使用基于FRET的传感器ATeam1.03^YEMK对小鼠脑组织切片中细胞内ATP进行成像

本文展示了如何在器官型培养的小鼠海马脑片中，利用ATP敏感的FRET传感器ATeam 1.03 YEMK对神经元和星形胶质细胞内ATP水平的动态变化进行实时测量。该技术的主要优势在于，可在受控条件下、在传感器表达水平较高的环境中，研究活体脑组织中的能量代谢。该方法有助于深入理解由能量剥夺（例如缺血性卒中）所导致的疾病或脑损伤背后的病理机制。

原则上，该方法不仅可用于研究脑组织中的ATP水平，也可用于其他器官。要成功开展本实验，必须极其小心地完成组织培养过程中的所有步骤，并保持无菌状态。此外，还需具备一定的细胞荧光成像知识。

在大多数复杂操作中，组织处理及可视化对于理解正确操作流程至关重要。成像实验同样如此。本次操作将由来自实验室的博士后Rodrigo Lerchundi和硕士生Na Huang进行演示。

在装有冰冻ACSF的冰冷培养皿中，将脑组织置于滤膜上。分离半球后，以45度角进行旁矢状切面切割。用超级胶水将其中一个半球固定在振动切片机的组织台上，并立即将组织块转移至装有经5%二氧化碳和95%氧气混合气体饱和的冰冻ACSF的振动切片机浴槽中。

将组织置于振动切片机（Vibratome）的浴槽中并调整位置。将第二个半脑置于冰冻的ACSF中直至切片。调节振动切片机，使其切片厚度为250至400微米。

切片后，根据海马结构典型的形态学特征进行识别，并使用皮下注射针分离海马，保留邻近海马的脑皮层组织。将切片置于盛有ACSF的网架上，于34摄氏度、持续通入5%二氧化碳和95%氧气的环境中孵育，直至收集完所有切片。随后将切片转移至层流柜中，继续在无菌条件下操作。

使用倒置的无菌玻璃巴斯德移液管，将切片从 ACSF 轻柔地转移至其中一个预热的、装有无菌 Hank's 盐溶液的培养皿中。更换移液管后，将切片转移至第二个培养皿。重复此过程共五次。

转移至后续培养板时，尽量减少HBSS的带入量。使用移液器将脑片逐片轻柔地放置于培养插件表面，避免移液过程中产生涡流，并等待脑片完全沉降至巴斯德移液管的尖端后再释放。

对每一片切片重复此步骤。将两片切片放置于膜上。使用细尖吸头小心吸去插入物表面多余的汉克溶液。

将培养物置于含5%二氧化碳、37摄氏度的加湿培养箱中，直至实验当天。每两到三天更换一次培养基。在不接触组织的情况下，将0.5微升稀释后的载体直接加到每个切片的表面。

最后，将切片放回培养箱中，并至少继续培养六天。在开始实验前，将含有培养切片的插入物转移至无菌操作台，放入一个含有1毫升器官型切片培养基或最低必需培养基（MEM）的30毫米培养皿中。将培养皿置于体视显微镜下，聚焦到切片表面。

使用两根无菌皮下注射针，在选定脑片的窄边处进行短的十字切口，切口位于上层，注意不要损伤下方的组织。为将制备好的脑片从插入物中取出，用镊子夹住膜的边缘，使用无菌手术刀在膜上做直线平行切口，形成一个将脑片置于中央的方形或三角形。如果插入物上还载有其他脑片，则将其放回原培养板并重新放入培养箱中。

培养基的表面张力会防止其渗漏到膜的表面。通过将实验用人工脑脊液（ACSF）连接至碳合气体供应管路，并用95%氧气和5%二氧化碳混合气体通气至少三十分钟，调节其pH值至7.4。在整个实验过程中持续对灌流液进行气体通气。

然后打开单色器的荧光光源。将器官型脑片培养物转移至实验腔室。将网格放置在器官型脑片培养物上方，框架朝下，不接触培养物，丝线朝上，接触膜表面。

将灌流室置于显微镜载物台上，并连接至灌流系统。开启蠕动泵，调节流速为每分钟1.5至2.5毫升。确保灌流系统无泄漏。

使用透射光将培养的脑片调至焦点，并确定实验操作区域。在开始成像实验前，需等待至少15分钟，使脑片适应灌流液环境，然后打开相机和成像软件。在435纳米波长下激发供体荧光蛋白。

将曝光时间设置在40至90毫秒之间。然后将二向色镜和滤光片插入光束分光器单元中。使用500纳米的发射光分光器分离荧光发射，并采用带通滤光片（482 ± 16 纳米和542 ± 13.5 纳米）进一步分离供体和受体荧光。

选择一个看似无细胞荧光的区域作为背景扣除。在屏幕上圈选标记组织中的单个结构以创建感兴趣区域（ROI）。设置图像采集频率和总记录时间。

对于超过30分钟的实验，建议以0.2至0.5赫兹的采集频率进行，以防止光毒性。随后开始记录。为诱导细胞内ATP的变化，将灌流管从标准ACSF溶液切换至含有代谢抑制剂的生理盐水，例如化学性缺血溶液。

或者，使用含较高钾离子浓度（8 毫摩尔）的生理盐水，以模拟活跃神经元释放的钾离子。记录完成后，立即将实验用人工脑脊液（ACSF）更换为HEPES缓冲的ACSF，随后将含有脑片培养物的记录室转移至共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

在给定的光学配置下，以尽可能高的Z轴分辨率采集Z轴层扫图像。在本实验方案中，转导十天后，在培养的脑片新皮层中，可在切片表面下深达50微米的范围内观察到高密度表达ATeam 1.03 YEMK的神经元。在海马区也获得了类似的结果。

对于星形胶质细胞，ATeam 1.03 YEMK 在人胶质纤维酸性蛋白启动子的调控下表达，而在海马神经元中表达 ATeam 1.03 YEMK 的脑片所选定的 ROI 代表锥体细胞的胞体。在无细胞外葡萄糖的条件下，用 5 毫摩尔叠氮化钠处理脑片 1 分钟后，FRET 供体对的发射强度出现相反的变化。同时观察到 ATeam FRET 比值可逆性降低。

在基础条件下，14个不同细胞中长期的ATeam FRET比率显示，ATeam是一种可靠且稳定的传感器。请注意，化学性缺血在此实验结束时导致表达ATeam 1.03 YEMK的神经元和星形胶质细胞中ATeam比率均出现预期的显著下降。将细胞外钾离子浓度从3毫摩尔升高至8毫摩尔并持续3分钟，并未引起表达ATeam 1.03 YEMK的神经元中可检测到的变化。

相比之下，星形胶质细胞在细胞外钾离子浓度升高时，其 ATeam FRET 比值出现可逆性升高，表明细胞内 ATP 水平上升。同样，化学性缺血导致 ATeam 比值立即下降，证明该传感器能够检测 ATP 的变化。在进行此处所述的基于 FRET 的细胞成像时，需注意在器官型培养中制备高质量脑片是关键步骤。

此外，还需要仔细清除胶质瘢痕并进行专家级成像。完成该操作步骤后，还应能够开展实验，结合使用其他基于FRET的纳米传感器来检测细胞代谢物，例如用于葡萄糖或乳酸的传感器。

最后但同样重要的是，必须始终遵守有关动物保护的相关法规。这一要求同样适用于管理转基因生物操作的有效法律法规。