框内基因缺失突变体的构建 铜绿假单胞菌 并在简单的感染小鼠模型中检测毒力减退

该方案对于在铜绿假单胞菌基因组中创建和确定身心相关的目标突变，以及在可重复的小鼠模型中检测突变对毒力减弱的影响具有重要意义。该技术的主要优势在于染色体验证以及小鼠感染模型的可重复性。细菌持续处于活跃状态，不断发生改变。

为了减缓这一过程，我们使用冷冻停点，将其装袋，并在对它们进行小鼠模型测试之前，悬挂在多个梯级上进行修饰。对于不熟悉这些方法的人员而言，在可能的交叉重组体的开发与筛选方面很可能会遇到困难。此外，对于不熟悉动物实验操作的人员来说，小鼠感染过程中的操作也将具有挑战性。

该方法可应用于其他病原体及其突变株的检测，以及在小鼠中进行毒力感染实验。与现有模型相比，本方法在感染前后均包含可重复的操作步骤及克隆验证，可为本领域的其他研究者提供参考。本实验方案的可视化演示有助于理解一系列复杂的操作流程，而这些步骤仅通过阅读文字可能难以完全掌握。

首先在假单胞菌分离肉汤（Pseudomonas Isolation Broth，PIB）中培养单交换重组菌落。取每种培养物10 µL接种并划线接种于预热的PIA平板上，平板中添加10%蔗糖。然后在37°C条件下过夜培养平板。

第二天，从培养箱中取出平板，检查菌落生长情况。蔗糖抗性菌落应为双交换重组子。使用无菌牙签将至少20个菌落转接到预热的PIA平板、含10%蔗糖的PIA平板以及含羧苄青霉素的PIA平板上。

将平板孵育过夜，次日观察菌落生长情况。真正的双交换重组子将对羧苄青霉素敏感且对蔗糖具有抗性。使用菌落PCR筛选10至20个菌落以检测缺失。

用无菌牙签挑取疑似双交换重组子的菌落，悬浮于50微升PBS中。在100摄氏度下煮沸10分钟。在13,000 ×g下离心3分钟，并置于冰上。

然后，根据手稿说明进行 PCR。PCR 完成后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳。较小的扩增产物表明目标区域已被删除的菌落。

在注射当天早晨，将装有细菌细胞的冻存管置于4摄氏度条件下解冻3至4小时。解冻后立即将冻存管置于冰上，并在两小时内完成小鼠注射。将每支冻存管中的内容物转移至新的2毫升离心管中，在4,500 × g条件下离心10分钟。

弃去上清液，将细胞沉淀重悬于一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。再次进行离心，将细胞重悬于PBS中，最终浓度为每毫升2.5 × 10⁹个菌落形成单位。从每种菌株的最终悬液中取三个样品，以验证浓度、基因型和表型。

针对每种菌株，将1.5毫升细胞悬液分装至2毫升离心管中，并准备用于对照注射的PBS。在无菌动物手术室中准备好注射所需的小鼠及相关材料，操作开始前用消毒湿巾擦拭所有表面。佩戴两副乳胶手套以降低被咬伤后刺穿的风险，同时穿戴实验服、护目镜和口罩。

将小鼠从笼中取出并称重，用永久性记号笔在尾巴上做标记，以便注射后追踪。打开一支新的1毫升注射器，安装27号针头，吸取200 µL无菌PBS。用拇指和食指抓住小鼠耳后部，轻轻捏压，在颈部背侧形成皮肤皱褶。

然后，用小指将小鼠尾部固定在掌心，使小鼠保持平直且不动。将针头以30度角插入腹腔，位置在腹中线左侧或右侧。稍微抬起针头，以确保未刺入器官。

然后，缓慢注入 PBS 并拔出针头。注射部位出现药液团块是正常现象。将针头放入指定的锐器处置容器中，并将小鼠转移至另一个笼子。

对下一只小鼠重复上述操作，待同一笼中的所有小鼠注射完毕后，将其放回原来的笼子。完成对照组注射后，使用相同操作对实验组小鼠进行注射。所有注射完成后，将小鼠送回饲养室，并使用消毒湿巾清洁工作区域。

为了对动物进行成像，需先准备成像系统，设置相机参数并加热载物台。将氧气流速设为1.5升/分钟，异氟烷浓度设为3.5%，将小鼠移入麻醉室，待麻醉后转移至温度稳定的载物台上。将小鼠仰卧放置，四肢伸展，并在成像过程中通过鼻罩给予2.5%异氟烷以维持麻醉状态。

关闭门并采集小鼠的生物发光图像和X光片。成像完成后，将小鼠放回笼中并进行监测。小鼠应在三到五分钟内恢复意识。

通过使用特异性引物进行菌落PCR，确认了靶向基因组缺失，这些引物可扩增目标区域。与野生型菌落相比，具有基因组缺失的菌落产生较短的PCR条带。腹腔注射减毒铜绿假单胞菌PGN5菌株后，死亡率为0%，与大肠杆菌BL21观察到的死亡率相当。

然而，亲本菌株的注射导致80%的小鼠死亡。使用带有生物发光标记的亲本菌株和减毒菌株来追踪感染进展。减毒菌株始终局限于注射部位，直至生物发光信号消失，这可能与感染被清除的时间相一致。

本方法仅研究了该菌株引起的死亡率。可进一步利用更深入的免疫学和毒理学方法，以确定感染的动态过程以及感染导致的非致死性终末效应。该实验流程中最重要的环节是对从初始鉴定到动物实验各个步骤所进行的广泛验证。

遗漏某些验证步骤可能导致错误结果，因为所测试的菌株可能发生突变和选择，或受到污染。随着这两种技术的发展，我们认为这将使我们在感染免疫学领域的研究人员能够更有效地研究强大的包装相互作用如何导致极端表型——脓毒症和死亡率。通过细菌的剂量大小，可以比较不同营养物质对变异体的影响。