Name: 使用基于 FRET 的传感器 ATeam1.03YEMK在小鼠大脑的组织切片中进行细胞内 ATP 成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 学习使用ATeam1.03YEMK FRET传感器在小鼠海马脑片培养物中进行神经元和星形胶质细胞内ATP水平的动态成像技术。该方法为研究活体脑组织能量代谢及缺血性中风等能量剥夺相关疾病的病理机制提供了可控实验环境。

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作者谨此感谢Claudia Roderigo和Simone Durry提供的专业技术支持。感谢Niklas J. Gerkau博士和Joel Nelson理学硕士在制备器官型脑片培养过程中的协助。作者实验室的研究工作由德国研究基金会（DFG；FOR 2795：Ro 2327/13-1 和 SPP 1757：Ro 2327/8-2，资助CRR；SPP 1757：青年胶质细胞启动资金，资助RL）资助。

作者声明无竞争利益。作者获得了德国杜塞尔多夫尼康显微镜解决方案公司（Nikon Microscope Solutions）的财务支持，以实现本视频文章的开放获取出版，该公司生产了本文所用视频中涉及的仪器。但该公司未参与本文所述实验的设计、实施、数据处理，也未参与手稿的撰写。

在此，我们演示了一种在小鼠脑组织切片培养物中的星形胶质细胞或神经元内，实现ATeam1.03YEMK（一种基于FRET的遗传编码纳米传感器14）细胞类型特异性表达的实验方法，用于检测ATP水平的变化15。在代表性记录中，我们显示，细胞外钾离子浓度的升高不会引起神经元内ATP浓度的变化，而星形胶质细胞的ATP水平则对此刺激产生上升反应。此外，我们的结果表明，在抑制细胞代谢后，ATeam1.03YEMK的FRET比值在两种细胞类型中均迅速下降，提示细胞内ATP水平快速降低。
在器官型脑片培养物中表达 ATeam1.03YEMK 需要在受控条件下维持组织培养至少 7–10 天。此外，ATeam1.03YEMK 也可用于急性分离的小鼠脑组织切片和视神经中 ATP 的检测13,15。然而，对急性分离组织的检测需要构建转基因动物或通过立体定位向脑内注射病毒载体，涉及动物实验及严格的动物护理规程。在这方面，器官型脑片培养物中表达 ATeam1.03YEMK 是一种有效且有价值的替代方法22,23。多年来，器官型脑片培养物已被确立为研究神经特性、连接性和发育的成熟模型系统24,25,26。它们不仅保留了组织的一般结构和层状排列（图 1），还具备细胞培养的优势特性，例如更高的可及性以及对实验条件的直接控制。器官型脑片培养物也常用于通过病毒载体表达外源基因27。已有多种类型的病毒载体被报道可用于向脑组织递送转基因16,28。腺病毒载体可在胶质细胞中诱导高水平表达，但在海马神经元中表达效果不佳16，并可能引发胶质细胞反应性17。而本研究中使用的腺相关病毒载体则是一种良好的替代选择15，其在体内的有效性也已得到证实29。
尽管器官型脑片培养物主要用于神经元特性的研究，但近期研究表明，它们也可用于星形胶质细胞的分析。培养的脑片通常被一层反应性星形胶质细胞覆盖19,30（图5），但在更深层中，星形胶质细胞表现出更接近天然状态的非反应性形态和细胞构筑19,30（图5）。在本研究中，我们描述了一种机械去除外层胶质瘢痕的方法，该操作可提高对器官型组织深层中天然星形胶质细胞进行实验操作和光学观测的可及性。此外，去除胶质瘢痕还能提升病毒在器官型脑片深层区域的转导效率；若不去除该瘢痕，腺相关病毒（AAVs）的转导可能主要局限于浅层细胞层。
在进行组织切片实验时，需要考虑多种外部机械因素。灌流速度的变化可能引起整个样本的移动和/或导致焦距变化，从而造成传感器信号出现人为的瞬时改变。此外，已有报道表明，星形胶质细胞和神经元均可对机械形变产生反应，例如高灌流速率所引起的形变32,33。在我们的实验条件下，使用可靠的蠕动泵，并保持组织与物镜之间盐溶液的体积较小且稳定（弯月面），可在本研究所用灌流速度下（1.5–2.5 mL/min；图8）获得稳定的FRET信号。
在本研究中，我们还证明了基于FRET的成像技术结合ATeam1.03YEMK可用于监测神经元和星形胶质细胞中的ATP水平。此前已提出一种替代方法用于细胞ATP测定，即所谓的荧光素-荧光素酶检测法34,35,36,37。然而，该方法基于生物发光成像，由于背景噪声水平较高，仅能提供较低的时间和空间分辨率。近年来另一种常规使用的方法是利用离子敏感型荧光探针镁绿（magnesium green）对细胞内镁离子浓度变化进行成像38,39,40。该方法依据的原理是ATP消耗会释放其辅因子镁离子。因此，使用镁绿成像仅能间接估算ATP水平的变化。此外，镁绿对细胞内钙离子浓度变化也具有敏感性，这在解读该方法所得结果时引入了另一重困难。
因此，近年来开发出的用于直接成像细胞代谢物的基因编码纳米传感器代表了重大进展11,12。已研发出多种不同的传感器，可用于细胞内ATP的检测36,41,42,43。其中包括比值型荧光ATP指示剂&#34;QUEEN&#34;41，以及可感知ATP:ADP比值的PercevalHR42。尽管后者是研究细胞能量状态的有力工具，但其应用需要同时检测pH的变化42。
ATeam 是一种纳米传感器，存在多种变体，这些变体在对 ATP 的结合亲和力方面有所不同14。在体外实验中，ATeam1.03YEMK 在 37 °C 时的 Kd 值为 1.2 mM，接近在不同类型的神经元细胞中测定的细胞内 ATP 水平，这些细胞包括下丘脑和小脑34以及海马体37,44,45。在比色皿测量中，将温度降低 10 °C 会导致 ATeam1.03YEMK 与 ATP 的结合亲和力显著下降，这表明该传感器在室温下进行细胞成像可能并不理想14。然而，我们先前的研究15表明，ATeam1.03YEMK 在神经元和星形胶质细胞中表达后，对各种干预的响应行为在接近生理温度和室温条件下相似，说明该传感器在两种条件下均可可靠地测定细胞内 ATP 水平。此外，我们之前的实验还探讨了细胞内表达的 ATeam1.03YEMK 对 pH 的敏感性15，结果显示其对细胞内 pH 变化约 0.1–0.2 个 pH 单位不敏感。如果低 mM 范围内的 Kd 值存在问题，可选用其他 ATeam 变体14，其中包括红移的 ATeam 变体（&#34;GO-ATeam&#34;）43。
我们使用 ATeam1.03YEMK 的实验表明，细胞外钾离子浓度仅升高数毫摩尔（从 3 mM 升至 8 mM）即可在脑片培养中的星形胶质细胞内引起 ATeam1.03YEMK 比值的短暂上升。该观察结果证实了先前的研究15,46，并明确表明星形胶质细胞会响应活跃神经元释放的钾离子而增加其 ATP 生成，这很可能是由于 Na+/K+-ATP 酶和 Na+/HCO3- 共转运体分别受到刺激所致47,48。与此相反，神经元未表现出响应，这也与以往的研究结果一致15。然而，这两种细胞类型均对细胞糖酵解和线粒体呼吸的抑制表现出快速而强烈的反应，这与先前报道相符15。在化学性缺血条件下，ATeam 的 FRET 比值下降至一个新的稳定水平，表明细胞内 ATP 出现显著耗竭。后一结果提示，即使在无突触激活或神经递质施加等额外刺激的稳态条件下，神经元和星形胶质细胞均存在显著的 ATP 消耗。综上所述，我们认为，基于 FRET 的成像技术结合基因编码的纳米传感器（包括 ATeam1.03YEMK）将为阐明不同条件下细胞内 ATP 水平变化及细胞 ATP 消耗所涉及的细胞过程提供一种有价值的手段。

神经元的兴奋性电活动主要依赖于钠离子（Na+）和钾离子（K+）等阳离子跨质膜的流动。因此，维持这两种离子的电化学梯度对于信号传导至关重要。这一过程由细胞膜上的Na+/K+-ATP酶（NKA）完成，NKA是一种普遍表达的生电型跨膜泵，每运输周期可将3个Na+排出细胞，同时摄入2个来自细胞外空间的K+，并消耗一分子ATP1。除了NKA外，还有多种消耗ATP的离子转运体，例如质膜Ca2+-ATP酶，该酶在活动诱导的钙内流之后，对维持细胞内Ca2+稳态及其外排具有关键作用2。在突触前囊泡中，一种液泡型H+-ATP酶（v-ATP酶）可建立质子梯度，该梯度是神经递质被摄入囊泡所必需的条件3。
尽管神经元的活动需要大量ATP4，但它们自身储存能量的能力却十分有限。相反，神经元似乎依赖于与邻近星形胶质细胞的代谢相互作用，后者是大脑中主要的糖原储存部位5。有研究提出，星形胶质细胞中的糖原确实在满足神经元能量需求方面发挥着重要作用；而在这类假定的神经元-胶质细胞代谢偶联中，一个关键现象是星形胶质细胞能够响应神经元活动而增强其ATP的生成能力6,7,8。这一假说被称为星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭（astrocyte-neuron lactate shuttle, ANLS），目前仍存在争议，因为其他研究已提供证据表明，神经元自身在受到刺激时也可能提高糖酵解速率9,10，这反映出有必要开发更多方法和技术来深入研究神经元与胶质细胞之间的相互作用。
长期以来，由于缺乏适用于检测脑组织活细胞中代谢物浓度变化的探针，对神经元和星形胶质细胞的能量代谢及ATP水平的研究一直受到阻碍。然而，过去十年中，针对多种代谢物（包括ATP、乳酸、丙酮酸等）的新型工具和基因编码的荧光探针得到了快速发展11,12。利用这些工具，现在可以在完整脑组织中，以单细胞分辨率和细胞类型特异性的方式，直接研究与细胞ATP消耗及细胞能量水平变化相关的问题13。
在本研究中，我们描述了一种用于可视化培养的脑片组织切片中神经元和星形胶质细胞胞质内ATP动态变化的方法。我们展示了如何利用腺相关病毒载体（AAV）在小鼠脑片的神经元和星形胶质细胞中实现基因编码的ATP纳米传感器ATeam1.03YEMK（14）的细胞类型特异性表达，这些脑片可在细胞培养条件下维持数周15。本文还介绍了一种去除覆盖在培养组织切片表面的胶质瘢痕的方法，从而改善对下方器官型组织层中细胞的光学通透性和成像效果。最后，我们展示了在此模型中如何利用ATeam1.03YEMK进行基于FRET的细胞ATP水平变化成像。该方法具有多项主要优势：无需进行脑部手术操作，在培养的脑片中可实现传感器的高表达水平和细胞类型特异性，与电穿孔转染或其他病毒载体转导等方法相比，对细胞的侵入性和应激更小10,16,17。此外，本方案也可应用于其他基于FRET的纳米传感器，包括ATeam1.03的若干变体，后者对ATP具有更低的结合亲和力14。

<table><tbody><tr><td>2-脱氧葡萄糖</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07338</td><td>不可代谢的葡萄糖类似物</td></tr><tr><td>36-IMA-410-019 氩离子激光器</td><td>Melles Griot</td><td></td><td>波长为488 nm的氩离子激光器</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Carl Roth</td><td>3525.1</td><td>抗氧化剂，维生素C</td></tr><tr><td>带通滤光片 483/32</td><td>AHF Analysentechnik AG</td><td></td><td>分光器兼容的发射滤光片</td></tr><tr><td>带通滤光片 542/27</td><td>AHF Analysentechnik AG</td><td></td><td>分光器兼容的发射滤光片</td></tr><tr><td>分光镜 T 455 LP</td><td>AHF Analysentechnik AG</td><td></td><td>激发用二向色镜</td></tr><tr><td>分光镜 T 505 LPXR</td><td>AHF Analysentechnik AG</td><td></td><td>分光用二向色镜</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜 C1</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>模块化共聚焦显微镜系统 C1</td></tr><tr><td>数据处理软件 Origin Pro 9.0.0 (64位)</td><td>OriginLab corporation</td><td></td><td>科学绘图与数据分析软件</td></tr><tr><td>D-葡萄糖一水合物</td><td>Caelo</td><td>2580-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO/Life</td><td>14190250</td><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>Eclipse E 600FN 正置显微镜</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse FN1 正置显微镜</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验腔室</td><td>定制</td><td></td><td>用于活细胞成像的灌流腔室</td></tr><tr><td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>共聚焦显微镜成像软件</td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9394</td><td>含酚红用于pH监测</td></tr><tr><td>HERAcell 150</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱 HERAcell &amp;reg; 150，带去污染程序</td></tr><tr><td>HERAsafe KS/KSP</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>安全柜</td></tr><tr><td>马血清</td><td>GIBCO/Life</td><td>26050088</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>Huygens Professional</td><td>SVI Imaging</td><td></td><td>去卷积软件</td></tr><tr><td>Image J 1.52i</td><td>Wayne Rasban 国家卫生研究院</td><td></td><td>公共领域可用的图像处理软件</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>牛胰腺来源胰岛素</td></tr><tr><td>IP系列蠕动泵</td><td>Ismatec</td><td></td><td>高精度多通道泵</td></tr><tr><td>排版软件 Illustrator CS6</td><td>Adobe</td><td></td><td>矢量图形编辑器</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>GIBCO/Life</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>振动切片机。Thermo Scientific目前已停止该设备的生产。任何其他适用于活体组织切片的切片机或组织切块器也可使用。</td></tr><tr><td>显微镜载物台</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 16</td><td>Microsoft</td><td></td><td>用于基础数据处理的电子表格软件</td></tr><tr><td>Millicell 培养插件</td><td>Merck Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>亲水性聚四氟乙烯（PTFE），孔径 0.4 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>最低必需培养基 Eagle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7278</td><td>合成细胞培养基</td></tr><tr><td>单色仪 Polychrome V</td><td>Thermo Scientific/FEI</td><td></td><td>超快速切换单色仪</td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;（叠氮化钠）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8032</td><td>线粒体抑制剂（复合体IV抑制剂）。注意：叠氮化物有毒，避免误食或吸入，并防止经皮肤吸收。</td></tr><tr><td>Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M &amp;infin;/0 WD 2.0</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>水浸式显微镜物镜</td></tr><tr><td>NIS Elements 4.50 advanced Research</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>成像软件。用于FRET成像的升级版本</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>数字CMOS相机</td></tr><tr><td>灌流管路</td><td>Pro Liquid GmbH</td><td></td><td>Tygon管路，1.52 × 322 mm（内径：0.85）</td></tr><tr><td>Photoshop CS6 版本 13.0</td><td>Adobe</td><td></td><td>图像处理软件</td></tr><tr><td>钠-L-乳酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71718-10G</td><td></td></tr><tr><td>ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)</td><td>ETH Z&amp;uuml;rich</td><td>v244</td><td>单链AAV载体，在人突触素1启动子片段hSyn1控制下诱导表达ATeam1.03&lt;sup&gt;YEMK&lt;/sup&gt;。</td></tr><tr><td>ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)</td><td>ETH Z&amp;uuml;rich</td><td>v307</td><td>单链AAV载体，在人胶质纤维酸性蛋白启动子片段ABC1D控制下诱导表达ATeam1.03&lt;sup&gt;YEMK&lt;/sup&gt;。</td></tr><tr><td>WVIEW GEMINI 光学系统</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>发射光图像分光器</td></tr></tbody></table>

使用基于fret的传感器ateam1.03yemk对小鼠脑组织切片中细胞内atp进行成像

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

中枢神经系统（CNS）中的神经元活动会引发对细胞能量的高需求，这些能量由三磷酸腺苷（ATP）的分解提供。其中很大一部分ATP用于重建因神经元电信号传导而破坏的质膜离子梯度。有证据表明，星形胶质细胞虽然自身不产生快速的电信号，但能响应神经元活动而增加ATP的生成，并通过向活跃的神经元提供能量代谢物来支持其功能。近年来，针对不同代谢物的基因编码传感器的发展，使得研究神经元与星形胶质细胞之间的此类代谢相互作用成为可能。本文中，我们描述了一种利用腺相关病毒载体（AAV），在小鼠海马和皮层的器官型脑片培养物中实现ATP敏感型荧光共振能量转移（FRET）传感器ATeam1.03YEMK在特定细胞类型中表达的实验方案。此外，我们还展示了如何利用该传感器动态测量细胞外钾离子浓度升高以及化学性缺血（即细胞能量代谢受抑制）诱导后，神经元和星形胶质细胞内ATP水平的变化。

AAV 载体是一种可靠的工具，可用于在活体组织中的特定细胞内选择性表达外源基因16。将含有 ATeam1.03YEMK 序列盒和特定启动子的 AAV 直接施加于组织，可在目标细胞类型中实现该传感器的高效表达。在体外培养的脑片组织中，转导约 10 天后（即 DIV 14），在切片表面以下深度达 50 µm 的新皮层区域，可在高密度下观察到在人源突触素启动子驱动下表达 ATeam 的神经元（图 5A）。在海马区也可获得类似结果（图 5B）。
<img alt="皮层和海马神经元培养，荧光显微镜，细胞分布的三维可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig5a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：培养的旁矢状面脑片中表达 ATeam1.03YEMK 的神经元的可视化。 左侧图像分别为皮层组织 43 个光学切片（每个 1.05 µm）的扩展焦面投影（A）和海马组织 70 个光学切片（每个 0.6 µm）的投影（B）。右侧图像表示相同投影的体积视图。细胞根据其相对于切片表面的深度进行颜色编码，颜色编码标准见右侧的颜色标尺。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为检测星形胶质细胞中的ATP水平，在人源胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子的调控下表达ATeam1.03YEMK。这可在培养的脑片组织的新皮层和海马区实现高效的细胞转导（图6）。值得注意的是，根据细胞在脑片中所处的深度不同，可区分出两种不同的形态表型。在浅层区域，细胞具有较粗大的初级突起，主要平行排列于脑片表面。这些细胞的结构域高度重叠，形成致密的网状结构，呈现出明显的反应性星形胶质细胞特征（图6）。而在较深层（距表面30–60 µm），转导的星形胶质细胞具有细密的细胞突起，形成近似球形的结构域，其形态与先前报道的原位星形胶质细胞相似19,20,21（图6）。为了更有效地转导深层星形胶质细胞并改善对这些深层区域的光学通透性，可按照步骤4所述方法去除胶质瘢痕组织。
<img alt="培养中的海马星形胶质细胞层；荧光显微镜；z轴堆栈深度分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig6a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：培养的旁矢状面脑片中表达ATeam1.03YEMK的星形胶质细胞的可视化。 左侧图像为191个光学切片（每个0.45 µm）的扩展焦面投影。为便于说明，星形胶质细胞的投影中已排除胶质瘢痕部分。右侧图像表示同一投影在去除胶质瘢痕前后的三维视图。细胞根据其相对于切片表面的深度进行颜色编码，颜色标尺见右侧所示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
成功表达 ATeam1.03YEMK 可实现对神经元或星形胶质细胞中 ATP 水平动态变化的检测，具体取决于所使用的启动子（见上文）。实验在持续灌流 E-ACSF（用 95% O2/5% CO2 气体饱和）的实验浴槽中进行。在海马神经元中表达 ATeam1.03YEMK 的脑片培养物中，于开始记录前选定感兴趣区域（ROIs），代表锥体细胞的胞体（图 7A）。此外，还选择了一个用于背景扣除的区域（图 7A）。随后分别采集每个 ROI 的 Venus 和 eCFP 荧光发射信号，并以随时间变化的荧光发射强度形式呈现（图 7B）。在对照条件下记录数分钟荧光信号，以确保基线稳定后，通过将脑片暴露于无葡萄糖人工脑脊液并添加 5 mM 叠氮化钠（NaN3）处理一分钟，抑制细胞代谢（图 7B）。该操作诱导了 FRET 供体-受体对发射强度的相反变化（图 7B，左图），表现为 Venus（527 nm）发射减少，而 eCFP（475 nm）发射增强。通过将 Venus 荧光发射强度除以 eCFP 荧光发射强度（FVenus/FeCFP）计算 FRET 比值，所得信号反映了细胞内 ATP 水平的相对变化，即所谓的“ATeam FRET 比值”（图 7B，右图）。在所有记录的神经元中（n = 70 个细胞，N = 5 片脑片），NaN3 引起 ATeam FRET 比值可逆性下降，表明在细胞代谢被抑制时，细胞内 ATP 水平出现可逆性降低。
<img alt="荧光比率成像；CA1海马神经元FRET分析；荧光反应图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig7a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：ATeam FRET比率成像的时间推移演示。（A）左上方：表达ATeam1.03YEMK的培养脑片海马CA1区锥体层和辐射层的宽场荧光图像，神经元中表达该探针。右上方：左侧方框区域的放大视图。白色线条标出用于分析的感兴趣区域（ROIs）1-3，代表CA1锥体神经元的胞体（见（B））。BG表示用于背景校正的感兴趣区域。下方：伪彩色图像，显示Venus（绿色）、eCFP（紫色）的荧光发射以及Venus/eCFP的比率。（B）在ROIs 1-3中的时间推移记录，代表神经元胞体（见图A）。左侧曲线显示Venus（绿色）和eCFP（品红色）的归一化荧光发射。右侧曲线显示相应的ATeam FRET比率。请注意，在无细胞外葡萄糖条件下灌注5 mM NaN3 1分钟（灰色条）会引起ATeam FRET比率的可逆性下降，表明细胞内ATP浓度降低。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig7alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为确保在长期实验条件下制备物和传感器的稳定性，表达ATeam的神经元或星形胶质细胞的脑片持续灌注人工脑脊液（ACSF）较长时间（>50 分钟；每组 n = 12 个细胞，N = 3 个脑片来自 3 个大脑）。在这些条件下，ATeam 的 FRET 比值未发生改变（图 8）。相比之下，将制备物暴露于含有代谢抑制剂的缺糖缺氧溶液（“化学性缺血”，见 表 1）时，ATeam 的 FRET 比值再次出现如上所述的预期下降。
<img alt="化学性缺血条件下神经元和星形胶质细胞的ATeam FRET比率图；时间与比率分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig8a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 8"> 
图8：使用ATeam的基线实验。 在基线条件下，对14个不同细胞中的神经元（上图）和星形胶质细胞（下图）进行长期ATeam FRET比率成像。数据采集条件与其他实验数据具有可比性。每次测量结束时，通过灌注CIS诱导化学性缺血，如箭头所示。注意：在基线条件下，ATeam FRET比率随时间保持稳定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
接下来，我们分析了表达 ATeam1.03YEMK 的神经元和星形胶质细胞对细胞外钾离子浓度升高的反应。在建立稳定的基线后，用钾离子浓度从 3 mM 升至 8 mM 的生理盐水灌注神经元，持续 3 分钟（图 9A）。然而，该操作并未引起 ATeam FRET 比值的可检测变化（n = 56 个细胞，N = 5 个脑片）。为确认该传感器能够响应 ATP 水平的变化，随后再次将脑片暴露于化学性缺血状态，即用 CIS 液体替代 E-ACSF 以诱导持续的缺血。化学性缺血导致 ATeam FRET 比值迅速下降至一个新的稳定水平，表明在 2–3 分钟内 ATP 几乎耗竭（图 9A）。
<img alt="神经元和星形胶质细胞的FRET分析；比值及对化学性缺血的反应、显微镜图像、图表结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig9a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图9"> 
图9：代表性实验，展示神经元和星形胶质细胞中ATP水平的变化。（A、B）：左侧图像显示来自海马CA1区脑片中神经元和星形胶质细胞的ATeam荧光信号。右侧曲线表示从单个细胞胞体区域（ROI）获得的ATeam FRET比值的时间序列记录。在两个实验中，脑片首先暴露于细胞外钾离子浓度升高环境持续3分钟（见图中横条），随后最终接受化学性缺血处理。请注意，神经元对细胞外钾离子浓度升高无反应（A），而星形胶质细胞则表现出ATP水平上升（B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
相同的实验方案在表达ATeam1.03的脑片中进行YEMK 在星形胶质细胞中表达。与在神经元中观察到的结果相反，星形胶质细胞对外界钾离子浓度升高的反应表现为ATeam FRET比率可逆性升高，提示细胞内ATP水平上升（n = 70个细胞，N = 5个脑片）图9B）。随后暴露于化学性缺血环境后，ATeam FRET比率显著下降，表明细胞内ATP几乎耗尽，该结果符合预期。图9B).

我们描述了一种在小鼠前脑器官型脑片培养物中实现基因编码的基于FRET的传感器ATeam1.03YEMK细胞类型特异性表达的实验方案。此外，我们展示了如何利用该传感器对神经元和星形胶质细胞中的细胞ATP水平进行动态成像。

使用基于FRET的传感器ATeam1.03YEMK对小鼠脑组织切片中细胞内ATP进行成像

中枢神经系统（CNS）中的神经元活动会引发细胞对能量的高需求，这些能量由三磷酸腺苷（ATP）分解提供。

本文展示了如何在器官型培养的小鼠海马脑片中，利用ATP敏感的FRET传感器ATeam 1.03 YEMK对神经元和星形胶质细胞内ATP水平的动态变化进行实时测量。该技术的主要优势在于，可在受控条件下、在传感器表达水平较高的环境中，研究活体脑组织中的能量代谢。该方法有助于深入理解由能量剥夺（例如缺血性卒中）所导致的疾病或脑损伤背后的病理机制。原则上，该方法不仅可用于研究脑组织中的ATP水平，也可用于其他器官。要成功开展本实验，必须极其小心地完成组织培养过程中的所有步骤，并保持无菌状态。此外，还需具备一定的细胞荧光成像知识。在大多数复杂操作中，组织处理及可视化对于理解正确操作流程至关重要。成像实验同样如此。本次操作将由来自实验室的博士后Rodrigo Lerchundi和硕士生Na Huang进行演示。在装有冰冻ACSF的冰冷培养皿中，将脑组织置于滤膜上。分离半球后，以45度角进行旁矢状切面切割。用超级胶水将其中一个半球固定在振动切片机的组织台上，并立即将组织块转移至装有经5%二氧化碳和95%氧气混合气体饱和的冰冻ACSF的振动切片机浴槽中。将组织置于振动切片机（Vibratome）的浴槽中并调整位置。将第二个半脑置于冰冻的ACSF中直至切片。调节振动切片机，使其切片厚度为250至400微米。切片后，根据海马结构典型的形态学特征进行识别，并使用皮下注射针分离海马，保留邻近海马的脑皮层组织。将切片置于盛有ACSF的网架上，于34摄氏度、持续通入5%二氧化碳和95%氧气的环境中孵育，直至收集完所有切片。随后将切片转移至层流柜中，继续在无菌条件下操作。使用倒置的无菌玻璃巴斯德移液管，将切片从 ACSF 轻柔地转移至其中一个预热的、装有无菌 Hank's 盐溶液的培养皿中。更换移液管后，将切片转移至第二个培养皿。重复此过程共五次。转移至后续培养板时，尽量减少HBSS的带入量。使用移液器将脑片逐片轻柔地放置于培养插件表面，避免移液过程中产生涡流，并等待脑片完全沉降至巴斯德移液管的尖端后再释放。对每一片切片重复此步骤。将两片切片放置于膜上。使用细尖吸头小心吸去插入物表面多余的汉克溶液。将培养物置于含5%二氧化碳、37摄氏度的加湿培养箱中，直至实验当天。每两到三天更换一次培养基。在不接触组织的情况下，将0.5微升稀释后的载体直接加到每个切片的表面。最后，将切片放回培养箱中，并至少继续培养六天。在开始实验前，将含有培养切片的插入物转移至无菌操作台，放入一个含有1毫升器官型切片培养基或最低必需培养基（MEM）的30毫米培养皿中。将培养皿置于体视显微镜下，聚焦到切片表面。使用两根无菌皮下注射针，在选定脑片的窄边处进行短的十字切口，切口位于上层，注意不要损伤下方的组织。为将制备好的脑片从插入物中取出，用镊子夹住膜的边缘，使用无菌手术刀在膜上做直线平行切口，形成一个将脑片置于中央的方形或三角形。如果插入物上还载有其他脑片，则将其放回原培养板并重新放入培养箱中。培养基的表面张力会防止其渗漏到膜的表面。通过将实验用人工脑脊液（ACSF）连接至碳合气体供应管路，并用95%氧气和5%二氧化碳混合气体通气至少三十分钟，调节其pH值至7.4。在整个实验过程中持续对灌流液进行气体通气。然后打开单色器的荧光光源。将器官型脑片培养物转移至实验腔室。将网格放置在器官型脑片培养物上方，框架朝下，不接触培养物，丝线朝上，接触膜表面。将灌流室置于显微镜载物台上，并连接至灌流系统。开启蠕动泵，调节流速为每分钟1.5至2.5毫升。确保灌流系统无泄漏。使用透射光将培养的脑片调至焦点，并确定实验操作区域。在开始成像实验前，需等待至少15分钟，使脑片适应灌流液环境，然后打开相机和成像软件。在435纳米波长下激发供体荧光蛋白。将曝光时间设置在40至90毫秒之间。然后将二向色镜和滤光片插入光束分光器单元中。使用500纳米的发射光分光器分离荧光发射，并采用带通滤光片（482 ± 16 纳米和542 ± 13.5 纳米）进一步分离供体和受体荧光。选择一个看似无细胞荧光的区域作为背景扣除。在屏幕上圈选标记组织中的单个结构以创建感兴趣区域（ROI）。设置图像采集频率和总记录时间。对于超过30分钟的实验，建议以0.2至0.5赫兹的采集频率进行，以防止光毒性。随后开始记录。为诱导细胞内ATP的变化，将灌流管从标准ACSF溶液切换至含有代谢抑制剂的生理盐水，例如化学性缺血溶液。或者，使用含较高钾离子浓度（8 毫摩尔）的生理盐水，以模拟活跃神经元释放的钾离子。记录完成后，立即将实验用人工脑脊液（ACSF）更换为HEPES缓冲的ACSF，随后将含有脑片培养物的记录室转移至共聚焦激光扫描显微镜进行观察。在给定的光学配置下，以尽可能高的Z轴分辨率采集Z轴层扫图像。在本实验方案中，转导十天后，在培养的脑片新皮层中，可在切片表面下深达50微米的范围内观察到高密度表达ATeam 1.03 YEMK的神经元。在海马区也获得了类似的结果。对于星形胶质细胞，ATeam 1.03 YEMK 在人胶质纤维酸性蛋白启动子的调控下表达，而在海马神经元中表达 ATeam 1.03 YEMK 的脑片所选定的 ROI 代表锥体细胞的胞体。在无细胞外葡萄糖的条件下，用 5 毫摩尔叠氮化钠处理脑片 1 分钟后，FRET 供体对的发射强度出现相反的变化。同时观察到 ATeam FRET 比值可逆性降低。在基础条件下，14个不同细胞中长期的ATeam FRET比率显示，ATeam是一种可靠且稳定的传感器。请注意，化学性缺血在此实验结束时导致表达ATeam 1.03 YEMK的神经元和星形胶质细胞中ATeam比率均出现预期的显著下降。将细胞外钾离子浓度从3毫摩尔升高至8毫摩尔并持续3分钟，并未引起表达ATeam 1.03 YEMK的神经元中可检测到的变化。相比之下，星形胶质细胞在细胞外钾离子浓度升高时，其 ATeam FRET 比值出现可逆性升高，表明细胞内 ATP 水平上升。同样，化学性缺血导致 ATeam 比值立即下降，证明该传感器能够检测 ATP 的变化。在进行此处所述的基于 FRET 的细胞成像时，需注意在器官型培养中制备高质量脑片是关键步骤。此外，还需要仔细清除胶质瘢痕并进行专家级成像。完成该操作步骤后，还应能够开展实验，结合使用其他基于FRET的纳米传感器来检测细胞代谢物，例如用于葡萄糖或乳酸的传感器。最后但同样重要的是，必须始终遵守有关动物保护的相关法规。这一要求同样适用于管理转基因生物操作的有效法律法规。

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