使用基于 FRET 的传感器 ATeam1.03^YEMK在小鼠大脑的组织切片中进行细胞内 ATP 成像

我们描述了基于基因编码的FRET传感器ATeam1.03^YEMK在小鼠前脑的有机切片培养物中细胞型特定表达的协议。此外，我们演示如何使用此传感器对神经元和星形细胞中的细胞ATP水平进行动态成像。

在这里，我们演示如何使用 ATP 敏感的 FRET 传感器 ATeam 1.03 YEMK 对有机培养小鼠海马切片中神经元和天体细胞 ATP 水平的变化进行动态测量。该技术的主要优点是，一个人可以在受控环境中研究活脑组织中的能量代谢，环境具有高传感器表达水平。这种技术可能有助于深入了解病理机能、基础疾病或脑损伤，例如由能量剥夺（如缺血性中风）引起的脑损伤。

原则上，它可以用来研究ATP水平，不仅在脑组织，但在其他器官。要成功运行这个实验，必须执行所有步骤，涉及培养组织非常小心，并保持不育性。此外，还需要一些细胞荧光成像知识。

最复杂的组织处理和可视化对于了解正确的程序至关重要。成像实验也是如此。演示这个程序的将是博士后罗德里戈·勒春迪和实验室硕士生娜·黄。

在装满ACSF的冰冷的培养皿中，将大脑放在滤膜上。分离半球，以45度的角度进行抛物线切割。用超级胶水修复振动组组织阶段的一个半球，并立即将组织块转移到含有冰冷 ACSF 的振动池，其中含有 5% 的二氧化碳和 95% 的氧气。

对齐振动浴中的组织。将第二个半球留在冰冷的ACSF中，直到切片。调整振动器以在 250 到 400 微米时切割切片。

切片后，根据海马的典型形态特征确定海马形成，并使用皮下针将其分离，使大脑皮层的一部分与海马相邻。将切片放在 ACSF 中的网格上，加热至 34 摄氏度，用 5%的二氧化碳和 95% 的氧气冒泡，直到收集所有切片。将切片转移到层流柜，在无菌条件下继续。

使用倒置、无菌的玻璃巴斯德移液器，轻轻地将切片从 ACSF 转移到充满无菌汉克斯盐溶液的预热培养皿中。更换移液器，将切片转移到第二个培养皿。整个过程重复五次。

将 HBSS 尽可能少地转移到以下培养板。使用移液器，一次轻轻地将一个切片放在培养器插入的顶部。避免移液器中的湍流，并等待切片下降到巴斯德移液器的尖端。

对每个切片重复此过程。在膜上放两片。使用精细尖端小心地从刀片顶部取出多余的 Hank 溶液。

在实验当天之前，将培养物保持在5%的二氧化碳和37摄氏度的加湿培养箱中。每两到三天更换一次介质。在不接触组织的情况下，将稀释载体的0.5微升直接涂抹到每个切片的顶部。

最后，将切片放回孵化器中，并在那里至少多维护六天。在开始实验之前，将含有培养切片的插入物转移到无菌罩中，并将其放入含有一毫升有机切片培养介质或最小基本介质的 30 毫米盘中。将盘子放在立体镜下，并聚焦在切片表面。

使用两个无菌皮下针，在所选切片的狭窄边缘和上层进行短交叉切割，而不会损坏下面的组织。要从刀片中去除准备好的切片，请用钳子握住膜的边缘，并使用无菌手术刀对膜进行直线平行切割，形成一个方形或三角形，片片位于中心。如果插入主机额外的切片，将其转移回原始板并放入培养箱。

介质的表面张力将防止其泄漏到膜表面。准备实验性ACSF，并通过连接到碳原供应的插入管进行至少30分钟的冒泡，用95%的氧气和5%的二氧化碳进行泡泡，获得7.4的pH值。在整个实验中保持盐水冒泡。

然后打开单色计的荧光灯源。将有机切片培养器转移到实验室。将网格放在有机切片培养物的顶部，将框架向下放置，不接触培养物，将线向上，触摸膜。

将腔室放在显微镜舞台上，将其连接到灌注系统。以每分钟 1.5 到 2.5 毫升的流量打开近位泵。确保灌注系统没有泄漏。

使用传输光，将培养的切片聚焦到焦点上，并确定应进行实验的区域。在开始成像实验之前，请等待至少 15 分钟，让切片适应盐水条件，然后打开相机和成像软件。在435纳米时激发供体荧光蛋白。

将曝光时间设置为 40 到 90 毫秒之间。然后将二色镜和过滤器插入分束单元。将荧光发射在500纳米时与发射图像分路器分离，并在482加负16和542加减13.5纳米时采用带通滤波器，以进一步隔离供体和接受方荧光。

选择明显没有细胞荧光的感兴趣区域进行背景减法。在屏幕上的图像中圈出标记组织的单个结构以创建 RO。设置图像采集的频率和整体录制时间。

对于超过 30 分钟的实验，建议采集频率为 0.2 至 0.5 赫兹，以防止光毒性。随后，开始录制。为了诱导细胞内ATP的变化，将灌注管从标准ACSF切换到含有代谢抑制剂的盐水，例如化学缺血溶液。

或者，使用钾浓度在8毫摩尔时升高的盐水来模拟活性神经元中钾离子的释放。在录制之后，将实验ACSF与堆缓冲的ACSF交换。然后将包含切片培养的录音室转移到共和激光扫描显微镜。

以给定光学配置中可能的最高 Z 分辨率拍摄 Z 堆栈图像。在此协议中，在转导十天后，在培养组织切片的新皮质中，在切片表面以下高达50微米的深度，在高密度地发现了表达 ATeam 1.03 YEMK 的神经元。在海马体中取得了类似的结果。

对于星形细胞，ATeam 1.03 YEMK在人类胶质纤维酸蛋白促进物的控制之下表达，在海马神经元中表达 ATeam 1.03 YEMK 的器官切片代表金字塔细胞的母细胞。在没有细胞外葡萄糖的情况下将切片暴露在5毫摩尔钠阿齐德中一分钟后，FRET对的发射强度发生相反的变化。也观察到 ATeam FRET 比率的可逆降低。

在神经元和星细胞的基线条件下，14个不同细胞的长期 ATeam FRET 比率表明 ATeam 是一个可靠而稳定的传感器。请注意，化学缺血导致本实验结束时，两种细胞类型的 ATeam 比率预期大幅下降。细胞外钾浓度从3微摩尔增加至8毫摩尔3分钟，未导致表达 ATeam 1.03 YEMK 的神经元发生可检测到的变化。

相比之下，星形细胞通过 ATeam FRET 比率的可逆增加对细胞外钾的增加做出反应，表明细胞内 ATP 水平增加。同样，化学缺血导致 ATeam 比率立即下降，表明传感器可以检测 ATP 的变化。在尝试基于 FRET 的细胞成像时，请注意，在有机培养中生产高质量切片是关键步骤。

此外，需要小心地去除胶质疤痕和专家级成像。按照这个程序，人们还应该能够进行实验，结合不同的其他基于F FRET的纳米传感器的细胞代谢物。例如，那些葡萄糖或乳酸。

最后，但并非最不重要的一点，需要强调，必须始终遵守保护动物的相关行为。管理转基因生物的有效法律也是如此。