Name: 在伪单体中生成帧内基因删除突变体，并在简单小鼠感染模型中测试病毒衰减 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 了解在铜绿假单胞菌中创建基因缺失突变体的方法，并使用可重复的小鼠感染模型测试毒力减弱效果。该方案为微生物学和感染性疾病研究提供了可靠的实验基础。

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本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目R44GM113545和P20GM103434的支持。

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作者 Hongwei D. Yu 是 Progenesis Technologies, LLC 的首席科学官兼联合创始人。

pEX100T-Not1 质粒是一种高效的介导工具，可用于实现无标记且保持读码框的连续基因组缺失。在构建减毒细菌菌株时，相较于引入点突变，完全删除基因序列可降低回复突变为强毒表型的可能性。此外，每缺失一个致病性基因，病原体的毒力会进一步减弱，从而增强减毒的稳定性。
通过简单修改质粒插入片段的设计，该方法也可用于产生除缺失以外的其他基因组修饰，例如点突变和插入。对于改造具有修饰代谢途径的细菌而言，这类修饰可能比整个基因的缺失更具实用性。连续的基因组修饰在构建适用于科研和工业特定用途的定制化细菌菌株方面具有重要意义。已有其他方法被用于在细菌中实现所需的无标记基因组修饰15,16,17,18。与所有基因组编辑方法一样，对基因组关键区域进行的修饰尝试可能是致死性的，因而无法成功。在这些情况下，需要鉴定不同的遗传修饰或其他候选基因，以获得...

铜绿假单胞菌 是一种机会性细菌病原体，可在人类中引起危及生命的疾病，尤其是在免疫功能低下者中。该病原体的致病性 P. aeruginosa 是由于表达多种毒力因子，包括蛋白酶和脂多糖，以及其形成保护性生物膜的能力1由于其能够产生毒力因子并在人类中引发疾病，使用 P. aeruginosa 用于商业产品时存在安全问题。非致病性菌株 E. coli 传统上已被用于生物工程化开发供人类使用的医药和商业产品。然而，某些产品对于 E. coli 以进行生产，且许多产物会形成包涵体，导致提取过程繁琐耗时。能够合成并分泌特定产物的基因工程菌株极具应用价值，因为分泌表达有望提高产量并简化纯化流程。因此，其他细菌物种中的非致病性菌株（例如具有更多分泌途径的物种）可能为 E. coli我们最近报道了一种菌株的开发 P. aeruginosa，PGN5，其中该生物体的致病性和毒性显著减弱2重要的是，该菌株仍能大量产生多糖海藻酸盐，这是一种具有商业价值的成分 P. aeruginosa 生物膜
PGN5 菌株是利用 pEX100T-NotI 质粒通过两步等位基因交换方法构建的，依次删除了五个已知参与该生物体致病性的基因（toxA、plcH、phzM、wapR、aroA）。pEX100T-NotI 是通过将质粒 pEX100T 多克隆位点中的 SmaI 限制性酶切位点改造为 NotI 限制性酶切位点而获得的，pEX100T 最初由 Herbert Schweizer 实验室开发3,4。NotI 限制性内切酶的识别序列相较于 SmaI 更为罕见，因此在待克隆序列中出现的可能性更低，更适合用于克隆操作。该质粒携带可用于筛选的基因，包括编码 β-内酰胺酶并赋予羧苄青霉素抗性的 bla 基因，以及赋予蔗糖敏感性的 B. subtilis sacB 基因（图 1A）。此外，该质粒还含有可在 E. coli 中复制的复制起点（ori），以及可在接合过程中介导质粒从 E. coli 转移至 Pseudomonas 属的转移起点（oriT）。然而，该质粒缺乏能在 Pseudomonas 中起始复制的复制起点，因此无法在 Pseudomonas 中自主复制（即它是一种 Pseudomonas 自杀型载体）。这些特性使得 pEX100T-NotI 非常适用于靶向 Pseudomonas 染色体上的基因缺失。质粒的克隆步骤在 E. coli 中进行，构建完成的质粒随后通过转化或接合方式转移至 Pseudomonas 中。接着，通过同源重组事件和筛选步骤，实现目标基因的框内无标记缺失。这种逐步从 P. aeruginosa 染色体上删除基因组区域的方法可用于构建高度减毒的 Pseudomonas 菌株（如 PGN5），也可用于设计具有特定用途的菌株（例如缺乏内切核酸酶以利于质粒扩增，或缺乏蛋白酶以利于目标蛋白生产的菌株）。
细菌菌株的总体毒力受其生长条件和生长阶段的影响，在这些条件下突变频繁发生。因此，评估基因工程菌株的安全性具有挑战性。为了评价细菌分离株的系统性毒力，我们改进了先前发表的通过腹腔注射C57BL/6小鼠进行感染的实验方案5。我们对该方法进行了修改，使用冷冻保存的细菌菌种进行注射，从而实现精确给药，并便于验证所用菌株。在本模型中，采用已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于生物制药生产的E. coli BL21菌株作为对照安全标准，以评估待测菌株的相对致病性6,7,8。该方法的主要优势在于其可重复性强，并能最大限度减少变异来源，因为在感染前后均对感染用菌株的细菌数量、表型及遗传标记进行了验证。通过这些受控步骤，可减少所需实验动物的数量。在该模型中，当经腹腔注射后，若P. aeruginosa菌株引起的C57BL/6小鼠死亡率等于或低于E. coli BL21菌株，则可认为该菌株毒力减弱。这一简单的小鼠感染模型也可用于评估其他物种基因工程菌株的减毒致病性，参照标准为FDA批准的E. coli菌株。步骤1-7详细描述了在P. aeruginosa中连续进行基因组缺失的操作（图1），步骤8-12则详细说明了利用小鼠模型检测P. aeruginosa菌株致病性的方法。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 平盖离心管</td><td>ThermoScientific</td><td>AB-0620</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>22-253-260</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>1.5 mL 一次性聚苯乙烯比色皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 冻存管</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>27G 针头</td><td>BD</td><td>14-821-13B</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>Accu block 数字干浴器</td><td>Labnet</td><td>NC0205808</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>台式离心机 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>04-987-372</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>台式微量离心机</td><td>Sorvall</td><td>75-003-287</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素二钠盐</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2648250</td><td></td></tr><tr><td>培养试管，聚苯乙烯材质</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-6D</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>一次性接种环</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy UltraClean 微生物试剂盒（50 次）</td><td>Qiagen</td><td>12224-50</td><td>或选用其他方法/供应商</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure 试剂盒（50 次）</td><td>Omega bio-tek</td><td>D6493-01</td><td>或选用其他方法/供应商</td></tr><tr><td>EcoRI-HF 限制性内切酶</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101L</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔比色皿</td><td>Bulldog Bio</td><td>NC0492929</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>FastLink II DNA 连接试剂盒</td><td>Epicentre Technologies</td><td>LK6201H</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 无色预混液</td><td>Promega</td><td>M7833</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>Isothesia 异氟烷</td><td>Henry Schein 动物健康</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina XRMS Series III 活体成像系统</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136340</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素单硫酸盐</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>LE 琼脂糖</td><td>Genemate</td><td>3120-500</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>LB 培养基（Luria Broth）</td><td>Difco</td><td>240230</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>MicroPulser 电穿孔仪</td><td>BioRad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>高纯度 Noble 琼脂</td><td>Affymetrix/USB</td><td>AAJ10907A1</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>NotI-HF 限制性内切酶</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Electrocomp &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>C404052</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液粉末</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/&quot; target=&quot;_blank">https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;假单胞菌&lt;/em&gt;分离琼脂</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;假单胞菌&lt;/em&gt;分离肉汤</td><td>Alpha Biosciences</td><td>P16-115</td><td>定制批次</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（250 次）</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>或选用其他方法/供应商</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4080</td><td>以 200 rpm 振荡</td></tr><tr><td>SimpliAmp 热循环仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Difco</td><td>DF0032-17-3</td><td>通过 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>小培养皿（100 O.D. × 10 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec Plus 分光光度计</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>或选用其他方法/供应商</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>圆形牙签</td><td>Diamond</td><td></td><td>任意品牌的牙签，经高压灭菌</td></tr><tr><td>TOPO TA 克隆试剂盒（用于测序）</td><td>Invitrogen</td><td>45-0030</td><td></td></tr><tr><td>XAF-8 麻醉系统滤芯</td><td>PerkinElmer</td><td>118999</td><td></td></tr><tr><td>XGI 8 气体麻醉系统</td><td>Caliper Life Sciences/Xenogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

框内基因缺失突变体的构建 铜绿假单胞菌 并在简单的感染小鼠模型中检测毒力减退

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

微生物具有丰富的遗传多样性和变异性，已成为许多商业产品和生物制药的重要来源。尽管其中一些产品可由生物体天然产生，但其他产品则需要对生物体进行基因工程改造以提高产量。减毒的Escherichia coli菌株传统上是生产生物制药的首选细菌种类；然而，某些产品难以由E. coli有效生产。因此，其他细菌种类的减毒菌株可能为某些商业产品的生产提供有用的替代方案。Pseudomonas aeruginosa是一种常见且研究充分的革兰氏阴性细菌，可作为E. coli的合适替代选择。然而，P. aeruginosa是一种机会性人类病原体。本文详细介绍了一种利用pEX100T-NotI质粒通过连续基因组缺失生成非致病性P. aeruginosa菌株的方法。该方法的主要优势在于可获得无标记基因的菌株。该方法可用于构建高度减毒的P. aeruginosa菌株，以用于商业产品的生产，或设计用于其他特定用途的菌株。我们还描述了一种简单且可重复的小鼠细菌系统性感染模型，通过腹腔注射经验证的测试菌株，以评估基因工程菌株的减毒效果，并与美国食品药品监督管理局（FDA）批准的E. coli BL21菌株进行比较。

如图2所示，可通过使用特异性引物进行菌落PCR来确认靶向基因组缺失，这些引物可扩增目标区域。携带基因组缺失的菌落与野生型菌落相比，会产生更短的PCR条带。通常对10–12个菌落进行PCR筛选，足以检测到至少一个携带靶向缺失的菌落。若经过多轮筛选仍未检测到缺失，应从接合步骤开始重复实验。若缺失仍无法实现，可能需要通过测序确认质粒插入片段，或重新设计插入片段，或该缺失可能是致死性的。通过PCR验证基因缺失后，需进一步通过测序确认缺失。所得菌株可重复进行该操作，以实现连续的基因组修饰。
如图所示 图3，减毒株腹腔注射相关的死亡率 P. aeruginosa PGN5（+mucE）为0%，相当于观察到的死亡率 E. coli BL21。另一方面，亲本菌株（VE2）经腹腔注射后导致80%的小鼠死亡。这些结果是...

在此，我们描述了一种简单且可重复的小鼠感染模型实验方案，用于评估基因修饰菌株的减毒特性 铜绿假单胞菌 与美国食品药品监督管理局（FDA）批准的 大肠杆菌 用于商业用途。

微生物在遗传上具有高度的适应性和多样性，已成为许多商业产品和生物制药的重要来源。尽管一些……

该方案对于在铜绿假单胞菌基因组中创建和确定身心相关的目标突变，以及在可重复的小鼠模型中检测突变对毒力减弱的影响具有重要意义。该技术的主要优势在于染色体验证以及小鼠感染模型的可重复性。细菌持续处于活跃状态，不断发生改变。为了减缓这一过程，我们使用冷冻停点，将其装袋，并在对它们进行小鼠模型测试之前，悬挂在多个梯级上进行修饰。对于不熟悉这些方法的人员而言，在可能的交叉重组体的开发与筛选方面很可能会遇到困难。此外，对于不熟悉动物实验操作的人员来说，小鼠感染过程中的操作也将具有挑战性。该方法可应用于其他病原体及其突变株的检测，以及在小鼠中进行毒力感染实验。与现有模型相比，本方法在感染前后均包含可重复的操作步骤及克隆验证，可为本领域的其他研究者提供参考。本实验方案的可视化演示有助于理解一系列复杂的操作流程，而这些步骤仅通过阅读文字可能难以完全掌握。首先在假单胞菌分离肉汤（Pseudomonas Isolation Broth，PIB）中培养单交换重组菌落。取每种培养物10 µL接种并划线接种于预热的PIA平板上，平板中添加10%蔗糖。然后在37°C条件下过夜培养平板。第二天，从培养箱中取出平板，检查菌落生长情况。蔗糖抗性菌落应为双交换重组子。使用无菌牙签将至少20个菌落转接到预热的PIA平板、含10%蔗糖的PIA平板以及含羧苄青霉素的PIA平板上。将平板孵育过夜，次日观察菌落生长情况。真正的双交换重组子将对羧苄青霉素敏感且对蔗糖具有抗性。使用菌落PCR筛选10至20个菌落以检测缺失。用无菌牙签挑取疑似双交换重组子的菌落，悬浮于50微升PBS中。在100摄氏度下煮沸10分钟。在13,000 ×g下离心3分钟，并置于冰上。然后，根据手稿说明进行 PCR。PCR 完成后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳。较小的扩增产物表明目标区域已被删除的菌落。在注射当天早晨，将装有细菌细胞的冻存管置于4摄氏度条件下解冻3至4小时。解冻后立即将冻存管置于冰上，并在两小时内完成小鼠注射。将每支冻存管中的内容物转移至新的2毫升离心管中，在4,500 × g条件下离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。再次进行离心，将细胞重悬于PBS中，最终浓度为每毫升2.5 × 10⁹个菌落形成单位。从每种菌株的最终悬液中取三个样品，以验证浓度、基因型和表型。针对每种菌株，将1.5毫升细胞悬液分装至2毫升离心管中，并准备用于对照注射的PBS。在无菌动物手术室中准备好注射所需的小鼠及相关材料，操作开始前用消毒湿巾擦拭所有表面。佩戴两副乳胶手套以降低被咬伤后刺穿的风险，同时穿戴实验服、护目镜和口罩。将小鼠从笼中取出并称重，用永久性记号笔在尾巴上做标记，以便注射后追踪。打开一支新的1毫升注射器，安装27号针头，吸取200 µL无菌PBS。用拇指和食指抓住小鼠耳后部，轻轻捏压，在颈部背侧形成皮肤皱褶。然后，用小指将小鼠尾部固定在掌心，使小鼠保持平直且不动。将针头以30度角插入腹腔，位置在腹中线左侧或右侧。稍微抬起针头，以确保未刺入器官。然后，缓慢注入 PBS 并拔出针头。注射部位出现药液团块是正常现象。将针头放入指定的锐器处置容器中，并将小鼠转移至另一个笼子。对下一只小鼠重复上述操作，待同一笼中的所有小鼠注射完毕后，将其放回原来的笼子。完成对照组注射后，使用相同操作对实验组小鼠进行注射。所有注射完成后，将小鼠送回饲养室，并使用消毒湿巾清洁工作区域。为了对动物进行成像，需先准备成像系统，设置相机参数并加热载物台。将氧气流速设为1.5升/分钟，异氟烷浓度设为3.5%，将小鼠移入麻醉室，待麻醉后转移至温度稳定的载物台上。将小鼠仰卧放置，四肢伸展，并在成像过程中通过鼻罩给予2.5%异氟烷以维持麻醉状态。关闭门并采集小鼠的生物发光图像和X光片。成像完成后，将小鼠放回笼中并进行监测。小鼠应在三到五分钟内恢复意识。通过使用特异性引物进行菌落PCR，确认了靶向基因组缺失，这些引物可扩增目标区域。与野生型菌落相比，具有基因组缺失的菌落产生较短的PCR条带。腹腔注射减毒铜绿假单胞菌PGN5菌株后，死亡率为0%，与大肠杆菌BL21观察到的死亡率相当。然而，亲本菌株的注射导致80%的小鼠死亡。使用带有生物发光标记的亲本菌株和减毒菌株来追踪感染进展。减毒菌株始终局限于注射部位，直至生物发光信号消失，这可能与感染被清除的时间相一致。本方法仅研究了该菌株引起的死亡率。可进一步利用更深入的免疫学和毒理学方法，以确定感染的动态过程以及感染导致的非致死性终末效应。该实验流程中最重要的环节是对从初始鉴定到动物实验各个步骤所进行的广泛验证。遗漏某些验证步骤可能导致错误结果，因为所测试的菌株可能发生突变和选择，或受到污染。随着这两种技术的发展，我们认为这将使我们在感染免疫学领域的研究人员能够更有效地研究强大的包装相互作用如何导致极端表型——脓毒症和死亡率。通过细菌的剂量大小，可以比较不同营养物质对变异体的影响。

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Immunology and Infection

免疫学与感染

在伪单体中生成帧内基因删除突变体，并在简单小鼠感染模型中测试病毒衰减

来源： Valentine, M. E., 等 框内基因缺失突变体的构建 铜绿假单胞菌 并在简单的小鼠感染模型中检测毒力减弱情况。 J. Vis. Exp.

利用生物发光技术追踪小鼠体内细菌感染动态

来源：Valentine, M. E., 等。在Pseudomonas aeruginosa中构建框内基因缺失突变体并利用简单小鼠感染模型检测毒力减弱。可视实验杂志（2020）。本视频演示了利用基于质粒的基因缺失策略在Pseudomonas...

生成用于靶向基因敲除的Pseudomonas aeruginosa双交换重组子

来源： Valentine, M. E. 等人，框内基因缺失突变体的构建 铜绿假单胞菌 并在简单的感染小鼠模型中检测毒力减弱情况。 J. Vis. Exp.

利用生物发光技术在小鼠模型中对细菌感染进行实时成像

利用生物发光细菌实时观察肺炎链球菌毒力因子在急性小鼠肺炎模型中的影响

在此，我们介绍一种使用微型装置的实验方案himar1 mariner转座子介导的诱变用于构建高密度插入突变体文库，以筛选、分离和鉴定模式菌株中新的海藻酸盐调控因子 铜绿假单胞菌...

鉴定与海藻酸盐产生相关的新基因 铜绿假单胞菌 使用微型装置himar1 Mariner 转座子介导的诱变

本文中，我们介绍线虫Caenorhabditis...

秀丽隐杆线虫——一种多功能的模式生物 体内 研究宿主-微生物相互作用的模型

本文介绍了三种不同的实验方法，用于研究Aeromonas对C.

评估毒力与致病机制 气单胞菌属 感染在A中 秀丽隐杆线虫 模型

本文介绍了一种利用带有loxP位点的盒式基因交换突变技术（FLAEM）在Chlamydia...

无标记基因缺失通过Chlamydia trachomatis中带loxP盒的等位交换诱变实现

采用λ-Red介导的重组系统构建了一个小非编码RNA...

一种非编码小RNA MicC在膜外蛋白的毒力中发挥作用 沙门氏菌 Enteritidis

本文描述了构建Aeromonas中特定糖基转移酶或含糖基转移酶区域的空突变株，以及为确定其编码酶在糖链生物合成中的作用和功能、并阐明该糖链在细菌致病性中的作用而开展的运动性测定和鞭毛纯化实验。...

构建无功能突变体以阐明细菌糖基转移酶在细菌运动性中的作用

了解在铜绿假单胞菌中创建基因缺失突变体的方法，并使用可重复的小鼠感染模型测试毒力减弱效果。该方案为微生物学和感染性疾病研究提供了可靠的实验基础。

框内基因缺失突变体的构建铜绿假单胞菌并在简单的感染小鼠模型中检测毒力减退

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框内基因缺失突变体的构建 铜绿假单胞菌 并在简单的感染小鼠模型中检测毒力减退

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框内基因缺失突变体的构建铜绿假单胞菌并在简单的感染小鼠模型中检测毒力减退