Abbiategrasso脑库衰老大脑采集、处理与表征操作规程

随着神经认知障碍患病率持续上升，我们的目标是获取、鉴定并储存高质量的脑组织样本，以实现准确诊断，并揭示神经退行性病变的机制。考虑到脑的不对称性，我们的取样方法使得所有荟萃研究均可在组织学明确定义的双侧半球组织上进行，同时可通过深度学习收集并整合大量数据。多种病理因素对脑损伤的叠加效应常被观察到。

明确诊断需要结合临床综合征与神经病理学发现，以揭示疾病的发病机制及可能的治疗方法。新鲜组织切片操作以及大体切片管理具有挑战性，但对获得良好结果至关重要。一支训练有素且配合默契的团队对于克服这些困难至关重要。

我们的方案包含一系列需要哺乳动物灵巧操作的步骤，因此对于希望掌握这些技术的研究人员而言，视觉演示可能比文字描述更为有效。确认死亡后，使用锋利的手术刀在冠状面从一侧乳突尖端至另一侧，经过头顶点，切开皮肤及皮下组织，形成头皮切口。小心地将头皮两层组织从颅骨上分离，并继续切开，直至可见黄色的眼眶上脂肪。

将头皮向前翻起，并将另一部分组织向后牵拉。使用手术刀和镊子，在颅骨两侧各取一小块颞肌样本，将其中一份标本置于4%甲醛溶液中，另一份置于4摄氏度环境中。使用电动锯在额部进行V形切割，打开颅骨并移除颅盖。

剪开脑膜后，取一块硬脑膜用于固定，另一块用于冷冻。将连接10毫升注射器的20号3.5英寸针头插入胼胝体以到达第三脑室，回抽活塞以获取约10毫升脑脊液。观察液体的外观、颜色和浑浊度，并测定pH值。

轻轻牵拉两侧额叶以抬起大脑，切断视神经、漏斗部、颈内动脉以及第三、第四、第五和第六对脑神经。切开小脑幕以进入后颅窝，切断椎动脉和低位脑神经。随后将手术刀尽可能深地经枕骨大孔插入，切断延髓最尾端部分，并小心取出整个脑组织。

使用手术刀暴露Meckel腔上方的骨质，并从两侧取下三叉神经节，用于固定和冷冻。使用手术锤和凿子敲开骨性蝶鞍，取出垂体腺并用4%甲醛固定。检查颅骨和全脑是否存在肉眼可见的改变及血管变化。

使用卷尺测量脑的横径和前后径，并用天平称量脑的重量。仔细取出大脑Willis环，进行肉眼评估，观察是否存在解剖变异、病变或血管狭窄。分离并检查大脑、小脑和脑干，随后分别称重各组织。

从脑凸面取下一至两块、每块两至四平方厘米大小的软脑膜组织，将样本保存在完全高糖DMEM培养基中，置于4°C条件下。取松果体用于4%多聚甲醛固定，并取嗅球和视神经各一对，分别用于固定和冷冻保存。将大脑、小脑和脑干置于冰上，保持在4°C条件下。

当所有目标组织采集完毕后，使用超强黏性胶将骨骼重新粘合，并使用手术针和不可吸收缝线将头皮缝合。用于脑库解剖时，用解剖刀在脑干轴向进行切割，第一刀在中脑前部水平，穿过上丘，以获得两个切片，暴露黑质。将脑干切成10个8毫米厚的切片，注意包含通过脑桥前部、靠近第四脑室上缘的切面，以观察蓝斑，以及通过延髓下部、听纹下方、紧邻第四脑室下端尖部上方的切面，以获得包含迷走神经背核的切片。

按照从头端到尾端的方向对所有切片进行标记，脑干切片以 BS 加阿拉伯数字表示。最后一个脑干切片之后，脊髓切片以 SC 加阿拉伯数字表示。在小脑蚓部水平沿矢状面将小脑切成左右两个半球，并继续进行矢状切面切割，使每个半球获得五个切片。

将小脑蚓部的所有切片分别命名为右侧小脑的CBR和左侧小脑的CBL，并使用阿拉伯数字标识每个切片。接下来，在矢状面上通过胼胝体将大脑的两个半球分开，然后在冠状面上进行单一切割，切面通过视交叉与乳头体之间，穿过额叶颞极、前扣带回、前连合、minor核以及基底神经节。在后方约一厘米处进行第二次切割，切面通过乳头体，暴露基底神经节、前丘脑、下丘脑和杏仁核。

继续切割，分离前部和后部区域，直至每个半球获得15至21厘米的切片。将切片按其在前后方向上从额极到枕极的原始位置，依次平放在平坦表面上，使与前一切片相连的部分朝上。当所有切片放置完毕后，选择主要用于固定以进行组织病理学检查的主要切片区段，包括先前获取的切片以及海马、顶叶和枕叶区段，并用L或R标记切片，后跟阿拉伯数字，同时标注该切片是用于固定还是冷冻。

当所有组织切片完成并标记后，在固定或冷冻之前，应为每一系列切片获取图像。为冷冻样本，将预留的交替组织切片置于预冷的铝制托盘上，并用相互锁合的铝板覆盖切片以保持其平整。随后将切片在液氮中冷冻三分钟，然后将冷冻后的样本放入塑料袋中，塑料袋上需标注相应的识别代码和切片编号，并存放在-80摄氏度的适当低温冻存盒中。

为了固定样本，将预留的备用组织切片分别包裹在纱布中，并将切片置于10%磷酸盐缓冲甲醛溶液中，在4°C冷藏室中保存五天。所获取的27个脑组织样本中，有24个接受了完整的神经病理学特征分析，并获得了明确的临床病理诊断。对一系列36名脑捐献者进行的初步定量脑电图分析表明，与正常老年人及轻度神经认知障碍者相比，重度神经认知障碍患者的主要α节律百分比显著降低。

此处展示了一例不对称性病理，右侧脑组织萎缩在肉眼观察下明显可见，右侧冠状切面显示脑室严重扩张，与左侧形成对比。另一病例显示右侧大脑半球梗死，而另一标本则表现出右侧乳头体明显萎缩。大体切片可通过染色来识别髓鞘丢失或半球内免疫反应性的分布情况。

这些样本来自一对双胞胎，由于表观遗传和环境因素，他们在不同时间出现阿尔茨海默病的临床发病。然而，显微镜分析显示两者具有非常相似的神经病理学特征，表明存在显著的阿尔茨海默病病理改变和淀粉样血管病。但在另外两名患者中，相同的阿尔茨海默病临床诊断与神经病理特征并不完全对应，其病理结果揭示了多种病因共同导致的混合性痴呆。

事实上，首例病例在单回和黑质中出现了路易小体。第二例病例则在杏仁核及迷走神经背核中显示出与路易神经突相关的路易小体。切片照片经过仔细拍摄，以便在显微镜分析过程中准确定位解剖区域。

单一切片的固定与冷冻对于保存组织微结构、基因激活和蛋白质分布的空间特征，并将这些数据与组织病理学相关联也至关重要。来自特征明确组织的细胞培养也用于疾病发病机制的研究。由于脑组织被视为具有潜在传染性，且操作过程中需使用锐器和液氮等危险工具，因此必须始终穿戴适当的个人防护装备。