Name: Abbiategrasso 脑库协议，用于收集、处理和描述老化的大脑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 了解Abbiategrasso脑库的标准化流程，用于采集、处理和描述老化大脑组织。该方案通过精确解剖技术获取高质量样本，支持神经退行性疾病的诊断与病理机制研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们谨将本工作献给Michela Mangieri博士。在她不幸早逝之前，她构思并启动了Abbiategrasso脑库项目。
我们衷心感谢脑组织捐献者，他们慷慨地捐献了自己身体中最崇高的器官，为科学研究作出了贡献；没有他们的奉献，这项研究将无法进行。
我们感谢 Valeria Marzagalli 在 ABB 项目中所做的宝贵工作。
作者感谢 Johannes Attems 教授、Paolo Fociani 博士和 Giorgio Giaccone 博士提供的宝贵指导和睿智建议。
我们谨向 Alice Cirrincione 博士和 Giulia Bortone 女士在整个项目过程中提供的宝贵帮助表示感谢。 
衷心感谢 Tere Cassani 女士的支持，以及“意大利阿尔茨海默病联合会”（Federazione Alzheimer Italia）的协作。 
作者感谢帕维亚大学公共卫生、实验与法医学系的 Matteo Moretti 博士和 Antonio Marco Maria Osculati 教授。

作者无任何利益冲突需要披露。

实验方案中的关键步骤 
我们的目标是获取、表征并储存来自具有通过纵向观察获得详细病史受试者的高质量组织。为实现这一目标，需重点关注以下关键环节。如上所述，该方案始于供体招募，这是第一个关键步骤。随后，必须确保供体持续参与随访计划，并在项目期间长期保持依从性，直至最终完成脑组织捐献。在供体死亡时，必须立即通知ABB工作人员，以便在24小时内召集尸检团队，这对保证组织质量至关重要。大脑半球的新鲜切片操作需要稳定的手法和专门的培训。为避免因缓慢冷冻导致的细胞损伤，并获得适用于冷冻切片机及组学分析的高质量切片，必须迅速进行冷冻处理。考虑到甲醛溶液的渗透速度（1 mm/小时），为保持组织的抗原性，单个切片的浸泡时间应尽可能缩短。
方法的故障排除 
为了解决上述关键步骤，我们提出以下方法。供体招募与随访依从性：影响脑组织捐献的因素有多种，包括对死后身体形态、纯洁性和完整性可能受损的担忧，或担心死亡后仍可能感到疼痛。有些人甚至担心尸体解剖可能在他们尚未完全死亡时进行70,71。此外，还存在对葬礼安排被打扰以及经济负担的顾虑72。同时，医务人员对死后程序缺乏了解，无法有效回应潜在捐献者或其直系亲属（NOK）的疑虑，也可能阻碍登记。这些因素综合作用可能导致公众认知度低、注册参与者数量少，并随时间推移出现较高的捐献者流失率。因此，供体招募项目必须高效地普及相关知识，建立公众信任，并说服人们注册，同时保持较高的随访参与率。根据我们的经验，这需要对潜在捐献者进行谨慎筛选，并充分解释脑库（BB）的目的。我们开展教育活动，并以富有同理心的方式回应健康人群、神经退行性疾病患者及其家属的担忧与需求。我们发现，面对面沟通时，潜在捐献者更倾向于同意捐献。这种面对面的交流方式能够建立基于相互信任与尊重的关系，这对于实现较高的脑捐献注册率和随访评估参与率至关重要。一支训练有素且具备高度伦理意识的团队首先接触潜在捐献者，讨论死后捐献大脑的可能性，阐明人脑组织对神经科学研究的重要价值，并解答有关死后程序的任何疑问。良好的口碑传播同样重要。在脑组织采集后，应妥善处理并恢复遗体外观。以温和的方式对待遗体，体现对逝者的尊重与感激之情。数月之后，若家属提出要求，将安排一次会议，向其通报神经病理学分析的结果。
死亡时间与脑组织采集：当个人同意捐献后，将成为捐献者，并获得一张带有编号的身份证件，该编号可全天24小时、每周7天联系（即与我们相连的ASP Golgi-Redaelli老年病医院的接待电话）。此外，捐献者的亲属会收到一张粘贴标签，以备住院时使用。本地区的殡葬机构此前已被告知，需将遗体运送至ABB设施，以便召集尸体解剖团队。解剖团队由一名病理学家、一名神经学家和/或神经生物学家以及一名解剖室技术员组成，每日从早上6点至晚上11点待命；此外，常有受训学生在场协助并拍摄记录。
新鲜切片操作的精确性和一致性由两名操作者（一名神经科医生和一名病理学家）完成，他们共同开发了该方法，并在神经病理学领域拥有多年的实践经验。在冷冻切片时，将切片置于预冷的铝制托盘上，并用带互锁结构的铝板覆盖，以确保其保持平整。随后立即放入液氮中冷冻3分钟，之后储存在-80 °C条件下。需要固定的切片则需用纱布单独包裹，浸入10%磷酸盐缓冲甲醛溶液中，并在24小时后更换新鲜固定液。此后，切片在甲醛溶液中保存时间不超过额外5天；然而，考虑到甲醛溶液的渗透速度约为1 mm/天，我们希望进一步缩短浸泡时间。
方法的局限性 
本文所描述的研究方法仅覆盖有限的地理区域，且参与捐献项目的个体特征并不能完全代表总体人群。尽管死后间隔时间在24小时以内已属可接受范围，但仍可能导致脑组织中某些蛋白质结构、酶和RNA发生改变。AFS和pH值的测定可能不足以完全准确地评估组织质量73&#160;，我们正在开发基于RNA完整性评估组织质量的其他验证方法。
关于切片机切片操作，尽管该方法在重建解剖结构关系方面非常有用，但需注意使用大体切片并不简单，且存在一些技术难点。我们的方法具有挑战性且耗时较长。成本相当高，资金支持并不总是容易获得。资金主要来源于公共机构（ASP Golgi-Redaelli 老年病医院）和私人资源（Golgi-Cenci 基金会）、私人捐赠、非营利组织（例如“Federazione Alzheimer Italia”）以及科研项目资助。
与现有/替代方法相比，ABB 方法的重要性 
最初，我们的脑捐献项目针对的是参与 InveCe.Ab 纵向研究的个体。因此，所捐献的脑组织均附有多年来收集的详细临床、生物学和社会信息。ABB 的优势正源于这一独特的来源。事实上，研究一组在社会和基因上相关、共享生物学特征和环境暴露的人群，能够增强统计分析能力。此外，该项目还包括以下优势：1）关注并满足社区需求（“先给予，再索取”的理念）：参与者可免费接受定期健康检查，其全科医生会获知检查结果，我们秘书的联系电话可供咨询使用，对严重残疾者提供上门探访服务；2）通过组织定期研讨会（主题涉及脑健康、脑捐献及整体健康）以及策划专题课程（例如老年人使用信息技术设备），吸引参与者、担任公职者及全科医生参与教育活动；3）与民众面对面交流，采取直接互动的方式。上述所有要素构成了 ABB 项目的强大基础。此外，该项目还提升了参与医务人员的临床能力，使其在生前评估和死后神经病理学检查方面积累了丰富经验。在此，我们想特别提及“少数族裔老龄化研究”（The minority aging research study）这一非常独特的项目。该研究纳入了居住在芝加哥地区的一小部分经过筛选的非裔美国人（共1,357名符合条件的受试者中有784人参与，应答率为57%）。研究人员每年上门随访参与者，并邀请他们加入脑捐献项目。该研究采用了一种非传统的模式，与我们的方法有一定相似之处，在脑捐献项目中获得了较高的应答率（784名参与者中有352人登记捐献，占44%），但尸检率尚不理想（53%）74。与“少数族裔老龄化研究”类似，我们通过开展教育活动和富有同理心的沟通方式，取得了优异成果。具体而言，我们的应答率达到93%，登记参与率为28.7%，目前的尸检率为67%。这些数据表明，直接与民众建立联系的项目能够获得更高比例的脑组织捐献。相比之下，其他脑捐献项目若未能重视与潜在捐献者建立关系，其登记率通常较低，仅为10-15%或更低73,75。
既往以神经病理学分析为终点的队列研究较少。此外，大多数脑库和样本库均以疾病为中心，与“患病”脑组织相比，来自健康捐献者的“对照”脑组织极为稀缺。仅有少数脑库基于人群研究，同时纳入患病和正常个体，以研究衰老轨迹73,74,76,77,78,79,80。一些研究，例如美国的“少数民族老龄化研究”74&#160;和芬兰的“Vantaa 85+研究”76&#160;，与我们的研究类似，但往往随着队列研究的结束而终止。相比之下，ABB的捐献项目预计将在未来长期持续，即使在InveCe.Ab纵向研究结束后，仍将继续招募潜在捐献者并安排随访。这一方法使我们的招募方式与&#34;阳光健康研究所（Sun Health Research Institute, SHRI）脑捐献项目&#34;相似，后者针对的是退休社区人群73。SHRI的脑组织捐献方案效率极高，其平均死后取材间隔时间（postmortem interval）为全球最短（3.92小时）。与全球最大的脑库类似，SHRI方案将大脑半球、小脑和脑干沿中线（矢状面）切开，其中一半新鲜解剖后冷冻，用于生化研究，另一半则用福尔马林固定，用于组织病理学评估。然而，SHRI解剖方案的一个优势在于对单个脑片进行分别固定，而非固定整个半球。事实上，整体固定半球并不理想，因为表面与核心之间的固定梯度存在差异。此外，皮层蛋白可能因长时间暴露于福尔马林溶液而受到影响。因此，我们决定对单个脑片进行分别固定。
固定或冷冻哪一侧脑组织的决定，取决于单一脑库（始终相同、随机分配，或根据解剖日期为奇数或偶数来分配）31,32,33,34,35。因此，对每个半球分别进行生化和组织病理学分析。由于许多神经系统疾病具有不对称性，我们的脑库（BB）提供了一种独特的切片新鲜标本方案：从脑干以及小脑和大脑的每个半球交替保留切片，分别作为固定或冷冻样本；一侧半球的固定切片对应另一侧半球的冷冻切片。该方法使我们能够对所有冷冻样本进行全面的组织学表征，并比较两侧所有区域的结果。如引言所述，该方法可使我们从脑组织中获取尽可能多的信息。此外，ABB 的方法可提供基础但完整的神经病理学特征描述，涵盖几乎所有已知的脑蛋白病变和血管病变。鉴于血管损伤在导致认知功能障碍中的作用尚存争议，我们决定对血管负荷采用双重评分标准30,53。
如实验方案所述，我们采用多学科交叉的方法。尽管这种方法耗时且工作量大，但我们认为其在科研中具有多项优势。例如，在之前的一项研究中，我们已证明高同型半胱氨酸血症（tHcy）本身，或MTHFR C677T TT基因型与APOE-ε4等位基因的联合，可能与执行功能障碍相关，而非记忆丧失81。因此，从神经病理学层面评估具有此类特定遗传特征的受试者可能具有重要意义。这正是通过对我们生物样本库中收集的生物材料进行研究，以验证新科研假设的实例之一。我们方法的另一优势体现在常规评估中纳入定量脑电图（QEEG），因其具有创新性且操作相对简便。实际上，脑电图（EEG）通过记录大脑皮层锥体神经元树突的电位活动，来检测突触功能82。QEEG可被视为评估与认知功能相关的皮层突触活动的生物标志物83。特别是，脑后部α节律减弱并伴随低频节律（theta和delta节律）普遍增强，已被认为与皮层连接中断相关。需要指出的是，大多数诊断相关性研究均基于临床诊断，而临床诊断仅为可能诊断，而非确定性诊断84,85,86,87。仅有极少数针对性研究将QEEG数据与神经病理学表现进行比对，以探讨QEEG与LTS变异型之间的相关性88,89，以及FTLD与AD之间的区别83。通过在本研究中最终确立神经病理学诊断，我们便能够准确解读脑电活动的观察结果。此外，通过对每位受试者进行系列QEEG检测，可追踪个体内部脑电波的动态轨迹及其与神经病理学表现的相关性。长期追踪个体皮层电活动的变化，有助于更深入理解其作为轻度痴呆早期生物标志物的意义。
该方法的未来应用与发展方向 
实现组织分布是我们未来的主要目标之一。为此，我们刚刚成立了一个科学委员会，成员包括GC基金会（老年医学）主任、帕维亚大学神经学教授，以及两名分别来自GC基金会的神经科医生和病理科医生。 &amp;#38; 中国台湾老年病医院ASP Golgi-Redaelli。在分发脑组织、组织学切片及其他生物样本时，必须牢记捐赠者同意捐献的目的是用于科学研究。因此，样本的分发应谨慎进行，具体操作应严格遵循BNE行为准则中的相关规定。40任何申请材料的单位应注明所需样本的类型和数量，提供研究项目的描述以及样本将如何使用的说明，并在可能的情况下，提供以往发表成果的证明（转让协议详见 图9）。脑库不以营利为目的，因此研究人员支付的费用仅用于覆盖组织获取、处理、储存和分发的成本。
目前正在推进利用外显子组测序及组学技术（如蛋白质组学和转录组学）开展病例分析的计划。我们采用的替代取样方法将使得组学研究能够在组织学上明确定义的双侧半球组织上进行。通过该方法，可比较同一半球不同脑区以及对侧半球对应区域的基因激活模式，并能够将基因激活情况与组织病理学特征相关联。在这一领域，深度学习的应用将极具前景，包括组织学切片的计算机化分析，以及临床数据、组织学数据与组学数据之间的前沿性关联分析。此外，还可识别多种不同变量之间的其他相关性，并探索其他潜在的技术应用。双侧半球冷冻样本的可获取性，将有助于精确描绘基因激活和蛋白质分布的空间定位。即使在健康个体中，这一研究也具有特殊意义，因为大脑功能及某些疾病本身即具有不对称性。
此外，我们可以从特征明确的脑组织供体中获得细胞培养物。事实上，从获取的脑组织中分离出的软脑膜细胞可提供活细胞，结合诱导性多能干细胞（iPSCs）技术，将软脑膜成纤维细胞重编程并分化为神经细胞，用于构建高级模型，进一步研究疾病或衰老机制90。
随着大脑衰老，分子、细胞和组织水平上可能发生不同的变化特征。每一大脑都是独特的，各自以不同的方式应对内部和外部的应激因素；有些大脑能够抵抗损伤，而另一些则易受损害并表现出明显的病理改变。临床表现与神经病理学特征之间常存在差异，因为临床表现主要取决于病变的解剖分布，而非其分子本质。只有将临床综合征与神经病理学发现相结合，才能实现准确且明确的诊断，而神经病理学结果往往能提供重要的病因学线索，有助于揭示疾病的发病机制。在欧洲，人们正致力于建立神经病理学诊断的标准化方法。我们的诊断方案几乎完全遵循最近发表的脑库神经病理学诊断指南91。这将使我们能够收集并共享经过良好记录的脑组织，未来目标是建立首个意大利脑库。事实上，意大利目前虽有一些脑组织样本库，但尚无基于队列研究的脑库。我们的目标是开发一种可在意大利广泛实施的脑组织采集方法，建立一个采用统一操作流程并共享可比样本的协作网络。为此，未来的主要目标包括联合其他研究中心以及建立专门的网站。
创新技术正不断被用于分析神经退行性疾病的分子特征及生物标志物的鉴定。在此背景下，迫切需要获取伴随纵向研究所得认知与衰老轨迹信息的脑组织样本，这凸显了神经病理学验证的流行病学研究方法的重要性92。

根据世界卫生组织（WHO）的数据，目前约有5000万人患有痴呆症，这一数字预计到2050年将增至三倍。阿尔茨海默病是导致痴呆的主要原因，其次是脑血管疾病及其他与年龄相关的神经退行性疾病。2017年，世界卫生组织建立了全球痴呆观察站，旨在提高公众对痴呆症的认识，并推动制定全球应对痴呆的行动计划1。每个人的大脑衰老轨迹各不相同，因此由于神经退行性疾病发病机制的复杂性，寻找治愈方法具有挑战性。也许，每个人的脑组织中都记录着独特的发病机制，需要采取个体化的研究策略。因此，对脑组织的研究将是理解神经退行机制的关键。
回顾神经科学的历史，我们意识到，最令人印象深刻且具有突破性的发现，无一不是基于对人脑的直接研究。随着时间推移，用于研究的脑组织来源已从早期粗糙的解剖、偶然的“意外获取”，甚至在某些情况下的非法交易，逐步发展为有组织的脑组织库以及现代战略性脑库。对诸多伦理问题的考量，是现代脑库区别于过去脑组织收藏的主要因素之一。真正意义上的首批现代脑库（BBs）建立于20世纪下半叶th 世纪。尼古拉斯·科塞尔利斯（Nicholas Corsellis）和华莱士·图尔泰洛特（Wallace Tourtelotte）可被视为现代脑库事业的先驱。在英国，科塞尔利斯建立了一个收藏量超过1000例大脑的样本库，这些大脑均患有各种精神和神经系统疾病，且病例资料详实。2此外，Corsellis 帮助揭示了为进行生化检测而将新鲜脑组织保存在冰中的必要性。3与此同时，在美国，Wallace Tourtelotte 推出了生前脑组织捐献计划，以促进潜在脑组织捐献者的招募，并确保所收集的脑组织附有完整的医学和神经学病史记录。4,5。有关脑库的历史概述及现代脑库的更多信息，参见 Carlos 等6.
那么，我们为何仍需要人脑研究？脑部疾病的明确诊断唯有通过神经病理学检查才能确定。神经病理学能够验证临床诊断的准确性，是正确解读临床症状以及发现新综合征亚型组织学基础的关键。事实上，诊断往往需依据病理表现重新界定。然而，由于近年来神经影像技术的创新发展，尸检率在过去几十年中持续下降。借助脑成像技术，可评估大脑中的形态学、功能及代谢改变，以及蛋白质错误折叠的程度。 体内。然而， 体内 神经影像学及其他生物标志物研究只能提供病理状况的“估计”，因为它们无法检测到细微的细胞和分子变化。分子影像学的进步以及新生物标志物、靶分子和示踪剂的发现7 （例如淀粉样蛋白、TAU、小胶质细胞示踪剂）使得人脑在解读临床评估和生物标志物检测所获得的数据方面变得更加不可或缺。此外，对新鲜和冷冻脑组织进行的组学技术（基因组学、表观基因组学、转录组学、代谢组学、蛋白质组学、脂质组学等）为理解疾病机制以及发现风险基因、新型诊断和预后标志物及潜在药物靶点开辟了新的可能性8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
出于这些目的，现代脑库（BBs）保存了特征明确、高质量的脑组织，并向科学界提供这些资源3,24。脑库所提供的脑组织应附有完整的临床病史。脑库的运作包括以下内容：（1）识别并招募患有疾病和健康的个体加入脑组织捐献计划；理想情况下，应对捐献者进行终身多学科随访，以获取完整的临床资料、生活方式与社会背景信息以及生物标志物谱型；事实上，认知储备和脑结构受生活方式及社会教育因素的影响25,26，因此这些信息能够丰富现有的整体数据。（2）在捐献者去世后，依照标准化的法律和伦理规范，获取脑组织（包括大脑、小脑和脑干）及相关组织（如脊髓、颅神经和神经节等）。（3）根据标准化的操作规程，对脑组织进行适当的处理（如解剖、固定、冷冻），以获得高质量的组织样本，并确保其可用于未来的多学科研究。（4）进行详细的神经病理学表征，提供最终的确诊诊断。（5）将组织材料储存并向科研社区分发27,28。
所有脑库（BB）均储存冷冻组织和福尔马林固定石蜡包埋组织。每个脑库都有其自身的操作流程。除特定研究外（例如新泽西州生物医学研究所的双半球切片方案29以及Deramecourt关于脑血管病理学的研究30），全球规模较大的脑库通常仅沿中线（矢状面）将大脑、小脑和脑干切开。其中一半组织以新鲜状态解剖后冷冻，用于生化研究；另一半则用福尔马林固定，用于组织病理学评估。因此，生化分析和组织病理学分析分别在两个半球上独立进行。至于哪一侧固定、哪一侧冷冻（侧向性选择），则取决于各个脑库的具体规定31,32,33,34,35。由于许多神经系统疾病具有不对称性，本脑库提供一种独特的鲜脑切片方案：脑干及两侧半球的相邻切片交替进行固定与冷冻处理；一侧半球的固定切片对应另一侧半球的冷冻切片。通过该方法，可最大化利用脑组织，并实现对所有冷冻样本的完整组织学表征，同时能够获取并比较双侧半球各区域的组织学与生化信息。
我们脑库项目的研究范围位于意大利北部米兰市西南约22公里处的小镇阿比亚泰格拉索（Abbiategrasso）。该镇人口约为32,600人，是Golgi-Cenci（GC）基金会所在地。GC基金会隶属于一家大型老年康复医院（ASP Golgi-Redaelli），是一家专注于老龄化研究及老年人照护的机构，尤其致力于研究心理老化过程、影响老化的社会与行为因素，以及与年龄相关的神经认知障碍（NCDs）背后的生物学机制和病理基础。2009年，GC基金会启动了一项新的纵向研究，共纳入1321名参与者（符合条件的1644人中有80.3%响应率），这些参与者均为1935至1939年出生（年龄介于70–75岁之间）、高加索人种，并居住在同一小范围地理区域内。该研究命名为InveCe.Ab（Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso；英文含义：阿比亚泰格拉索脑老化研究，ClinicalTrials.gov, NCT01345110），目前仍在持续进行中。InveCe.Ab旨在建立一个具有最大同质性和最小变异性的队列，以评估痴呆的发病率、患病率及其自然病程，同时分析其可能的危险或保护因素，包括行为、心理社会、临床和生物学变量36。该队列的特征见图1和Table 1。流行病学数据显示，该队列结果与欧洲人群的痴呆趋势一致37,38，且InveCe.Ab参与者具有相似的遗传和环境特征，是研究从正常老化向神经认知障碍演变轨迹的理想模型。事实上，同质性较高的群体所需样本量更小即可达到足够的统计效能。InveCe.Ab的研究方法此前已有报道36，但需特别强调其多维度的研究设计，即通过每2–3年一次的定期随访，采用统一的评估工具，包括：采血（代谢指标、同型半胱氨酸和维生素检测、DNA提取以分析载脂蛋白E（APOE）及其他与认知和老化相关的遗传多态性）、人体测量（体重、身高和腰围）、行走时说话测试（双重任务测试）、生活方式访谈（地中海饮食依从性、体力活动水平和认知参与度）和社会因素评估（社会参与度、孤独感）、神经心理学评估以及临床体格检查。将此类纵向数据与死后神经病理学数据进行比较，对科研具有重要意义。因此，我们的团队，特别是Michela Mangieri博士，提出了上述神经病理学研究方案。自2014年第二次随访起，InveCe.Ab的参与者被邀请捐献大脑，由此促成了阿比亚泰格拉索脑库（ABB）的诞生。ABB的核心捐献者为InveCe.Ab的参与者，但目前也向其他志愿捐献者开放，包括来自ASP Golgi-Redaelli医院的患者（其中许多患有不同类型的神经系统疾病），以及通过了解ABB项目而自愿参与、且来自同一地理区域（阿比亚泰格拉索及其周边地区）的成年志愿者。所有捐献者均接受相同的评估流程。
作者提出了一种方法，用于追踪正常衰老的个体轨迹以及向非传染性疾病（NCDs）可能发展的进程，并对通过纵向随访获得的此类供体脑组织进行准确的管理、处理和特征分析。此外，我们的目标是通过定期的神经学评估、讲座及有关脑健康的教育活动，与个体建立联系并促进其参与，同时提高他们对为科研目的捐献脑组织的认知与意识。

<table><tbody><tr><td>50ml 聚丙烯锥形管 30x115mm</td><td>BD</td><td>405253</td><td></td></tr><tr><td>抗 GFAP 抗体</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>多克隆一抗（抗兔）；稀释比例 = 1:1000</td></tr><tr><td>抗 NeuN (A60) 抗体</td><td>Chemicon</td><td>MAB377</td><td>单克隆一抗（抗小鼠）；稀释比例 = 1:1000</td></tr><tr><td>抗磷酸化 TAU 抗体 (AT8)</td><td>ThermoScientific</td><td>MN1020</td><td>单克隆一抗（抗小鼠）；稀释比例 = 1:200</td></tr><tr><td>抗磷酸化 TDP-43 抗体 (pS409/410-2)</td><td>CosmoBio</td><td>TIP-PTD-P02</td><td>多克隆一抗（抗兔）；稀释比例 = 1:4000；预处理：在微波炉中分三步加热，分别为 2 分钟、1 分钟、2 分钟，使用 0.01M 柠檬酸缓冲液，pH 6</td></tr><tr><td>抗-&amp;alpha;-SYN 抗体 (KM51)</td><td>Novocastra</td><td>NCL-L-ASYN</td><td>单克隆一抗（抗小鼠）；稀释比例 = 1:500；预处理：1）在微波炉中分三步加热，分别为 2 分钟、1 分钟、2 分钟，使用 0.01M 柠檬酸缓冲液，pH 6；2）使用 70% 甲酸水溶液处理 10 分钟</td></tr><tr><td>抗-&amp;beta;淀粉样蛋白抗体 (4G8)</td><td>BioLegend</td><td>800703</td><td>单克隆一抗（抗小鼠）；稀释比例 = 1:1000；预处理：使用 70% 甲酸水溶液处理 10 分钟</td></tr><tr><td>切片板</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基</td><td>Carlo Erba</td><td>FA30WL0101500</td><td>培养基</td></tr><tr><td>带 5d 刀片的电动锯</td><td>CEA</td><td>06.06.14/06.00.16</td><td></td></tr><tr><td>12mm 表面 pH 电极</td><td>CEA</td><td>70064.250 HHH</td><td></td></tr><tr><td>pH 针状电极</td><td>Fisher Scientific</td><td>11796338</td><td></td></tr><tr><td>EnVision+ 系统-HRP</td><td>Dako</td><td>K4001</td><td>二抗（抗小鼠）；稀释比例 1:2</td></tr><tr><td>EnVision+ 系统-HRP</td><td>Dako</td><td>K4003</td><td>二抗（抗兔）；稀释比例 1:2</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>SMI</td><td>8401530</td><td></td></tr><tr><td>Feather 安全修边刀片 14cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>11749798</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Carlo Erba</td><td>FA30WS1810500</td><td>培养基添加剂；稀释比例 = 20%</td></tr><tr><td>15cm 外科或解剖镊子</td><td>Uvex</td><td>500XG</td><td></td></tr><tr><td>手套</td><td>CEA</td><td>01.28.14</td><td></td></tr><tr><td>胶水</td><td>Arcobaleno</td><td>2624000800002</td><td></td></tr><tr><td>头部支撑器</td><td>Lacor</td><td>60456</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 (100X)</td><td>Carlo Erba</td><td>FA30WX0550100</td><td>培养基添加剂；稀释比例 = 1%</td></tr><tr><td>卷尺</td><td>CEABIS</td><td>CEATA34</td><td></td></tr><tr><td>非吸附性单丝黑色聚酰胺线</td><td>UHU Bostik</td><td>8000053131470</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸溶液 (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>培养基添加剂；稀释比例 = 1%</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液 (100X)</td><td>Carlo Erba</td><td>FA30WL0022100</td><td>培养基添加剂；稀释比例 = 1%</td></tr><tr><td>Quincke 型 20GA 3.50 英寸脊髓穿刺针 0.9x90mm</td><td>CEA</td><td>03.06.16</td><td></td></tr><tr><td>带 n&amp;deg;21 刀片的一次性手术刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科托盘</td><td>Olcelli Farmaceutica</td><td>A930857255</td><td></td></tr><tr><td>外科锤和外科凿</td><td>CEA</td><td>79.68.88</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>CEA</td><td>27.08.45/79.68.64</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Feather</td><td>M130RC</td><td></td></tr></tbody></table>

abbiategrasso脑库衰老大脑采集、处理与表征操作规程

Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

在人口持续老龄化的背景下，神经退行性疾病的患病率预计会上升。了解疾病机制是寻找预防和治疗方法的关键。实现这一目标最有效的方式是直接检查患病和健康的脑组织。作者介绍了一种方案，用于获取、处理、鉴定和储存来自生前脑组织捐献项目登记个体所捐赠的高质量脑组织。该捐献项目包括以共情方式与个体进行面对面沟通，收集补充性的临床、生物学、社会和生活方式信息，并通过长期连续的多维度评估，追踪个体在正常衰老和认知衰退过程中的变化轨迹。由于许多神经系统疾病具有不对称性，本脑库提供了一种独特的鲜组织切片方案：将大脑两半球的脑组织切片交替进行冷冻（-80 °C）或福尔马林固定；一侧半球的固定切片与另一侧半球的冷冻切片相对应。通过该方法，可对所有冷冻样本进行完整的组织病理学表征，同时可在组织病理学明确界定的双侧半球组织上开展组学研究，从而更全面地评估神经退行性疾病的发病机制。这些疾病的准确且确定的诊断，只有在结合临床综合征与神经病理学评估的基础上才能实现，而神经病理学评估往往能提供解释发病机制所必需的重要病因学线索。该方法可能存在耗时、成本较高以及地理覆盖范围有限等局限性。尽管如此，其所提供的高度表征数据仍具有重要价值。我们的最终目标是建立意大利首个脑库，同时强调经神经病理学验证的流行病学研究的重要性。

本方案描述了一种通过脑组织捐献项目及对脑组织进行适当表征来追踪个体脑衰老轨迹的方法。脑捐献者参与了一项长期纵向研究，包括系列多维度评估。本方案包含脑组织处理的详细描述以及准确的诊断方法学。

Abbiategrasso脑库衰老大脑采集、处理与表征操作规程

在持续老龄化的群体中，神经退行性疾病的患病率预计会上升。理解疾病机制是找到……的关键

随着神经认知障碍患病率持续上升，我们的目标是获取、鉴定并储存高质量的脑组织样本，以实现准确诊断，并揭示神经退行性病变的机制。考虑到脑的不对称性，我们的取样方法使得所有荟萃研究均可在组织学明确定义的双侧半球组织上进行，同时可通过深度学习收集并整合大量数据。多种病理因素对脑损伤的叠加效应常被观察到。明确诊断需要结合临床综合征与神经病理学发现，以揭示疾病的发病机制及可能的治疗方法。新鲜组织切片操作以及大体切片管理具有挑战性，但对获得良好结果至关重要。一支训练有素且配合默契的团队对于克服这些困难至关重要。我们的方案包含一系列需要哺乳动物灵巧操作的步骤，因此对于希望掌握这些技术的研究人员而言，视觉演示可能比文字描述更为有效。确认死亡后，使用锋利的手术刀在冠状面从一侧乳突尖端至另一侧，经过头顶点，切开皮肤及皮下组织，形成头皮切口。小心地将头皮两层组织从颅骨上分离，并继续切开，直至可见黄色的眼眶上脂肪。将头皮向前翻起，并将另一部分组织向后牵拉。使用手术刀和镊子，在颅骨两侧各取一小块颞肌样本，将其中一份标本置于4%甲醛溶液中，另一份置于4摄氏度环境中。使用电动锯在额部进行V形切割，打开颅骨并移除颅盖。剪开脑膜后，取一块硬脑膜用于固定，另一块用于冷冻。将连接10毫升注射器的20号3.5英寸针头插入胼胝体以到达第三脑室，回抽活塞以获取约10毫升脑脊液。观察液体的外观、颜色和浑浊度，并测定pH值。轻轻牵拉两侧额叶以抬起大脑，切断视神经、漏斗部、颈内动脉以及第三、第四、第五和第六对脑神经。切开小脑幕以进入后颅窝，切断椎动脉和低位脑神经。随后将手术刀尽可能深地经枕骨大孔插入，切断延髓最尾端部分，并小心取出整个脑组织。使用手术刀暴露Meckel腔上方的骨质，并从两侧取下三叉神经节，用于固定和冷冻。使用手术锤和凿子敲开骨性蝶鞍，取出垂体腺并用4%甲醛固定。检查颅骨和全脑是否存在肉眼可见的改变及血管变化。使用卷尺测量脑的横径和前后径，并用天平称量脑的重量。仔细取出大脑Willis环，进行肉眼评估，观察是否存在解剖变异、病变或血管狭窄。分离并检查大脑、小脑和脑干，随后分别称重各组织。从脑凸面取下一至两块、每块两至四平方厘米大小的软脑膜组织，将样本保存在完全高糖DMEM培养基中，置于4°C条件下。取松果体用于4%多聚甲醛固定，并取嗅球和视神经各一对，分别用于固定和冷冻保存。将大脑、小脑和脑干置于冰上，保持在4°C条件下。当所有目标组织采集完毕后，使用超强黏性胶将骨骼重新粘合，并使用手术针和不可吸收缝线将头皮缝合。用于脑库解剖时，用解剖刀在脑干轴向进行切割，第一刀在中脑前部水平，穿过上丘，以获得两个切片，暴露黑质。将脑干切成10个8毫米厚的切片，注意包含通过脑桥前部、靠近第四脑室上缘的切面，以观察蓝斑，以及通过延髓下部、听纹下方、紧邻第四脑室下端尖部上方的切面，以获得包含迷走神经背核的切片。按照从头端到尾端的方向对所有切片进行标记，脑干切片以 BS 加阿拉伯数字表示。最后一个脑干切片之后，脊髓切片以 SC 加阿拉伯数字表示。在小脑蚓部水平沿矢状面将小脑切成左右两个半球，并继续进行矢状切面切割，使每个半球获得五个切片。将小脑蚓部的所有切片分别命名为右侧小脑的CBR和左侧小脑的CBL，并使用阿拉伯数字标识每个切片。接下来，在矢状面上通过胼胝体将大脑的两个半球分开，然后在冠状面上进行单一切割，切面通过视交叉与乳头体之间，穿过额叶颞极、前扣带回、前连合、minor核以及基底神经节。在后方约一厘米处进行第二次切割，切面通过乳头体，暴露基底神经节、前丘脑、下丘脑和杏仁核。继续切割，分离前部和后部区域，直至每个半球获得15至21厘米的切片。将切片按其在前后方向上从额极到枕极的原始位置，依次平放在平坦表面上，使与前一切片相连的部分朝上。当所有切片放置完毕后，选择主要用于固定以进行组织病理学检查的主要切片区段，包括先前获取的切片以及海马、顶叶和枕叶区段，并用L或R标记切片，后跟阿拉伯数字，同时标注该切片是用于固定还是冷冻。当所有组织切片完成并标记后，在固定或冷冻之前，应为每一系列切片获取图像。为冷冻样本，将预留的交替组织切片置于预冷的铝制托盘上，并用相互锁合的铝板覆盖切片以保持其平整。随后将切片在液氮中冷冻三分钟，然后将冷冻后的样本放入塑料袋中，塑料袋上需标注相应的识别代码和切片编号，并存放在-80摄氏度的适当低温冻存盒中。为了固定样本，将预留的备用组织切片分别包裹在纱布中，并将切片置于10%磷酸盐缓冲甲醛溶液中，在4°C冷藏室中保存五天。所获取的27个脑组织样本中，有24个接受了完整的神经病理学特征分析，并获得了明确的临床病理诊断。对一系列36名脑捐献者进行的初步定量脑电图分析表明，与正常老年人及轻度神经认知障碍者相比，重度神经认知障碍患者的主要α节律百分比显著降低。此处展示了一例不对称性病理，右侧脑组织萎缩在肉眼观察下明显可见，右侧冠状切面显示脑室严重扩张，与左侧形成对比。另一病例显示右侧大脑半球梗死，而另一标本则表现出右侧乳头体明显萎缩。大体切片可通过染色来识别髓鞘丢失或半球内免疫反应性的分布情况。这些样本来自一对双胞胎，由于表观遗传和环境因素，他们在不同时间出现阿尔茨海默病的临床发病。然而，显微镜分析显示两者具有非常相似的神经病理学特征，表明存在显著的阿尔茨海默病病理改变和淀粉样血管病。但在另外两名患者中，相同的阿尔茨海默病临床诊断与神经病理特征并不完全对应，其病理结果揭示了多种病因共同导致的混合性痴呆。事实上，首例病例在单回和黑质中出现了路易小体。第二例病例则在杏仁核及迷走神经背核中显示出与路易神经突相关的路易小体。切片照片经过仔细拍摄，以便在显微镜分析过程中准确定位解剖区域。单一切片的固定与冷冻对于保存组织微结构、基因激活和蛋白质分布的空间特征，并将这些数据与组织病理学相关联也至关重要。来自特征明确组织的细胞培养也用于疾病发病机制的研究。由于脑组织被视为具有潜在传染性，且操作过程中需使用锐器和液氮等危险工具，因此必须始终穿戴适当的个人防护装备。

abbiategrasso-brain-bank-protocol-for-collecting-processing

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

Abbiategrasso 脑库协议，用于收集、处理和描述老化的大脑

脑库建设及生物样本的系统性取样为无偏倚的体视学分析奠定了基础，并最大限度地提高了从每个标本中获取的数据量。...

脑库建设：充分利用您的科研样本

本文描述了从脑组织样本制备，到使用刀刃扫描显微镜进行连续切片成像，再到数据可视化与分析的完整流程。该技术目前用于获取小鼠脑部数据，但也适用于其他器官和其他物种。...

样本制备、成像与刀锋扫描显微镜分析方案

该视频演示了对固定后的尸检人脑进行对称解剖的逐步操作流程，并制备用于进一步分析的小块组织样本。...

人类尸检脑组织的对称双半球切片

利用磁共振成像（人类）、3D成像软件以及免疫组织化学分析，我们记录了大脑侧脑室的变化。随后在小鼠模型中模拟人类大脑因衰老或疾病引起的侧脑室体积的纵向3D图谱变化，以及脑室周围细胞变化的特征。...

人和小鼠侧脑室的三维建模及室周组织的组织学表征

系统化的脑组织切片程序对于将特定的神经精神现象与明确的神经病理学诊断相关联至关重要。根据不同的临床与学术需求，脑组织切片方法存在多种差异。本方案描述了一种对称的双半球脑切片程序，旨在研究人类脑病理学中的半球差异，并最大限度地利用当前及未来的生物分子/神经影像技术。...

对称双半球尸检脑组织切取技术用于研究人类健康与病理脑状态

本实验方案的总体目标是通过制备定制的3D打印脑组织固定装置和切片盒，精确地将磁共振成像（MRI）图像数据与组织学切片进行配准。...

利用3D打印技术融合MRI与组织学：一种脑切片方案

来自人脑组织的分离脑毛细血管可作为临床前模型，用于研究生理和病理生理条件下血脑屏障的功能。本文中，我们介绍了一种从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管的优化方案。...

从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管

我们提出一种方法，该方法能够 为神经退行性变早期事件提供进一步见解，并基于已建立的 离体 脑技术，结合了以下优势 体内 和 体外...

使用替代方法研究神经退行性变早期事件 离体 大鼠脑切片

基于基质辅助激光解吸/电离成像质谱技术（MALDI-IMS）的分子成像可实现对生物样本中多种分析物的同步定位。本文介绍了一种利用MALDI-IMS检测和可视化阿尔茨海默病及脑淀粉样血管病样本脑组织中β淀粉样蛋白的实验方案。...

利用基质辅助激光解吸/电离成像质谱法可视化人脑中的淀粉样蛋白β沉积

多发性硬化症是一种炎性脱髓鞘疾病，目前尚无治愈方法。对脑组织的分析为理解该疾病的发病机制提供了重要线索。本文讨论了通过克利夫兰诊所特有的快速尸检项目所采集的多发性硬化症脑组织样本的研究方法及其后续分析。...

多发性硬化症患者全面尸检项目

本实验方案描述了利用廉价且常见的工具采集离散的冷冻脑区，以获得高质量蛋白质和RNA的方法。...

用于后续分析的冷冻啮齿类动物脑区采集

了解Abbiategrasso脑库的标准化流程，用于采集、处理和描述老化大脑组织。该方案通过精确解剖技术获取高质量样本，支持神经退行性疾病的诊断与病理机制研究。

Abbiategrasso脑库衰老大脑采集、处理与表征操作规程

探索更多视频