在五个脊椎动物群中可靠隔离中枢神经系统微血管

该协议是重要的，因为它允许比较不同中枢神经系统区域之间，以及不同个体之间的微血管。这种微维塞尔分离技术可以在一天内完成，并且消除了超离心和酶分离的需要。去除毛虫和胆小毛症可能很困难。

一定要缓慢而小心地工作，以确保每个组织完全去除。对于从小利森脑脊椎动物标本中解剖的CNS组织，将收获的大脑放入含有MV-1溶液的15毫升锥形管中，并使用钳子从头骨的脑骨中取回垂体。将垂体放在1.7毫升的MV-1溶液的微离心管中，取出皮肤和肌肉以暴露椎柱。

切除四肢、肋骨和内脏器官后，使用装有18针的10毫升注射器，用新鲜的MV-1溶液冲洗椎柱，在整个腰椎前肢方向。然后将脊髓放在含有新鲜 MV-1 溶液的 5 毫升管中。接下来，将大脑放入解剖显微镜下的培养皿中，用双管齐下刺去除脑筋。

请务必检查脊髓，以确保没有剩余的脑膜。使用钳子分离下丘脑、小脑、脑干和皮层。必要时，使用钳子、虹膜和弹簧剪刀切除嗅觉球茎和丘脑，并使用双管齐下刺从所有脑心室中去除所有胆管丛。

对于从大型陀螺脊椎动物标本中解剖的 CNS 组织，使用解剖显微镜和双管齐下刺、钳子、虹膜和弹簧剪刀从每个 CNS 组织中去除脑膜，注意从脑心室取出任何胆结丛。为了使收获的 CNS 组织均质化，将每个 CNS 区域切碎为一到两毫米的单个培养皿中。要使小脊椎动物标本中的CNS组织均质化，使用转移移液器添加一毫升MV-1溶液，以悬浮切碎的组织。

然后使用相同的转移移液器将皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓片分发到单独的 10 毫升玻璃组织研磨机中，并使用 PTFE 害虫和 5 毫升 MV-1 溶液研磨每组组织约 10 次。将每个组织浆料转移到冰上的单个 15 毫升圆锥管中，并使用钳子将下丘脑和垂体放入 MV-1 溶液的 100 微升中，放入单独的 1.7 毫升管中。然后，小心地用玻璃微虫使每个组织均质。

要使大型脊椎动物标本均质化，请使用斜面切割转移移液器将切碎的组织转移到 55 毫升玻璃组织研磨机中，然后将研磨机连接到架空搅拌器上。根据表中所示的均质化的特定 CNS 部分添加推荐 MV-1 溶液体积的一半，并将头顶搅拌器打开至每分钟约 150 次旋转。小心上下移动玻璃管约 30 秒，然后关闭头顶搅拌器，以添加更多 MV-1 溶液，实现额外的均质化，直到获得均质浆。

然后将均质组织转移到冰上50毫升锥形管中。对于微维塞尔纯化，通过离心使CNS组织均匀，并丢弃超钠。对于小型脊椎动物标本微维塞尔分离，移液皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓颗粒，每样本5毫升新鲜、冰冷的MV-2溶液，约10倍，然后向每个管中再添加5毫升冰冷MV-2溶液。

小心地翻转管子进行混合，并在一毫升的MV-2溶液中重新悬浮下丘脑和垂体颗粒。对于大型脊椎动物标本微韦塞尔分离，在皮层、小脑、脑干和脊髓微韦塞尔颗粒中加入20毫升冰冷的MV-2溶液，以每分钟40次旋转的速度将管左轮手枪中的颗粒重新悬浮约5分钟。在重新悬浮结束时，通过离心分离CNS组织，并缓慢旋转每个管，使上清液沿壁小心地从管壁上分离液体界面上厚而密的麦林层。

丢弃米林和液体接口，用用低绒纸擦拭包裹的铲子对每管的内壁进行污点。然后，使用扭曲的低绒纸擦拭吸收多余的液体，并使用低结合提示在一毫升的MV-3溶液中重新悬浮每个颗粒。对于微韦塞洗脱和过滤，将几毫升新鲜 MV-3 溶液混合到每个 CNS 组织微韦塞尔浆中，在混合以避免聚合时，通过普鲁伊特过滤器将每个悬浮液应变到单独的 50 毫升锥形管中。

将一个 20 微米尼龙网过滤器放在每个 CNS 区域的一个经过修改的过滤器支架上。将滤芯支架转移到 50 毫升锥形管上，用 5 毫升冰冷的 MV-3 溶液将过滤器湿润，确保缓冲器向下塞片架倒入锥形管中。将洗涤的微纤维转移到每个 20 微米尼龙网过滤器上，然后用 5 到 10 毫升的冰冷 MV-3 溶液冲洗微维。

使用钳子将每个过滤器转移到包含冰冷 MV-3 溶液的单个烧杯中，轻轻摇动每个过滤器约 30 秒以分离微纤维。转移到15毫升锥形管后，通过离心收集微壁体，并使用低结合移液器将每粒颗粒重新悬浮在一毫升的冰冷的MV-3溶液中。然后，将小脊椎动物标本的微维塞尔悬浮液转移到1.7毫升的微离心管中，在4摄氏度的G下以2万倍G的2万倍进行离心5分钟。

对于大型脊椎动物标本，将悬浮液转移到单独的五毫升离心管中，并加入四毫升 MV-3 溶液，在摄氏四度下以 2000 倍 G 进行离心 5 分钟。神经血管单元的内在成分可以通过CD31、PDGFR-beta和水波林四种的免疫标记在微壁体中检测，如证明，包括皮质、小脑、垂体、下丘脑、脑干和脊柱微维塞尔。同样，粘附蛋白-结蛋白 VE-cadherin、紧密结蛋白CLDN5和Zonula Occlens-1、三细胞结蛋白阿古林-1和基底标记化疗基体配体CXCL图案12和伽马-谷氨基转移酶-1的表达可以可视化。

此外，大多数微韦塞尔没有阿尔法平滑肌肉行为素的表达，表明这种隔离协议有选择地针对小口径微韦塞尔。从其他小型利森脑脊椎动物（如鸟类、利德、青蛙和鱼类）获得的微鱼具有一些形态特征，这表明这种方法对于进一步描述物种间神经血管单位的差异是有用的。蛋白质表达变化的定量显示血管细胞粘附分子一和交结粘附分子B沿脊髓微囊，在实验自身免疫性脑脊髓炎的高峰期增加。

然而，血管细胞粘附分子一在垂体微壁体中也显著增加，在下丘脑和脑干微纤维中减少。此外，在所有中枢神经系统组织中，血管细胞粘附分子一种表达中观察到变化，在下丘脑和垂体微囊中，结粘附分子B表达也观察到变化。定量分析，如西方印迹，PCR和免疫组织化学，可以按照这个程序进行，以揭示对血脑屏障内基因和蛋白质表达模式的见解。

甲醛是一种剧毒的试剂，在佩戴适当的 PPE 时应始终在烟罩下处理。