得的猪中枢神经系统组织。因此，此处不描述也不展示任何麻醉、安乐死或尸体解剖操作。
<ol>
	<li>将猪中枢神经系统组织置于装有 MV-1 溶液的 0.946 L（32 oz）组织学容器中，并放入冰桶/冰盒内运输。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用双齿镊、镊子、虹膜剪和弹簧剪从每份中枢神经系统组织上剥离脑膜。务必清除脑室内的脉络丛组织碎片。</li>
</ol>
4. 中枢神经系统组织匀浆化
注意：由两名研究人员共同进行匀浆过程效率更高：一人在体视显微镜下解剖脑膜，另一人同时对剪碎的组织进行匀浆。这样可使组织迅速返回冰桶并保持低温。
<ol>
	<li>将每个中枢神经系统区域置于培养皿中，加入约 1 mL MV-1 溶液。使用单刃刀片将组织切碎成 1–2 mm 的小块。
	<ol>
		<li>对于小型脊椎动物标本，使用 100 mm × 20 mm 的培养皿。</li>
		<li>对于大型脊椎动物标本，使用 150 mm × 15 mm 的培养皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小型脊椎动物标本的匀浆（表 2 和 表 3）
	<ol>
		<li>使用移液管将大脑皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓转移至各自装有约 1 mL MV-1 溶液的 10 mL 玻璃匀浆器（Potter-Elvehjem 型）中，匀浆器配备聚四氟乙烯（PTFE）研杵。加入 5 mL MV-1 溶液，每种组织匀浆约 10 次。将匀浆液转移至各自的 15 mL 锥形管中。将管子置于冰上保存。 
		注意：对于小型脊椎动物，无论是否包含视叶，分别需要 5 个或 4 个 10 mL Potter-Elvehjem 匀浆器和 15 mL 锥形管。</li>
		<li>用镊子将下丘脑和垂体转移至各自装有约 100 µL MV-1 溶液的 1.7 mL 离心管中，并使用玻璃微研杵小心匀浆。每次使用后用约 1 mL MV-1 溶液冲洗微研杵。将管子置于冰上保存。 
		注意：对于小型脊椎动物，需要 2 个玻璃微研杵和 1.7 mL 离心管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>大型脊椎动物标本的匀浆（表 4 和 表 5）
	<ol>
		<li>使用移液管将切碎的组织转移至 55 mL 玻璃匀浆器（Potter-Elvehjem 型）中，匀浆器配备聚四氟乙烯（PTFE）研杵，并连接至顶置式搅拌器。根据待匀浆的特定中枢神经系统部分，加入推荐体积一半的 MV-1 溶液（表 5）。</li>
		<li>以极低速度（约 150 rpm）开启顶置式搅拌器，并小心上下移动玻璃管约 30 秒。</li>
		<li>关闭搅拌器，加入更多 MV-1 溶液，重复步骤 4.3.2，直至形成均匀的浆液。</li>
		<li>转移至 50 mL 锥形管中。将管子置于冰上保存。</li>
		<li>每次完成不同中枢神经系统组织的匀浆后，用去离子水清洗匀浆器。 
		注意：对于大型脊椎动物，无论是否包含白质，分别需要 5 个或 4 个 50 mL 锥形管。同样，下丘脑和垂体需要两个（2）15 mL 锥形管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 微血管纯化
<ol>
	<li>将步骤 4.2.1、4.2.2 或 4.3.4 得到的组织匀浆在 4 °C 条件下以 2,000 × g 离心 10 分钟。在红褐色微血管沉淀物顶部会形成一层厚厚的白色髓鞘界面。弃去上清液。
	<ol>
		<li>小型脊椎动物样本（表 2 和 表 3）
		<ol>
			<li>使用 5 mL 移液管（约冲洗 10 次）将大脑皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓沉淀物重悬于 5 mL 冰冷的 MV-2 溶液中。向每种悬液中加入 5 mL 冰冷的 MV-2 溶液，并通过翻转试管轻轻混匀。</li>
			<li>用 1 mL MV-2 溶液重悬下丘脑和垂体沉淀物。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>大型脊椎动物样本（表 4 和 表 5）
		<ol>
			<li>向大脑皮层、小脑、脑干和脊髓微血管沉淀物中加入 20 mL 冰冷的 MV-2 溶液。使用试管旋转振荡器混合，以 40 rpm 搅拌约 5 分钟，使沉淀物重悬。通过添加更多 MV-2 溶液，平衡大脑皮层、小脑、脑干和脊髓悬液的锥形管体积。</li>
			<li>使用 5 mL 移液管（约冲洗 10 次）将下丘脑和垂体微血管沉淀物重悬于 5 mL MV-2 溶液中。向悬液中加入 5 mL 冰冷的 MV-2 溶液，并通过翻转试管轻轻混匀。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 4,400 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>缓慢旋转各试管，使上清液沿管壁流动，从而小心地将液体界面上厚重致密的髓鞘层从管壁上分离下来。</li>
	<li>弃去髓鞘层和液体界面，并用包裹无绒纸巾的刮刀擦拭每根试管内壁。对于小型脊椎动物样本，使用移液器小心吸除每个下丘脑和垂体试管中的髓鞘层。</li>
	<li>用卷紧的无绒纸巾擦去多余液体。使用低吸附枪头，将每份沉淀物用 1 mL MV-3 溶液重悬。保持试管置于冰上。</li>
</ol>
6. 微血管洗脱与过滤
<ol>
	<li>为每个中枢神经系统区域分别在烧杯中倒入冰冷的 MV-3 溶液。保持在 4 °C。
	<ol>
		<li>对于小型脊椎动物样本，每个 50 mL 烧杯使用 10 mL MV-3 溶液。根据是否包含视叶，总共需要 6–7 个烧杯。</li>
		<li>对于大型脊椎动物样本，每个 100 mL 烧杯使用 30 mL MV-3 溶液。根据是否包含白质，总共需要 6–7 个烧杯。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞筛置于 50 mL 锥形管上方。每个中枢神经系统区域使用一个。皮层、脑干、视叶、脊髓和垂体使用 100 µm 筛网。小脑和下丘脑使用 70 µm 细胞筛。</li>
	<li>用 1 mL 冰冷的 MV-3 溶液润湿每个筛网。</li>
	<li>使用刻度移液管向步骤 5.5 中制备的悬液中加入更多 MV-3 溶液，同时混合以避免形成团块。小心地将微血管加载到筛网上方，并用冰冷的 MV-3 溶液冲洗。
	<ol>
		<li>对于小型脊椎动物样本（表 2 和 表 3），使用刻度移液管加入 10–15 mL MV-3 溶液，并用 5 mL MV-3 溶液冲洗。</li>
		<li>对于大型脊椎动物样本，使用刻度移液管加入 20 mL MV-3 溶液，并用 10 mL MV-3 溶液冲洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将 20 µm 尼龙网滤器放置在改良滤器支架上（图 2D），为每个中枢神经系统区域组装过滤单元。
	<ol>
		<li>对于小型脊椎动物样本（表 2 和 表 3），皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓使用 25 mm 改良滤器支架。下丘脑和垂体使用 13 mm 改良滤器支架。</li>
		<li>对于大型脊椎动物样本（表 4 和 表 5），皮层、小脑、脑干和脊髓使用 47 mm 改良滤器支架。下丘脑和垂体使用 25 mm 滤器支架。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将滤器置于 50 mL 锥形管上方，并用 5 mL 冰冷的 MV-3 溶液润湿滤器，确保缓冲液沿滤器支架流入锥形管。</li>
	<li>将洗脱的微血管（来自步骤 6.4）转移至 20 µm 尼龙网滤器上方，并用 5–10 mL 冰冷的 MV-3 溶液冲洗微血管。</li>
	<li>使用洁净镊子取出滤器，并将其浸入步骤 6.1 中准备好的盛有冰冷 MV-3 溶液的烧杯中。</li>
	<li>通过轻轻摇动约 30 秒，使微血管从滤器上脱落。对于小型脊椎动物样本，将烧杯内容物倒入 15 mL 锥形管中。对于大型脊椎动物样本，将烧杯内容物倒入 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 5 分钟，并使用低吸附移液枪头将沉淀重悬于 1 mL 冰冷的 MV-3 溶液中。
	<ol>
		<li>对于小型脊椎动物样本，将悬液（来自步骤 6.10）转移至 1.7 mL 微量离心管中，在 4 °C 下以 20,000 x g 离心 5 分钟。 
		注：此离心步骤在台式离心机上以最大速度（约 20,000 x g）进行，以确保获得较高的得率。</li>
		<li>对于大型脊椎动物样本，将步骤 6.10 中的悬液转移至 5.0 mL 微量离心管中，加入 4 mL MV-3 溶液，在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 免疫染色
注意：为验证该方案的可行性，已在爬行动物、两栖动物和鱼类标本上进行了苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色。因此，不建议对这些标本进行免疫标记。
<ol>
	<li>从微量离心管中移除上清液。</li>
	<li>使用低吸附性移液枪头（材料表）将沉淀重悬于1×无菌PBS中。通过多次吹打防止微血管形成聚集体。对于小型脊椎动物样本（表3），根据沉淀体积使用约100 µL–2,000 µL；对于大型脊椎动物样本（表5），根据沉淀体积使用约1,000 µL–4,000 µL。</li>
	<li>使用低吸附性移液枪头将微血管转移至多孔载玻片中，注意将其加至每个孔的中央位置，避免接触孔壁。</li>
	<li>将未加盖的多孔载玻片置于生物安全柜（BSC-2）内，室温下干燥20至30分钟。 
	注意：使用相对较高体积的1× PBS是为了防止聚集体形成。因此，在固定前必须让载玻片充分干燥，以确保微血管被多聚-L-赖氨酸涂层牢固吸附。</li>
	<li>用移液枪吸出残留的1× PBS，加入200 µL 4%多聚甲醛（PFA），室温孵育30分钟。</li>
	<li>吸出固定液，用200 µL 1× PBS在室温下洗涤3次，每次5分钟。 
	注意：在此步骤可对鱼类、两栖类和爬行类中枢神经系统微血管进行苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色。</li>
	<li>向多孔载玻片中加入200 µL封闭缓冲液，37 °C孵育60分钟。</li>
	<li>用移液枪吸出封闭液，加入200 µL用抗体稀释液配制的一抗混合液（材料表），4 °C孵育过夜。</li>
	<li>吸出一抗混合液，用200 µL 1× PBS在室温下洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>加入用1× PBS稀释的二抗混合液（材料表），室温避光孵育2小时。</li>
	<li>吸出二抗混合液，用200 µL 1× PBS在室温下避光洗涤3次，每次5分钟。最后一次洗涤后，取下多孔载玻片的框架，并用低絮状擦纸吸干多余的1× PBS。</li>
	<li>加入盖玻片、液体抗荧光淬灭封片剂以及4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞核染色。室温避光干燥过夜。</li>
	<li>干燥后，将载玻片置于载片盒中，避光保存于4 °C，直至进行共聚焦显微镜观察和数据采集。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

血脑屏障（BBB）包含脑微血管内皮细胞的独特特性，这些细胞通过复杂的紧密连接、黏附连接、&#34;钉-槽&#34;连接结构以及对中枢神经系统（CNS）稳态至关重要的黏附斑共同耦合而成2,3,19。内皮细胞特性的诱导和维持依赖于周细胞以及周围星形胶质细胞终足的结构支持2,3,19。BBB微血管具有极性特征（即蛋白质在管腔侧或基底侧内皮细胞表面呈现不对称分布）20。尽管上述描述可简要定义BBB，但实际上它仍是神经科学中最难解的概念之一。例如，神经血管单元（NVU）内部存在的区域差异、性别差异和年龄差异，可能解释中枢神经系统不同区域对创伤、毒性、感染和炎症的易感性差异，这些差异可能带来重大的临床后果<sup class="xr...

大脑是人体最重要的器官。因此，尽管存在可能引发偏离正常状态的外部因素，维持大脑稳态仍是首要任务。据一些学者认为，大约在4亿至5亿年前1，脊椎动物进化出了我们现在所知的血脑屏障（BBB）2,3。这一保护性&#34;屏障&#34;通过严格调控血液与中枢神经系统（CNS）实质之间离子、分子和细胞的转运，对中枢神经系统的稳态和功能产生最大影响。当血脑屏障遭到破坏时，大脑将易受到毒性物质暴露、感染和炎症的侵害。因此，血脑屏障功能障碍与许多（即使不是全部）神经系统和神经发育障碍相关4,5,6。
血脑屏障（BBB）的复杂功能归因于由神经血管单元（NVU）构成的独特中枢神经系统（CNS）微血管系统2,3。高度特化的内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞终足构成了NVU的细胞组分2,3。这些细胞产生的细胞外基质对NVU及BBB的生理功能同样至关重要2,3。尽管NVU的关键细胞和分子组分在脊椎动物中具有保守性，但在不同目和物种之间仍报道存在异质性7,8。然而，技术上的局限性阻碍了我们在神经生物学、生物医学或转化研究中充分考虑这些差异的能力。
基于此，我们扩展了一种针对中枢神经系统（CNS）特定区域的微血管分离方法，使其适用于全部五个脊椎动物类群（鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类）的多种物种。本方案适用于小型无脑回和大型有脑回的脊椎动物，包括具有转化研究意义的物种9。此外，我们还将此前在此类研究中未被探索但与神经生理学密切相关且具有重要临床意义的CNS区域纳入本方法，包括下丘脑、垂体和白质。最后，我们验证了该分离方法作为可靠工具在检测神经血管单元（NVU）和/或血脑屏障（BBB）中蛋白表达变化方面的可行性9,10,11。作为概念验证，我们展示了如何通过该分离方法结合免疫荧光技术，检测实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）过程中VCAM-1和JAM-B表达的变化。

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>BP39920</td><td>用于封闭和抗体稀释液。</td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td>用作固定剂（4% PFA）</td></tr><tr><td>70,000 MW 葡聚糖</td><td>Millipore Sigma</td><td>9004-54-0</td><td>用于 MV-2 溶液</td></tr><tr><td>Adson 镊子</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11006-12</td><td>用于去除肌肉和皮肤</td></tr><tr><td>Adson 镊子，学生级</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td>与上述相同但更便宜</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>用于 MV-3 溶液、封闭和抗体稀释液</td></tr><tr><td>Corning 100 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431752-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning Deskwork 低吸附枪头</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS4151</td><td>与下述相同但更便宜。</td></tr><tr><td>Cultrex Poly-D-Lysine</td><td>R&amp;D</td><td>3439-100-01</td><td>用于载玻片包被</td></tr><tr><td>驴抗山羊 IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21432</td><td>用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21202</td><td>用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21206</td><td>用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>A31573</td><td>用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>驴抗大鼠 IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10029</td><td>用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>双齿组织镊</td><td>FST</td><td>18067-11</td><td>用于去除软脑膜和脉络丛</td></tr><tr><td>Dumont #3c 镊子</td><td>FST</td><td>11231-20</td><td>用于更精细或更小的中枢神经系统组织操作（如垂体）</td></tr><tr><td>Dumont #7 镊子</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>用于中枢神经系统组织的解剖和操作</td></tr><tr><td>Dumont #7 镊子，学生级</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td>与上述相同但更便宜</td></tr><tr><td>ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention 枪头</td><td>Eppendorf</td><td>22493008</td><td>比上述枪头质量更好（更昂贵）。</td></tr><tr><td>超细锯齿 Graefe 镊子</td><td>FST</td><td>11151-10</td><td>用于去除骨骼</td></tr><tr><td>精细剪刀，锋利</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td>用于去除猪和猕猴的硬脊膜囊</td></tr><tr><td>1.5 mL 玻璃研杵微型离心管组织研磨器，10 支装</td><td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td><td>GP1.5_10</td><td>用于小型脊椎动物下丘脑和垂体。</td></tr><tr><td>山羊抗 CXCL12，生物素标记</td><td>PeproTech</td><td>500-P87BGBT</td><td>用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐稀释比例：1:20。</td></tr><tr><td>山羊抗 JAM-B</td><td>R&amp;D</td><td>AF1074</td><td>用作评估神经炎症的一抗。推荐浓度：5 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A11001</td><td>用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21424</td><td>用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>山羊抗 PDGFR&amp;beta;</td><td>R&amp;D</td><td>AF1042</td><td>用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21249</td><td>用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG-DyLight 488</td><td>Thermo</td><td>35552</td><td>用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>山羊抗大鼠 IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10021</td><td>用作二抗。推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>Graefe 镊子，弯头，1×2 齿</td><td>FST</td><td>11054-10</td><td>用于夹持和摇动尼龙滤网</td></tr><tr><td>HBSS，含钙镁的 1X 缓冲液</td><td>Corning</td><td>21-022-CM</td><td>用于 MV-1 溶液</td></tr><tr><td>HEPES，1M 液体缓冲液</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td>用于 MV-1 溶液</td></tr><tr><td>异凝集素 GS-IB4-生物素-XX</td><td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td><td>I21414</td><td>从豆科植物长果槐（Griffonia simplicifolia）中分离的糖蛋白，可结合内皮细胞糖萼上的 D-半乳糖基残基。用于禽类和猪的中枢神经系统微血管。推荐浓度：5 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>LaGrange 剪刀，锯齿</td><td>FST</td><td>14173-12</td><td>用于颅骨解剖和椎板切除术（猪和猕猴除外）</td></tr><tr><td>Millicell EZ 8 孔载玻片</td><td>Millipore Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 CLDN5</td><td>Thermo</td><td>35-2500</td><td>用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>小鼠抗 GGT1</td><td>Abcam</td><td>ab55138</td><td>用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD31</td><td>R&amp;D</td><td>BBA7</td><td>用作灵长类动物中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：16.5 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>小鼠抗 NFM</td><td>Thermo</td><td>RMO-270</td><td>用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>小鼠抗&amp;alpha;SMA</td><td>Thermo</td><td>MA5-11547</td><td>用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>尼龙滤网，卷装</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY6000010</td><td>激光切割成直径 13 mm 的滤网圆片。用于小型脊椎动物下丘脑和垂体。</td></tr><tr><td>尼龙滤网，25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2002500</td><td>用于大多数小型脊椎动物中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。用于猕猴和猪的下丘脑和垂体。</td></tr><tr><td>尼龙滤网，47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2004700</td><td>用于猕猴和猪的中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td><td>用于盖玻片封片。</td></tr><tr><td>兔抗 AQP4</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5971</td><td>用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>兔抗 LSR</td><td>Millipore Sigma</td><td>SAB2107967</td><td>用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>兔抗 NG2</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB5320</td><td>用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>兔抗 OSP</td><td>Abcam</td><td>ab53041</td><td>用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：1 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>兔抗 VE-Cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>兔抗 ZO-1</td><td>Thermo</td><td>61-7300</td><td>用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>大鼠抗 CD31</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 550274</td><td>用作小鼠中枢神经系统微血管的一抗。推荐浓度：5 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>大鼠抗 GFAP</td><td>Thermo</td><td>13-0300</td><td>用作所有样本中枢神经系统微血管的一抗。推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>大鼠抗 VCAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 553329</td><td>用作评估神经炎症的一抗。推荐浓度：5 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>无菌林格氏液，蛙用</td><td>Aldon Corporation</td><td>IS5066</td><td>用于两栖动物麻醉</td></tr><tr><td>链霉亲和素-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>S32355</td><td>用作二抗，标记生物素化的一抗。推荐稀释比例为 1:500。</td></tr><tr><td>链霉亲和素-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>S32357</td><td>用作二抗，标记生物素化的一抗。推荐稀释比例为 1:500。</td></tr><tr><td>手术剪刀，锋利</td><td>FST</td><td>14002-12</td><td>用于去除肌肉和皮肤</td></tr><tr><td>手术剪刀，锋利-钝头</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>用于断头（猪和猕猴除外）</td></tr><tr><td>Swinnex 滤器支架，13 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0001300</td><td>经激光切割改造。用于小型脊椎动物下丘脑和垂体。</td></tr><tr><td>Swinnex 滤器支架，25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0002500</td><td>经激光切割改造。用于大多数小型脊椎动物中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。用于猕猴和猪的下丘脑和垂体。</td></tr><tr><td>Swinnex 滤器支架，47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0004700</td><td>经激光切割改造。用于猕猴和猪的中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>50-165-7277</td><td>用于封闭和抗体稀释液。</td></tr><tr><td>Wheaton 120 真空顶置式搅拌器</td><td>VWR (供应商 DWK Life Sciences)</td><td>62400-904 (DWK #903475)</td><td>用于猕猴和猪的中枢神经系统组织，配合 55 mL 组织研磨器使用，下丘脑和垂体除外。</td></tr><tr><td>Wheaton Potter-Elvehjem 组织研磨器，带 PTFE 研杵，10 mL</td><td>VWR (供应商 DWK Life Sciences)</td><td>14231-384 (DWK #357979)</td><td>用于大多数小型脊椎动物中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。用于猕猴和猪的下丘脑和垂体。</td></tr><tr><td>Wheaton Potter-Elvehjem 组织研磨器，带 PTFE 研杵，55 mL</td><td>VWR (供应商 DWK Life Sciences)</td><td>14231-372 (DWK #357994)</td><td>用于猕猴和猪的中枢神经系统组织，下丘脑和垂体除外。</td></tr></tbody></table>

跨五个脊椎动物类群的中枢神经系统微血管可靠分离

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

中枢神经系统（CNS）微血管的分离通常通过合并多个动物（最常见为啮齿类动物）的皮层组织来完成。这种方法将血脑屏障（BBB）特性的研究局限于皮层，且无法进行个体间的比较。本项目致力于开发一种分离方法，能够实现对多个中枢神经系统区域的神经血管单元（NVU）进行比较，包括皮层、小脑、视叶、下丘脑、垂体、脑干和脊髓。此外，该方法最初为小鼠样本开发，现已成功适用于从小型和大型脊椎动物的中枢神经系统组织中分离微血管，包括从大脑半球白质中成功分离微血管。该方法与免疫标记技术结合后，可实现对蛋白表达水平的定量分析，并在个体间、组织类型间或不同处理条件下进行统计学比较。我们通过评估实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）过程中蛋白表达的变化验证了该方法的适用性，EAE是神经炎症性疾病多发性硬化的小鼠模型。此外，通过该方法分离得到的微血管还可用于后续多种实验应用，如qPCR、RNA-seq和Western blot等。尽管这并非首次尝试在不使用超速离心或酶解解离的情况下分离中枢神经系统微血管，但其独特之处在于能够高效地对单一个体及多个中枢神经系统区域进行比较。因此，该方法可用于探究一系列可能被忽视的差异，包括中枢神经系统不同区域（皮层、小脑、视叶、脑干、下丘脑、垂体和脊髓）、组织类型（灰质或白质）、个体差异、实验处理组以及物种间的差异。

从小鼠中枢神经系统分离的微血管显示出神经血管单元的所有内在细胞组分2,3。通过使用血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM，亦称CD31）或凝集素IB4（一种可结合内皮细胞糖萼的糖蛋白）标记内皮细胞，血小板源性生长因子受体-β（PDGFRβ）或神经胶质抗原2（NG2）标记周细胞，以及水通道蛋白-4（AQP4）标记星形胶质细胞终足（图3A,B），证明了这些内在组分存在于分离的微血管中。可见的中枢神经系统区域包括大脑皮层微血管（图3B）、小脑（图3C）、垂体（图3D）、下丘脑（<strong ...

本实验方案的目的是从无脑回和有脑回的脊椎动物中枢神经系统的多个区域中分离微血管。

从中枢神经系统（CNS）中分离微血管通常需要整合来自多个动物的皮质组织，最常见的是……

本方案具有重要意义，因为它能够实现不同中枢神经系统区域之间以及不同个体之间的微血管结构的比较。该微血管分离技术可在一天内完成，且无需超速离心和酶解离步骤。然而，去除软脑膜和脉络丛可能较为困难。务必缓慢而仔细地操作，以确保完全去除每一块组织。对于小型无脑回脊椎动物标本的中枢神经系统组织解剖，将获取的脑组织放入含有 MV-1 溶液、置于冰上的 15 毫升锥形管中，并用镊子从颅骨的蝶鞍部取出垂体。将垂体置于装有 MV-1 溶液、置于冰上的 1.7 毫升微量离心管中，然后去除皮肤和肌肉以暴露脊柱。去除四肢、肋骨和内脏器官后，使用装有18号针头的10毫升注射器，将新鲜的MV-1溶液从腰椎椎管的尾端向头端方向冲洗脊柱。然后将脊髓放入含有新鲜MV-1溶液的5毫升离心管中。接着，在解剖显微镜下将脑组织置于培养皿中，并用双尖针去除脑膜。务必检查脊髓，确保无残留的脑膜组织。使用镊子分离下丘脑、小脑、脑干和大脑皮层。必要时，使用镊子以及虹膜剪和弹簧剪切除嗅球和丘脑，并使用双尖探针清除所有脑室中的脉络丛。对于大型沟回型脊椎动物标本的中枢神经系统组织解剖，使用解剖显微镜以及双齿探针、镊子、虹膜剪和弹簧剪，小心去除各中枢神经系统组织上的脑膜，并注意清除脑室内的脉络丛组织。为均质化所获取的中枢神经系统组织，需在各自的培养皿中将每个中枢神经系统区域切成一至二毫米大小的组织块。对于小型脊椎动物标本的中枢神经系统组织均质化，使用移液管加入一毫升 MV-1 溶液以悬浮切碎的组织。然后使用同一支移液管将大脑皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓组织分别加入到各自的10毫升玻璃组织研磨器中，每个研磨器中加入5毫升MV-1溶液，并使用聚四氟乙烯（PTFE）研杵对每份组织进行约10次研磨。将每份组织匀浆分别转移至预置于冰上的15毫升锥形管中，并用镊子将下丘脑和垂体分别放入含有100微升MV-1溶液的1.7毫升离心管中。随后，使用玻璃微型研杵小心地对每份组织进行匀浆处理。为均质化大型脊椎动物样本，使用斜口移液管将切碎的组织转移至55毫升玻璃组织研磨器中，并将研磨器连接至顶置式搅拌器。根据表格中指定的特定中枢神经系统部位，加入推荐体积一半的MV-1溶液，然后启动顶置式搅拌器，转速调至约每分钟150转。关闭搅拌器前，小心上下移动玻璃管约30秒，随后加入更多MV-1溶液进行进一步均质化，直至获得均匀的悬液。然后将匀浆后的组织转移至预冷的50毫升锥形管中，置于冰上。进行微血管纯化时，通过离心沉淀中枢神经系统组织匀浆物，并弃去上清液。对于小型脊椎动物样本的微血管分离，每份样品加入5毫升新鲜的冰冻MV-2溶液，用移液器将大脑皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓的沉淀物反复吹打约10次，随后再向每根试管中各加入5毫升冰冻的MV-2溶液。轻轻翻转试管以混匀，并在1毫升MV-2溶液中重新悬浮下丘脑和垂体沉淀。对于大型脊椎动物标本的微血管分离，向皮层、小脑、脑干和脊髓的微血管沉淀中加入20毫升冰冻的MV-2溶液，并在40转/分钟的试管旋转仪中重新悬浮约5分钟。重悬结束后，通过离心分离中枢神经系统组织裂解物，缓慢旋转每支试管，使上清液沿管壁流动，以小心地将液体界面处厚而致密的髓鞘层从管壁上分离下来。弃去髓鞘和液体界面，用包裹无尘纸的刮刀擦拭每根试管内壁。然后，用拧成螺旋状的无尘纸吸除多余液体，使用低吸附枪头将每个沉淀物重悬于1 mL MV-3溶液中。进行微血管洗脱和过滤时，向每份中枢神经系统组织微血管悬液中加入数毫升新鲜MV-3溶液，边混合边避免形成团块，随后将每份悬液通过Pruitt滤器过滤至各自的50 mL锥形管中。每个中枢神经系统区域使用一个改良的滤器支架，并在其上放置一个20微米的尼龙网滤器。将滤器支架转移至一个50毫升的锥形管中，用5毫升冰冻的MV-3溶液润湿滤器，确保缓冲液沿滤器支架流下并进入锥形管。将洗脱出的微血管转移至每个20微米的尼龙网滤器上，并用5至10毫升冰冻的MV-3溶液冲洗微血管。使用镊子将每个滤膜转移至盛有冰冻 MV-3 溶液的独立烧杯中，轻轻振荡每个滤膜约 30 秒，以分离微血管。转移至 15 毫升锥形管后，通过离心收集微血管，并使用低吸附枪头将每个沉淀重悬于 1 毫升冰冻 MV-3 溶液中。然后，将小型脊椎动物样本中的微血管悬液转移至 1.7 毫升微量离心管中，在 4 摄氏度下以 20,000 × g 离心 5 分钟。对于大型脊椎动物标本，将悬液转移至若干个5毫升离心管中，每管加入4毫升MV-3溶液，在4摄氏度、2,000 × g条件下离心5分钟。通过针对CD31、PDGFR-β和水通道蛋白4的免疫标记，可检测如上所述分离得到的微血管中神经血管单元的内在组分，包括皮层、小脑、垂体、下丘脑、脑干及脊髓微血管。同样，也可观察到黏附连接蛋白VE-钙黏蛋白、紧密连接蛋白CLDN5和闭锁小带蛋白-1（Zonula Occludens-1）、三细胞连接蛋白angulin-1，以及基底标志物趋化因子配体CXCL12和γ-谷氨酰转移酶-1的表达。 此外，大多数微血管缺乏α平滑肌肌动蛋白的表达，表明该分离方案可选择性地靶向小口径微血管。从其他小型无脑回脊椎动物（如鸟类、蜥蜴、青蛙和鱼类）获得的微血管具有一些共同的形态学特征，提示该方法有助于进一步表征不同物种间神经血管单元的差异。蛋白质表达变化的定量分析显示，在实验性自身免疫性脑脊髓炎高峰期，脊髓微血管上的血管细胞黏附分子1和连接黏附分子B表达增加。然而，血管细胞黏附分子1在垂体微血管中也显著增加，而在下丘脑和脑干微血管中则减少。此外，在慢性实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中，中枢神经系统所有组织中的血管细胞黏附分子1表达均出现变化，同时下丘脑和垂体微血管中的连接黏附分子B表达也发生变化。在此操作步骤完成后，可进行包括蛋白质印迹、PCR和免疫组织化学在内的定量分析，以揭示血脑屏障内基因和蛋白质表达模式的特征。多聚甲醛是一种急性毒性试剂，操作时应始终在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备。

reliable-isolation-central-nervous-system-microvessels-across-five

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在五个脊椎动物群中可靠隔离中枢神经系统微血管

本视频展示了从小鼠大脑中分离构成血脑屏障（BBB）的完整血管，以及神经元和胶质细胞的方法。所分离的血管可用于建立体外模型，以研究其在维持大脑稳态中的作用。...

分离小鼠脑血管：从小鼠脑组织样本中分离完整血管的实验方案

本视频展示了从安乐死大鼠中分离脑微血管的过程。包括脑组织的解剖、组织清洗和机械消化，随后通过反复离心以分离出纯净的微血管组分。...

一种从大鼠脑组织中分离神经血管单元的方法

脑微血管内皮细胞（BMEC）通过特定的连接蛋白相互连接，形成高度调控的屏障，将血液与中枢神经系统（CNS）分隔开来，即所谓的血脑屏障（BBB）。本方案所述的原代小鼠脑微血管内皮细胞的分离，可实现对BBB进行深入的体外研究。...

分离原代小鼠脑微血管内皮细胞

本方案描述了重复性缺氧预处理，即短暂暴露于全身性缺氧，可减少小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后脑梗死体积及血脑屏障的破坏。同时，本文还详细说明了脑卒中后脑梗死体积与血脑屏障破坏的双重定量方法，以评估神经血管保护作用的疗效。...

重复性缺氧预处理及小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后神经血管保护作用的量化

我们描述了一种用于纯化小鼠脑血管组分的实验方案。分离出的脑血管包括由紧密连接连接的内皮细胞，以及被连续基底膜、周细胞、血管平滑肌细胞和血管周围星形胶质细胞膜包绕的结构。...

小鼠脑血管的纯化

本文描述了一种简单且可重复的小鼠脑内小动脉（包括实质小动脉、穿支小动脉和毛细血管前小动脉的一类血管）分离方案，可用于压力肌图分析、免疫荧光、生物化学及分子生物学研究。...

脑实质小动脉的分离与套管插管

来自人脑组织的分离脑毛细血管可作为临床前模型，用于研究生理和病理生理条件下血脑屏障的功能。本文中，我们介绍了一种从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管的优化方案。...

从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管

本文介绍了一种分离大鼠脑微血管及制备膜样品的方法。该方案具有明显优势，可从单个动物获得蛋白质产量可观且微血管富集度高的样品。所得样品可用于对脑微血管内皮进行可靠的蛋白质分析。...

一种简单且可重复的制备新鲜分离大鼠脑微血管膜样本的方法

本文介绍了两种优化的实验方案，用于分析中枢神经系统（包括脑、脊髓和脑膜）中的常驻免疫细胞及外周来源的免疫细胞。这些方案有助于确定在稳态和炎症条件下定位于这些解剖区域的细胞的功能与组成。...

分离中枢神经系统组织及其相关脑膜用于免疫细胞的下游分析

本文介绍了一种从小鼠中枢神经系统体外分离多种胶质细胞群体的实验方案。该方法可分离出不同区域的小胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞以及星形胶质细胞，以便在多种培养体系中分别研究各类细胞的表型特征。...

从小鼠中枢神经系统多个区域分离和提取胶质细胞

迄今为止，尚无能够从同一只小鼠中同时分离出所有主要中枢神经系统常驻细胞类型的实验方案。本方案适用于正常小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠，可用于研究神经炎症期间复杂的细胞网络，同时减少所需实验小鼠的数量。...

从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

了解中枢神经系统微血管分离技术，用于神经科学研究，可在一天内完成，无需超速离心或酶解。该方法适用于五种脊椎动物群，支持比较不同脑区微血管结构。

跨五个脊椎动物类群的中枢神经系统微血管可靠分离

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