Name: 纤维细胞衍生的三维矩阵系统适用于内皮管形成测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 了解成纤维细胞来源的三维基质制备方法，用于内皮细胞管形成测定。该方法通过抗坏血酸刺激和脱细胞处理构建仿生支架，为血管生成研究提供可靠的体外模型。

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本方案的开发得到了卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）项目PI12/02037、PI15/02101、PI17/01847、PI18/01034和RD12/0036/0041的资助；欧洲区域发展基金（Fondo Europeo de Desarrollo Regional, FEDER）的资助；以及 &#34;癌症生物医学研究中心&#34;，CB16/12/00273 和 CB16/12/00446，来自卡洛斯三世健康研究所-FEDER；以及西班牙抗癌协会科学基金会（AECC）的资助（针对胰腺癌的多维度干预策略）。Cristina Peña 获得了卡洛斯三世健康研究所 Miguel Servet 项目合同的支持。M. Eaude 协助润色了英文文本。我们感谢实验室成员在本研究过程中提供的帮助与建议。

人体组织样本的获取已获得西班牙马德里拉蒙·卡哈尔医院研究伦理委员会的批准。
1. 溶液的配制
<ol>
	<li>制备0.2%明胶溶液：将1 g明胶加入500 mL PBS中。溶液经高压灭菌后置于4 °C保存。使用前用0.22 µm滤器过滤。</li>
	<li>制备1%戊二醛：将1 mL 25%戊二醛储备液加入24 mL PBS中。使用前用0.22 µm滤器过滤。</li>
	<li>制备1 M乙醇胺：用无菌H2O配制乙醇胺溶液。使用前用0.22 µm滤器过滤。 
	注意：由于乙醇胺带有安全盖，需使用针头和注射器操作。</li>
	<li>制备抗坏血酸：将0.1 mL 50 mg/mL抗坏血酸储备液（避光）加入100 mL培养基中。</li>
	<li>制备裂解缓冲液：用含20 nM NH4OH的PBS配制0.5% Triton 100X溶液。使用前立即加入NH4OH。</li>
	<li>制备含青霉素/链霉素的PBS：将青霉素/链霉素储备液稀释至终浓度为100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素。</li>
	<li>制备含10% FBS的DMEM：将10% FBS加入500 mL DMEM中。补充100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.1 mg/mL Normocin和0.25 µg/mL两性霉素B。</li>
	<li>制备2%热变性BSA：将2 g BSA加入100 mL无菌水中，在沸水中加热7分钟。</li>
	<li>制备含抗生素的FBS：在FBS中添加200 U/mL青霉素、200 µg/mL链霉素、100 µg/mL庆大霉素和2.5 g/mL两性霉素B。</li>
</ol>
2. 细胞培养准备
<ol>
	<li>永生化成纤维细胞系
	<ol>
		<li>在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养重组端粒酶转染的永生化人包皮成纤维细胞（BJ-hTERT，ATCC CRL-4001），并在37 °C、5% CO2条件下维持培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>内皮细胞
	<ol>
		<li>在含有2% FBS的EBM-2培养基中培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs，ATCC PCS-100-013），并在37 °C、5% CO2条件下维持培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成纤维细胞原代培养 
	注意：关于癌相关成纤维细胞（CAF）的建立与培养，本实验遵循本课题组先前发表的方案6。
	<ol>
		<li>简言之，将组织样本切成约2–3 mm3的小块，并接种于含高浓度抗生素的FBS中。</li>
		<li>当首批成纤维细胞出现后，更换为FBM培养基以维持细胞生长。 
		注意：根据组织来源不同，细胞培养易受污染。需用添加抗生素的PBS清洗样本，对于污染风险较高的组织（如结肠6），可振荡洗涤30–45分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 成纤维细胞来源的三维基质（改编自 Castelló-Cros 和 Cukierman16）
<ol>
	<li>向6孔板的每个孔中加入2 mL 0.2%明胶溶液，在37 °C孵育1小时，或在4 °C过夜。</li>
	<li>吸除明胶溶液，并用2 mL PBS洗涤一次。</li>
	<li>向每个孔中加入2 mL 1%戊二醛溶液，在室温下孵育30分钟。戊二醛将交联明胶。</li>
	<li>吸除戊二醛溶液，用2 mL PBS洗涤孔板，每次5分钟，重复3次。</li>
	<li>加入2 mL 1 M乙醇胺溶液，在室温下孵育30分钟。乙醇胺用于封闭残留的戊二醛基团。</li>
	<li>吸除乙醇胺溶液，用2 mL PBS洗涤孔板，每次5分钟，重复3次。</li>
	<li>加入1 mL含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。如果培养基立即变为粉红色，则移除培养基，用2 mL PBS洗涤，再重新加入1 mL含10% FBS的DMEM。</li>
	<li>向每孔接种1 mL成纤维细胞悬液，含5 × 105个细胞。每孔总体积为2 mL。</li>
	<li>培养细胞至完全汇合。然后移除培养基，更换为含10% FBS和50 µg/mL抗坏血酸的DMEM，并根据需要加入其他处理因素。</li>
	<li>每隔2天更换一次新鲜的含10% FBS和50 µg/mL抗坏血酸的DMEM，持续6天。 
	注意：若使用其他处理因素（例如PDGF-BB、TGF-β和/或其他生长因子），应在添加抗坏血酸的同一天加入这些因子。</li>
	<li>最后一次抗坏血酸处理后两天，移除培养基，并用2 mL PBS洗涤。</li>
	<li>向每个孔缓慢加入预热至37 °C的1 mL裂解缓冲液，在室温下孵育5–10分钟，直至成纤维细胞完全裂解（可在显微镜下观察确认）。</li>
	<li>小心操作，不吸除裂解缓冲液，加入2 mL PBS，然后吸除约2.5 mL PBS。重复该步骤两次，共洗涤三次。</li>
	<li>最后，吸除2.5 mL PBS，加入2 mL含青霉素/链霉素（Pen/Strep，终浓度分别为100 U/mL和100 µg/mL）的PBS。用封口膜密封后，于4 °C保存，最长可保存3个月。 
	注意：根据实验目的，长期储存所制备的细胞外基质可能影响实验结果。我们建议尽快使用基质，尤其是涉及细胞接种的实验，以避免蛋白质降解。若基质用于结构分析（如胶原观察），可进行固定并长期保存。本方案适用于6孔培养板。其他规格的培养板也可使用，但需根据孔面积重新计算反应体积和细胞悬液浓度。</li>
</ol>
4. 管腔形成实验
<ol>
	<li>在含2% FBS的EBM-2培养基中培养HUVEC细胞，直至达到最大汇合度。</li>
	<li>更换为不含FBS的EBM-2培养基，继续培养8小时。</li>
	<li>在接种细胞前准备基质。
	<ol>
		<li>从冰箱中取出基质，室温放置1小时。</li>
		<li>加入2 mL经热变性的2% BSA进行封闭，37 °C孵育1小时。</li>
		<li>吸除BSA溶液，用2 mL PBS洗涤一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在预先包被了3D成纤维细胞来源基质的6孔板每孔中，接种2 × 105个HUVEC细胞，使用无FBS培养基。</li>
	<li>将内皮细胞在37 °C条件下孵育16小时。</li>
	<li>在20–40倍放大倍数下，使用标准明场显微镜观察管状结构的形成。</li>
</ol>

<ol><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li>
<li>Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+Structure%2C+composition%2C+age-related+differences%2C+tools+for+analysis+and+applications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li>
<li>Erdogan, B., Webb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+modulate+growth+factor+signaling+and+extracellular+matrix+remodeling+to+regulate+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kB-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner.</a> Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).</li>
<li>Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+Cancer-associated+Fibroblast+Establishment+and+Culture+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth.</a> Bio-protocol. 6 (7), e1773(2016).</li>
<li>Herrera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+activation+on+3D-matrices+derived+from+PDGF-BB-stimulated+fibroblasts+is+mediated+by+Snail1%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1.</a> Oncogenesis. 7 (9), 76(2018).</li>
<li>MacColl, E., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Metalloproteinases+as+Regulators+of+Vein+Structure+and+Function%3A+Implications+in+Chronic+Venous+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).</li>
<li>Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Invasion+and+Angiogenesis+by+Zinc-Chelating+Agent+Disulfiram%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram.</a> Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).</li>
<li>Neri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+invasion+driven+by+extracellular+matrix+remodeling+is+dependent+on+the+properties+of+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).</li>
<li>Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+morphogenesis+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+on+cell-derived+macromolecular+matrix+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment.</a> Tissue Engineering. (Part A), (2014).</li>
<li>Bignon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysyl+oxidase-like+protein+2+regulates+sprouting+angiogenesis+and+type+IV+collagen+assembly+in+the+endothelial+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane.</a> Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).</li>
<li>Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+in+digestive+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).</li>
<li>Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+Snail1+in+the+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">The emerging role of Snail1 in the tumor stroma.</a> Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).</li>
<li>Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Matrix+Scaffolds+for+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).</li>
<li>Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCastell%C3%B3-Cros%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 522, 275-305 (2009).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

可使用永生化成纤维细胞或原代成纤维细胞培养物生成基质。成纤维细胞在体外培养中易于维持，具有较高的生长速率和抗应激能力。即使从死后组织中也能分离获得成纤维细胞3，尽管污染可能成为一个限制因素，具体取决于组织来源。
本文所述的3D基质模型为成功研究细胞外基质（ECM）组成和纤维取向提供了一种新颖且有效的系统。该模型也适用于成纤维细胞活化状态、基因/蛋白表达、与其他细胞类型的相互作用等方面的分析。需要特别指出的是，利用患者来源的成纤维细胞生成的基质使得对肿瘤中基质相关机制的个体化研究成为可能。例如，该方法可用于化疗耐药性的研究，其中细胞外基质发挥着重要作用。此类研究的转化应用有望在临床实践中辅助治疗决策，推动个体化医疗的实施。
尽管3D基质实验方案可能较为繁琐，但只要遵循操作步骤，仍可获得理想的结果。需要注意的是，该实验需要进行多次洗涤步骤，因此避免基质损伤至关重要。此外，我们建议在使用本方案测试不同细胞培养条件时，应同时制备各组基质，以减少实验过程中可能出现的微小差异（例如，在接种预...

细胞外基质（ECM）是一种存在于所有类型组织中的动态结构。它由蛋白质和多糖组成，形成对细胞黏附、迁移和通讯至关重要的纤维网络1。ECM的组成因组织类型而异。虽然I型胶原是最主要的结构蛋白，但在不同组织中也可发现II、III、V和XI型胶原2。成纤维细胞产生的纤连蛋白是细胞黏附所必需的2。此外，还存在其他结构分子，如弹性蛋白、层粘连蛋白，以及称为整合素的表面受体，它们介导纤维的组装，并具有不同ECM组织的特异性2。ECM作为细胞支架发挥重要作用，同时也参与生理和病理过程1。ECM的异常可见于癌症等疾病中，这些疾病会改变ECM的组成和/或其结构。在肿瘤中，ECM构成了肿瘤微环境（TME）的非细胞成分，TME是一个复杂的微环境，包含成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞、周细胞以及多种可溶性因子。已知TME促进癌症进展和转移；癌症相关成纤维细胞（CAFs）作为肿瘤间质中的主要细胞类型，参与了这一过程3。与正常成纤维细胞不同，CAFs处于持续活化状态，表现出更高的ECM蛋白和生长因子（例如转化生长因子-β，TGF-β）分泌水平，以及某些标志物（如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和成纤维细胞活化蛋白（FAP））的表达上调4。然而，CAFs是一类异质性的细胞群体，其活化程度或标志物表达水平各不相同5。因此可以推断，成纤维细胞来源的基质的组成和结构将取决于成纤维细胞的状态和特性。
在此背景下，本方法学的目标是建立一种合适的体外模型，以生成由成纤维细胞产生的、相当于体内细胞外基质（ECM）环境的基质。我们提出这一方法作为体外转化研究手段，可用于进一步研究由细胞外基质介导的肿瘤细胞功能，如化疗耐药性或迁移能力。正如我们课题组在其他文献中所发表的，癌症相关成纤维细胞（CAFs）可从新鲜组织样本中获得，但需注意的是，CAFs在体外培养中的存活时间有限，且传代次数较少6。此外，也可利用患者样本建立的CAFs原代培养物来生成基质。对成纤维细胞中基因表达进行调控，同样是制备多样化体外基质的一种有效策略，可用于评估其对基质组成、纤维取向等方面可能产生的影响。在这方面，我们课题组近期已报道了表达Snail的成纤维细胞在多种衍生基质的组成及纤维取向中的作用7。
此外，癌症相关成纤维细胞（CAFs）和细胞外基质（ECM）参与血管系统的形成，既参与血管生成，也构成血管外层的一部分8。ECM的重塑可诱导血管生成；基质金属蛋白酶（MMPs）似乎是参与该过程的最重要酶类9,10。产生ECM的原代细胞的组织血管化、ECM大分子、ECM中残留的生长因子、基质弹性以及基质厚度，均被描述为参与内皮细胞活化的因素11。在肿瘤中，缺氧会增加ECM的刚度并促进内皮细胞出芽12。此外，CAFs分泌血管内皮生长因子（VEGF）和血小板源性生长因子（PDGF），从而刺激肿瘤间质中的血管生成13。在该领域，体外基质生成可用于在不同实验条件下研究血管生成过程或MMP的作用。因此，体外重现最接近体内状态的基质，可能是研究ECM在血管生成或微环境细胞相互作用中作用的有力工具。
通过抗坏血酸刺激培养的成纤维细胞以增强基质沉积并生成细胞外基质（ECM），是制备类体内基质的一种公认方法。永生化成纤维细胞系易于培养，并可被多种生长因子激活，如血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）或转化生长因子-β14。在肿瘤微环境（TME）中，癌相关成纤维细胞（CAFs）以合成Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白作为细胞外基质（ECM）的主要成分4。类似地，这些成分也是体外生成的成纤维细胞来源基质的主要组分（图1）。
目前存在多种体外模拟体内细胞外基质（ECM）的方法。近年来，使用包被了ECM纤维混合物的培养皿较为普遍，但这种二维方法已逐渐被三维结构（如交联凝胶，例如Matrigel）所取代1。类Matrigel的体系已成为模拟三维基质的标准方法。纤维蛋白在构建基质时也是一种可选材料，但其在ECM的强度和耐久性方面存在不足1。胶原蛋白若与其他ECM组分联合使用，可在一定程度上弥补上述部分问题。然而，这些胶原凝胶虽能形成具有取向纤维的强韧网络，但其结构高度异质，可能影响实验的重复性1。尽管如此，应认识到根据实验目的的不同，使用Matrigel或其他水凝胶可能更为合适（例如在基质收缩研究中，凝胶收缩易于检测）。
所生成基质的潜在免疫原性在某些细胞类型的实验中可能成为一个问题。因此，为了降低使用本方法时由细胞外基质生成细胞引发免疫反应的可能性，需对基质进行脱细胞处理和洗涤，尽管细胞碎片的清除可能无法完全彻底15。理想的细胞外基质应具备细胞培养相容性，并能够传递和响应细胞信号。本方案允许在细胞外基质生成过程中轻松引入各种改变（例如，添加成纤维细胞刺激性生长因子）。

<table><tbody><tr><td>氢氧化铵 (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH)</td><td>Roth</td><td>A990.1</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906-50G</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-014-CVR</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞基础培养基 (EBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3121</td><td>使用前添加补充剂</td></tr><tr><td>内皮细胞培养基补充剂 (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma</td><td>411000-100ML</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td>使用前需热灭活</td></tr><tr><td>成纤维细胞生长基础培养基 (FBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3131</td><td>使用前添加补充剂</td></tr><tr><td>成纤维细胞生长培养基补充剂及生长因子 (FGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-4126</td><td></td></tr><tr><td>牛皮来源明胶</td><td>Sigma</td><td>G9391-100G</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma</td><td>g5882</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A92902-100G</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>诺莫辛</td><td>Invivogen</td><td>3ANT-NR-2</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 (Pen/Strep)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Roth</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>转染重组端粒酶永生化人包皮成纤维细胞 (BJ-hTERT)</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-4001</td><td></td></tr><tr><td>人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-013</td><td></td></tr></tbody></table>

成纤维细胞来源的三维基质系统在内皮细胞成管形成实验中的应用

Fibroblast-Derived 3D Matrix System Applicable to Endothelial Tube Formation Assay

细胞外基质（ECM）是一种三维结构支架，作为组织中细胞的主要支撑。除了结构功能外，ECM还参与调控细胞迁移、增殖和分化。成纤维细胞是主要的细胞类型，能够修饰ECM纤维的排列和生成。在癌症中，癌症相关成纤维细胞（CAFs）处于持续活化状态，参与ECM重塑，促进肿瘤细胞迁移，并刺激肿瘤相关的血管生成，发挥多种促肿瘤作用。本方法的目的是利用永生化成纤维细胞或人原代CAFs，构建出纤维组成类似于体内基质的三维基质。将成纤维细胞培养在预处理的细胞培养板中，并在抗坏血酸刺激下生长。随后去除成纤维细胞，对基质进行封闭处理，以便后续接种其他细胞。在此ECM模型中，可对成纤维细胞进行活化或修饰，以生成不同类型的基质，进而研究其对细胞培养的影响。三维基质也会受到细胞信号的影响，例如降解酶或交联酶可能改变纤维的分布。在此体系中，可研究血管生成过程，以及其他细胞类型（如上皮肿瘤细胞）的行为。

PDGF-BB 刺激的成纤维细胞可形成更厚的细胞外基质（ECM）。Herrera 等人展示了 PDGF 刺激的成纤维细胞不仅生成更厚的基质，还具有更高的纤维取向性7。BJ-hTERT 成纤维细胞在有或无 PDGF 的条件下孵育，观察代表性区域显示，由 PDGF 刺激的成纤维细胞产生的基质中细胞分布更加有序（图 1a）。来源于 PDGF 刺激成纤维细胞的基质中，I 型胶原和纤连蛋白的蛋白表达均升高（图 1b），因此基质厚度增加（图 1c）。此外，I 型胶原和纤连蛋白呈现平行排列模式，方向性直方图中可明显看出（图 1d）。
<p class="jove...

该方法的目的是获得成纤维细胞来源的三维基质，作为后续细胞实验的天然支架。将成纤维细胞接种于预处理的培养板中，并用抗坏血酸刺激以生成基质。随后对基质进行脱细胞处理并阻断，以用于培养相关细胞（例如内皮细胞）。

细胞外基质（ECM）是一种三维支架结构，为组织中的细胞提供主要支持。除了其结构功能外，……

本方案可实现观察不同类型的细胞培养物及其与细胞外基质的相互作用。该方法的主要优势在于，所获得的基质由成纤维细胞再生，因而与体内生成的基质非常相似。我们认为，当使用来自培养皿的成纤维细胞时，这种问题将变得无关紧要。利用这些细胞构建基质，可帮助我们了解其如何影响某些持久性状况。这些方法还可应用于例如基于基质特性的幸存者物理研究。可视化本实验方案对于观察操作步骤中的移液技术至关重要。首次尝试这些方法时，可能需要比预期更长的时间。我们的建议是尽可能提前做好准备，并利用准备时间规划后续步骤。首先，根据手稿中的说明配制 0.2% 明胶、1% 戊二醛和 1 摩尔乙醇胺溶液。确保每种溶液在使用前均经0.22微米滤器过滤。接下来，配制抗坏血酸和裂解缓冲液。按照文中的描述稀释PBS青链双抗，并配制含10%FBS的DMEM。通过将2克BSA加入100毫升无菌水中，并在沸水浴中加热七分钟，制备热变性的2% BSA溶液。然后，在FBS中添加青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B。将转染了重组端粒的永生化人包皮成纤维细胞在含10% FBS的DMEM中培养，并置于37°C、5% CO₂条件下维持培养。为建立原代成纤维细胞培养，将组织样本切成约2至3立方毫米的小块，并接种于含高浓度抗生素的FPS中。当出现第一批成纤维细胞时，将培养基更换为FBM培养基以进行细胞维持。向六孔板的每孔中加入2毫升0.2%明胶溶液，在37摄氏度孵育1小时，或在4摄氏度过夜。孵育结束后，吸除明胶溶液，并用2毫升PBS洗涤每孔。向每个孔中加入 2 毫升 1% 戊二醛，室温孵育 30 分钟，使明胶交联。吸除戊二醛，用 2 毫升 PBS 洗涤各孔，洗涤 5 分钟。为封闭残留的戊二醛，加入 2 毫升 1 摩尔乙醇胺，室温孵育 30 分钟。吸去乙醇胺，并用 PBS 重复洗涤。加入 1 毫升含 10% FPS 的 DMEM。如果培养基立即变为粉红色，应移除培养基，用 2 毫升 PBS 洗涤孔板一次，然后加入另 1 毫升 DMEM。每孔接种1 mL含有5 × 10⁵个细胞的成纤维细胞悬液，培养至细胞融合度达到100%。随后吸除培养基，更换为含10%胎牛血清（FBS）和50 µg/mL抗坏血酸的DMEM培养基。每两天换液一次，持续六天。在最后一次抗坏血酸处理后的两天，移除培养基，并用两毫升 PBS 洗涤各孔。洗涤后，缓慢加入一毫升预热的裂解缓冲液，室温孵育五到十分钟，直至成纤维细胞完全裂解。无需去除裂解缓冲液，小心向每孔加入两毫升 PBS，然后吸出约 2.5 毫升液体。重复此过程两次，共洗涤三次。最后一次洗涤后，加入含有青链霉素的 2 毫升 PBS。用封口膜密封培养板，并在 4 摄氏度条件下保存，最长可保存三个月。将 HUVEC 细胞和 EMB-2 在含 2% FBS 的培养基中培养至完全汇合。随后更换为不含 FBS 的 EBM-2 培养基，孵育八小时。为准备用于接种细胞的基质，将其从冰箱中取出，并在室温下放置一小时。通过加入2毫升热变性的2% BSA封闭基质，并在37°C下孵育1小时。然后吸除BSA，用2毫升PBS洗涤。将2 × 10⁵个HUVEC细胞接种至涂有成纤维细胞来源基质的培养板各孔中。将细胞在37摄氏度下孵育16小时，然后在标准明场显微镜下以20-40倍放大倍数观察管状结构。该方案用于检测PDGF处理对成纤维细胞来源基质形成的影响。与未添加PDGF孵育的细胞相比，经PDGF孵育的BGH第三代表皮成纤维细胞在基质中表现出更有序的细胞分布。PDGF 刺激的成纤维细胞来源的基质中，I 型胶原和纤连蛋白的蛋白表达增加，因此基质厚度也随之增加。此外，方向性直方图显示，I 型胶原和纤连蛋白呈现平行排列模式。当将 HUVEC 细胞接种于 PDGF 刺激的成纤维细胞来源的去细胞化基质上时，其形成的毛细血管样结构多于未受刺激条件下的情况。证实由 PDGF-BB 刺激的成纤维细胞衍生的基质可促进内皮细胞活化。进行此操作时，重要的是提前准备好溶液，并确保细胞在开始前已处于合适状态。除内皮细胞研究外，这些基质也可接种上皮细胞，以观察其对外部因素（如培养基条件或细胞毒性药物）的反应。在肿瘤大环境实验设计中，细胞外基质的生成至关重要。

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成纤维细胞来源的三维基质系统在内皮细胞成管形成实验中的应用

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