Name: 番茄根转化后与拉子托尼亚索拉纳卡鲁姆接种，直接遗传分析细菌性威尔特病 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 了解番茄根系转化与Ralstonia solanacearum接种技术，用于细菌性枯萎病的直接遗传分析。该方法操作简便、设备需求少，可快速进行基因表达调控和抗病性研究，为植物病理学基础研究提供重要工具。

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感谢Macho实验室所有成员在本研究期间提供的有益讨论，感谢Alvaro López-García提供的统计学建议，以及感谢Xinyu Jian在技术与行政方面给予的支持。感谢中国科学院植物逆境生物学研究中心细胞生物学核心设施在荧光成像方面提供的协助。本工作得到了中国科学院战略性先导科技专项（项目编号XDB27040204）、中国科学院上海植物逆境生物学研究中心以及中国千人计划项目的资助。

注意：该方法的关键步骤涉及植物材料的体外操作，因此在整个操作过程中（包括 DsRed 荧光的观察）必须保持无菌条件。在转化过程的整个期间，番茄幼苗在 25−28 °C 及 16 小时光照/8 小时黑暗（光照强度为 130 µmol 光子 m-2s-1）条件下生长。培养皿使用 micropore 胶带密封，以利于气体交换和蒸腾作用。
1. 番茄植株和Agrobacterium rhizogenes的准备
<ol>
	<li>用5%（v/v）次氯酸钠对番茄种子（Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Tomato Genetics Resource Center, TGRC）进行表面灭菌5分钟。用无菌蒸馏水清洗4–5次，并将种子在无菌水中缓慢振荡过夜，以促进萌发。</li>
	<li>将番茄种子转移至不含蔗糖的1/2强度Murashige和Skoog（1/2 MS）培养基（2.21 g/L MS，8% w/v 琼脂）中。在25−28 °C黑暗条件下培养三天（图1A）。 
	注意：每个构建体通常需要约40粒种子。</li>
	<li>将8.5 cm2的方形滤纸进行高压灭菌。将滤纸放入含有1/2 MS培养基的9 cm2方形培养皿中（将滤纸置于琼脂表面），每皿放置6粒已萌发的番茄种子（图1B）。用微孔胶带密封培养皿，并在25−28 °C下培养萌发的种子3−4天。</li>
	<li>在植物转化前两天，于28 °C在固体LB培养基（含适当抗生素）中培养Agrobacterium rhizogenes MSU440。 
	注意：A. rhizogenes由西班牙格拉纳达EEZ-CSIC的Juan Antonio López Ráez博士提供。本研究所用的A. rhizogenes菌株携带pK7GWIWG2_II-RedRoot::CESA6或空载体作为对照。pK7GWIWG2_II-RedRoot含有一个由Arabidopsis thaliana泛素启动子（pAtUBQ10）驱动的报告基因DsRed，并赋予壮观霉素抗性（50 µg/mL）。也可使用其他载体进行基因过表达，如先前报道5。本研究中，通过逆转录（RT）PCR从番茄（S. lycopersicum cv. Moneymaker）RNA中扩增出SlCESA6沉默的特异性片段，并连接至p-ENTR/D-TOPO载体（表1）。随后，将SlCESA6-RNAi片段克隆至pK7GWIWG2_II-RedRoot双元载体中。</li>
</ol>
2. 植物转化与筛选
<ol>
	<li>使用无菌手术刀切去番茄幼苗的胚根和下胚轴底部（图1C,D）。</li>
	<li>用塑料枪头或手术刀片从LB培养基表面收集A. rhizogenes菌体，并将切口处的番茄幼苗小心浸入菌体中（图1E）。</li>
	<li>接种A. rhizogenes后，用一张2 cm × 4 cm的半圆形滤纸覆盖番茄幼苗（图1F），以保持高湿度，促进幼苗存活及新根发育。</li>
	<li>将转化后的番茄幼苗培养6–7天。随后使用无菌手术刀切除新长出的毛状根（图1G,H；此阶段的根尚未完成转化），并让幼苗继续产生新的毛状根。</li>
	<li>当第二代新毛状根出现时（图1I），移除覆盖在幼苗上方的滤纸，并再次用微孔胶带密封培养皿。 
	注意：此时转化载体中的DsRed荧光标记可用于观察新根中的转化效率。</li>
	<li>为观察DsRed荧光，可使用体视显微镜或其他植物活体成像设备（图1J）。标记呈阳性（显示红色荧光）的转化根，并使用无菌手术刀切除无红色荧光的阴性非转化根。</li>
	<li>将显示红色荧光的幼苗转移至含有1/2 MS培养基的新培养皿中，以促进转化根发育为主根（图1K）。将未显示红色荧光的幼苗保留在原培养皿中，以便在后续时间点观察是否有荧光根出现（图1L）。</li>
	<li>基于抗生素筛选的替代方法
	<ol>
		<li>作为步骤2.5的替代方法，准备盛有含适当抗生素的1/2 MS培养基的半满9 cm2方形培养皿。在制备过程中将培养皿倾斜约5°，以形成无培养基的空白区域（图2A），使幼苗地上部分生长时避免接触抗生素。</li>
		<li>作为步骤2.6的替代方法，在切除第一轮长出的非转化毛状根（步骤2.4）后，将无根幼苗通过适当尺寸的滤纸转移至半满培养皿中（图2B）。 
		注意：建议使用携带相同抗生素抗性基因和报告基因的质粒（本实验方案中为pK7GWIWG2_II-RedRoot；卡那霉素50 µg/mL）转化若干幼苗作为阳性对照。</li>
		<li>作为步骤2.7的替代方法，让幼苗发育出新的毛状根，并切除那些未直接接触滤纸夹层表面的根，因为这些根可能逃避抗生素筛选。 
		注意：由于抗生素的作用，根的发育可能比无抗生素培养皿中更缓慢。在将无根幼苗转移至半满培养皿（步骤2.8.2）后14–18天内，可观察到新的转化毛状根（图2C-E）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用一张2 cm × 4 cm的半圆形滤纸覆盖幼苗，密封培养皿，并将幼苗置于培养条件下使其发育出新的毛状根。 
	注意：无需使用抗生素清除A. rhizogenes。覆盖在MS培养基上的滤纸以及培养基中缺乏蔗糖可抑制A. rhizogenes在培养皿中的扩散5。</li>
	<li>首次根筛选后5至7天，重复筛选过程，选择新出现的转化根并去除非转化根。将含有转化根的幼苗转移至含有1/2 MS培养基的新培养皿中。</li>
</ol>
3. 转移至接种盆
<ol>
	<li>准备用于接种的育苗钵，使根部表面能够暴露于细菌接种液中：用清水浸泡接种育苗钵，倒去多余的水分，并将其放入塑料种植托盘中。使用镊子将已转化根系的筛选幼苗转移至接种育苗钵中（图3A）。</li>
	<li>用保鲜膜或透明盖子覆盖托盘，并置于25−28 °C、65%湿度条件下培养（光照周期为16小时光照/8小时黑暗，光照强度为130 µmol photons m-2s-1），以维持高湿度环境（图3B）。五到六天后移除覆盖物。 
	注意：转化后的番茄植株在移栽至土壤后两到三周即可进行接种（图3C）。在土壤生长期间，番茄植株可能产生未转化的新根。为评估该现象的程度，对三周龄转化番茄植株根部的红色荧光进行了观察。大多数根系（80%–100%）显示出红色荧光，表明其确实已成功转化（图3D,E）。</li>
</ol>
4. 土壤灌注接种
<ol>
	<li>在轨道摇床（200 rpm）中，于28 °C条件下，在phi液体培养基（表211）中培养R. solancearum（本方案中使用菌株GMI1000），直至进入稳定生长期。</li>
	<li>通过测定菌液在600 nm处的光密度（OD600）来确定细菌数量。用蒸馏水将菌液稀释至OD600为0.1（在此实验条件下，相当于约108菌落形成单位[CFU]/mL）。</li>
	<li>将16−20个含有转基因番茄植株的接种盆放置于一个接种托盘（29 cm × 20 cm；图4A）中。</li>
	<li>向装有接种盆的托盘中加入300 mL（每株约15 mL）细菌接种液（OD600为0.1），使植株浸泡在接种液中20分钟（图4B）。</li>
	<li>准备一个新的托盘，并铺上一层栽培土。将已接种的盆移入新托盘中（图4C），然后将托盘置于生长室中，保持75%湿度、26−28 °C温度，以及12小时光照/12小时黑暗的光周期（光照强度为130 µmol photons m-2s-1）。</li>
</ol>
5. 感染参数的测定与统计分析
<ol>
	<li>在接种雷尔氏菌（Ralstonia）后的两周内，每天按照先前所述方法12,13，采用0（无症状）至4（完全萎蔫）的评分标准对病害症状进行评分（图4D-H）。 
	注意：病害指数数据是在一段时间内从同一实验单位（每株植物）收集的。</li>
</ol>
6. 基因表达分析
注意：转基因的表达或靶基因的沉默可通过RT-PCR或定量RT-PCR（qRT-PCR）进行检测。
<ol>
	<li>采集样品，并从转化根系的代表性部位（用于评估目标基因的效应）以及叶片（作为内参对照）中提取RNA。</li>
	<li>使用1 µg经DNase处理的总RNA合成cDNA。</li>
	<li>通过qRT-PCR分析目标基因的表达水平，采用2-ΔΔCT法14计算相对转录水平，以SlEFα-1作为看家基因15。 
	注意：引物序列见表1。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Ralstonia solanacearum 对农业生产构成重要威胁；然而，与其他细菌性病原体相比，其与重要农作物自然宿主之间的相互作用仍知之甚少，尤其是在作物植物种类中。大多数情况下，对宿主植物进行遗传改造所需的时间和成本限制了遗传学分析的开展。为解决这一问题并促进对R. solanacearum在番茄中侵染过程的遗传分析，我们开发了一种简便的方法，该方法基于Agrobacterium rhizogenes介导的番茄根部转化（图1），随后采用灌根接种方式（图3）。转化后的根系通过荧光报告基因（本方案中为DsRed）进行筛选（图1）。此外，我们还开发了一种基于抗生素筛选的替代方法，该方法不会损伤未转化的地上部分（图2）。
转化实验方案基于Ho-Plágaro等人<sup class="xref...

Ralstonia solanacearum 是引起青枯病的病原菌，是一种具有全球分布的毁灭性土传维管束病原菌，可侵染多种植物物种，包括马铃薯、番茄、烟草、香蕉、辣椒和茄子等1,2。由 Ralstonia 引起的产量损失在番茄、马铃薯或香蕉中可高达总产量的80-90%，具体程度取决于品种、气候、土壤及其他因素3。然而，与涉及其他细菌性植物病原菌（如 Pseudomonas syringae 或 Xanthomonas spp）的研究模型相比，Ralstonia 模型的研究仍相对不足。此外，目前大多数植物-微生物互作研究集中于模式植物 Arabidopsis thaliana。尽管这些模型的研究极大地促进了我们对植物-细菌互作机制的理解，但它们未能满足当前迫切需要了解作物中此类互作的需求。针对 Ralstonia 与作物植物之间互作机制的研究对于开发可持续防控青枯病的策略至关重要，但目前受限于缺乏简便直接的实验方法来表征互作过程中的各个组分。特别是番茄，作为 Ralstonia 的天然寄主，是全球第二重要的蔬菜作物，易受多种病害影响4，其中包括青枯病。在本研究中，我们建立了一种简便的方法，用于对 Ralstonia 侵染番茄的过程进行遗传分析。该方法基于利用 DsRed 荧光作为筛选标记，通过 Agrobacterium rhizogenes 介导的番茄根部转化5，随后对含有表达目标构建物的转化根的植株进行 Ralstonia 土壤浇灌接种。该根部转化实验具有良好的灵活性，可用于基因过表达或RNAi介导的基因沉默研究。
该方法的一个潜在局限性在于非转化根可能存在残余生长。当所使用的质粒缺乏可用于筛选转化根的报告基因时，这一问题尤为突出。为解决此问题，我们开发了一种基于抗生素筛选的替代方法，该方法可抑制非转化根的生长，同时允许健康且具有抗生素抗性的转化根正常生长。由于A. rhizogenes不会诱导地上部分（茎叶）的转化，因此这些未转化的植株对抗生素敏感，必须使其与含抗生素的培养基保持分离。
尽管植物对Ralstonia的抗性机制尚未完全阐明，但已有若干研究报道细胞壁的改变与对青枯病抗性的增强相关6,7,8,9。有研究提出，这些细胞壁的改变可能影响维管组织的发育，而维管系统对Ralstonia在植物体内的生存至关重要10。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，编码纤维素合酶的基因CESA4、CESA7和CESA8发生突变已被证明会破坏次生细胞壁的完整性，从而增强对Ralstonia的抗性，且该抗性似乎与ABA信号通路相关8。因此，为验证本方法的可行性，我们对SlCESA6（Solyc02g072240）基因进行了RNAi介导的基因沉默，该基因为次生细胞壁纤维素合酶基因，是AtCESA8（At4g18780）的同源基因。随后通过土壤浇灌法接种Ralstonia，结果显示沉默SlCESA6可增强植株对青枯病症状的抗性，表明细胞壁介导的抗Ralstonia机制在番茄中可能具有保守性，同时也验证了本方法可用于番茄根部青枯病抗性的遗传学分析。本文将详细描述该方法，使其能够在较短时间内，以较少的仪器设备和植物生长空间，开展针对青枯病的遗传学研究。

<table><tbody><tr><td>90 mm 方形培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂粉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto蛋白胨</td><td>BD（贝克顿和迪金森）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酪蛋白氨基酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>活体植物成像系统 NightShade LB 985</td><td>贝托德科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>速生花盆</td><td>Jiffy Products International A.S.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微孔胶带</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige和Skoog培养基（M519）</td><td>Phytotechlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pindstrup 培养基</td><td>Pindstrup Mosebrug A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀和刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌洁净工作台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>沃特曼滤纸</td><td>Wahtman International Ltd. Maldstone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>OXOID</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

番茄根部转化后接种ralstonia solanacearum以实现青枯病的简便遗传分析

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Ralstonia solanacearum 是一种破坏性极强的土传维管束病原体，可侵染多种植物物种，对农业生产构成重大威胁。然而， Ralstonia 与其他涉及植物病原细菌的模型相比，该模型的研究仍明显不足，例如 Pseudomonas syringae 在 拟南芥. 旨在研究相互作用的 Ralstonia 以及作物植物对于开发可持续防控青枯病的解决方案至关重要，但目前由于缺乏直接有效的实验方法来表征天然寄主植物中互作的各个组分，相关研究受到阻碍。在此背景下，我们建立了一种用于开展遗传学分析的方法 Ralstonia 番茄（一种天然寄主）的感染 Ralstonia. 该方法基于 根癌农杆菌介导的番茄根部转化，随后进行 Ralstonia 对获得的植株进行灌根接种，使其含有表达目标载体的转化根。根部转化检测方法具有较高的灵活性，可用于基因过表达或RNAi介导的基因沉默。作为概念验证，我们采用该方法证明了RNAi介导的基因沉默 SlCESA6 在番茄根部赋予抗性 Ralstonia在此，我们详细描述了该方法，使其能够在较短时间内，以较少的设备和植物生长空间需求，通过遗传学手段深入理解细菌性萎蔫病。

图5展示了根部转化了空载体（EV）的番茄植株以及根部转化了靶向SlCESA6（Solyc02g072240）的RNAi构建体的番茄植株在病害症状上的发展情况。疾病指数数据（图5A）是根据0到4的任意评分标准，对同一实验单位（每株植物）随时间连续采集的，且不符合正态分布，因此不能采用针对参数数据的标准统计检验方法。此外，由于定植和感染过程的动力学特性，此类实验中植株间存在固有的个体差异。下文将探讨与Ralstonia感染相关的症状表现及统计分析的不同方法。
作为标准方法，采用Mann-Whitney双尾非参数检验来比较对照组（EV）和SlCESA6-RNAi的感染曲线。根据该分析，两条曲线中位数之间的差异似乎无统计学意义（P...

本文介绍了一种通用的番茄根部转化方法，随后接种青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum），以开展对细菌性萎蔫病的简单遗传学分析。

番茄根部转化后接种Ralstonia solanacearum以实现青枯病的简便遗传分析

茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）是一种破坏性极强的土传维管束病原菌，可侵染多种植物物种，对……构成严重威胁。

该方案具有重要意义，因为它使科学家能够对番茄青枯病进行简便的遗传分析。该技术的主要优势在于，基因表达的调控及后续检测可在较短时间内完成，且对仪器设备和植物生长空间的要求较低。该方法具有很强的通用性，可应用于其他农作物，以开展病原菌接种及其他生理学检测。为了在体外操作幼苗时保持无菌状态，当培养皿离开超净工作台时，应始终保持其处于封闭状态。该技术操作简便，但涉及多个操作步骤。通过本方法的可视化展示，有助于观察那些在文字稿件中难以描述的小技巧，从而帮助其他研究人员在其实验室中成功应用该方法。协助演示该实验步骤的是研究生Achen Zhao。将番茄种子灭菌并清洗后，转移至不含蔗糖的1/2浓度Murashige和Skoog培养基中。将种子置于25至28摄氏度的黑暗环境中培养三天。将已灭菌的8.5平方厘米滤膜置于含有半倍浓度Murashige和Skoog培养基的9平方厘米培养皿中，每皿放置6粒已萌发的番茄种子。用Micropore胶带密封培养皿，并在25至28°C下培养萌发的种子3至4天。在植物转化前，将根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）MSU440菌株在含适当抗生素的固体LB培养基中于28°C培养两天。使用无菌手术刀切下番茄幼苗的胚根和下胚轴底部。用塑料枪头或手术刀片从LB培养基表面收集根癌农杆菌（A. rhizogenes）的菌体生物质，并将切好的番茄幼苗小心浸入该细菌生物质中。随后，用一张2厘米×4厘米的半圆形滤纸覆盖在番茄幼苗上，以保持高湿度，促进幼苗存活及新根的发育。保持幼苗处于高湿度环境，并确保环境允许蒸腾作用，这一点非常重要。为此，用滤纸覆盖幼苗，并用Micropore胶带封好培养皿。将转化后的番茄幼苗在25至28摄氏度的培养室中培养6至7天。然后使用无菌解剖刀切割新长出的毛状根，并让幼苗继续产生新的毛状根。当第二代新毛状根出现后，移除覆盖在幼苗上方的滤纸，再次用Micropore胶带密封培养皿。为了观察DsRed荧光或进行植物活体成像，可利用红色荧光标记并识别已成功转化的阳性根系。使用解剖刀去除未转化的阴性根，这些根可通过缺乏红色荧光来识别。将显示红色荧光的幼苗转移至含有半倍浓度Murashige和Skoog培养基的新培养板中，以促进转化根发育为主根。将未显示红色荧光的幼苗保留在原培养板中，以便在后续时间点观察荧光根的出现情况。用一个 2 厘米 × 4 厘米的半圆形滤纸覆盖幼苗，密封培养皿，并将幼苗置于培养条件下，使其发育出新的毛状根。准备接种用的育苗盆，使根部表面能够接触到细菌接种物：首先将育苗盆用清水浸泡，倒去多余的水分，然后将其放入塑料种植托盘中。使用镊子将带有转化根系的选定幼苗转移至接种育苗盆中。用保鲜膜或透明盖子盖住托盘，并在25至28摄氏度、65%湿度条件下培养。5至6天后去除盖子。将拉尔斯特氏菌（Ralstonia）接种于5 mL LB液体培养基中，在28摄氏度下于摇床中以200 rpm振荡培养，直至进入稳定期。在600纳米处测定光密度以确定细菌数量。用水将细菌培养物稀释至OD600为1。将16至20个含有转化番茄植株的接种杯放入接种盘中。然后将300毫升稀释的细菌接种液倒入托盘中，使植物在接种液中浸泡20分钟。之后，准备一个新的托盘，铺上一层盆栽土。将接种后的花盆转移至新托盘中，并将托盘置于培养室中，培养条件为75%的湿度、26至28摄氏度的温度，以及12小时光照和12小时黑暗的光周期。在此实验中，通过将番茄根部进行遗传转化并接种雷尔氏菌（Ralstonia），以开展对细菌性枯萎病的简单遗传分析。实验追踪了根部转化空载体的番茄植株与转化了靶向番茄CESA6基因的RAI构建体植株的病害症状发展情况。疾病指数数据基于0到4的任意分级标准，随时间从相同的实验单位中收集，且不符合正态分布，因此无法采用针对参数数据的标准统计检验方法。作为标准方法，采用Mann-Whitney U检验（双尾、非参数检验）来比较对照组和感染组的曲线。根据该分析，两条曲线中位数之间的差异似乎无统计学意义。此外，还可量化疾病进展曲线下面积，从而将疾病进展的多个观察值整合为单一数值。在感染过程结束时，对照植株的病害发展曲线下面积值高于番茄CESA6 RNAi植株，表明与对照植株相比，CESA6基因沉默的番茄植株对劳尔氏菌（Ralstonia）感染具有更强的抗性。置信区间提供了一种以高概率估计某一变量总体值所在范围的方法。如图所示，对照组与感染曲线的95%置信区间面积表明，当CESA6基因沉默时，植株具有更高概率的抗性。可将病害指数值转换为二进制数据，其中病害指数低于2的记为0，病害指数大于或等于2的记为1。这使得能够在拉尔斯特菌接种后绘制生存曲线。根据Gehan-Breslow-Wilcoxon统计检验，对照组与感染植株之间的存活率差异无统计学意义。在接种步骤之前，对两个随机选择的转化根系进行CESA6表达分析，结果显示对雷尔氏菌（Ralstonia）的增强抗性与CESA6表达水平降低相关。经过两轮筛选后，可获得35%至40%的转化率，通过增加额外的筛选轮次，该数值还可进一步提高。在操作过程中，需用滤纸覆盖幼苗以保持高湿度，并使用Micropore胶带密封培养皿以确保气体交换。根部转化后，可通过观察根系生理学或结合分子生物学、细胞生物学及生物化学方法，对多种处理条件下的植物响应进行研究。该技术主要使资源有限的研究人员能够对番茄根部的细菌侵染进行遗传学分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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来源： Hassan, J. A., 等 高通量鉴定抗性 Pseudomonas syringae pv. tomato 利用幼苗淹水法在番茄中进行检测。 J. Vis. Exp.

用于筛选番茄细菌抗性的幼苗淹水试验

来源： Matthysse, A. G. 实验室条件下测定细菌对植物表面的黏附性。J. Vis.

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一种用于高通量原生质体分离与转化的机器人平台

了解番茄根系转化与Ralstonia solanacearum接种技术，用于细菌性枯萎病的直接遗传分析。该方法操作简便、设备需求少，可快速进行基因表达调控和抗病性研究，为植物病理学基础研究提供重要工具。

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