成纤维细胞来源的三维基质系统在内皮细胞成管形成实验中的应用

本方案可实现观察不同类型的细胞培养物及其与细胞外基质的相互作用。该方法的主要优势在于，所获得的基质由成纤维细胞再生，因而与体内生成的基质非常相似。我们认为，当使用来自培养皿的成纤维细胞时，这种问题将变得无关紧要。

利用这些细胞构建基质，可帮助我们了解其如何影响某些持久性状况。这些方法还可应用于例如基于基质特性的幸存者物理研究。可视化本实验方案对于观察操作步骤中的移液技术至关重要。

首次尝试这些方法时，可能需要比预期更长的时间。我们的建议是尽可能提前做好准备，并利用准备时间规划后续步骤。首先，根据手稿中的说明配制 0.2% 明胶、1% 戊二醛和 1 摩尔乙醇胺溶液。

确保每种溶液在使用前均经0.22微米滤器过滤。接下来，配制抗坏血酸和裂解缓冲液。按照文中的描述稀释PBS青链双抗，并配制含10%FBS的DMEM。

通过将2克BSA加入100毫升无菌水中，并在沸水浴中加热七分钟，制备热变性的2% BSA溶液。然后，在FBS中添加青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B。将转染了重组端粒的永生化人包皮成纤维细胞在含10% FBS的DMEM中培养，并置于37°C、5% CO₂条件下维持培养。为建立原代成纤维细胞培养，将组织样本切成约2至3立方毫米的小块，并接种于含高浓度抗生素的FPS中。

当出现第一批成纤维细胞时，将培养基更换为FBM培养基以进行细胞维持。向六孔板的每孔中加入2毫升0.2%明胶溶液，在37摄氏度孵育1小时，或在4摄氏度过夜。孵育结束后，吸除明胶溶液，并用2毫升PBS洗涤每孔。

向每个孔中加入 2 毫升 1% 戊二醛，室温孵育 30 分钟，使明胶交联。吸除戊二醛，用 2 毫升 PBS 洗涤各孔，洗涤 5 分钟。为封闭残留的戊二醛，加入 2 毫升 1 摩尔乙醇胺，室温孵育 30 分钟。

吸去乙醇胺，并用 PBS 重复洗涤。加入 1 毫升含 10% FPS 的 DMEM。如果培养基立即变为粉红色，应移除培养基，用 2 毫升 PBS 洗涤孔板一次，然后加入另 1 毫升 DMEM。

每孔接种1 mL含有5 × 10⁵个细胞的成纤维细胞悬液，培养至细胞融合度达到100%。随后吸除培养基，更换为含10%胎牛血清（FBS）和50 µg/mL抗坏血酸的DMEM培养基。每两天换液一次，持续六天。

在最后一次抗坏血酸处理后的两天，移除培养基，并用两毫升 PBS 洗涤各孔。洗涤后，缓慢加入一毫升预热的裂解缓冲液，室温孵育五到十分钟，直至成纤维细胞完全裂解。无需去除裂解缓冲液，小心向每孔加入两毫升 PBS，然后吸出约 2.5 毫升液体。

重复此过程两次，共洗涤三次。最后一次洗涤后，加入含有青链霉素的 2 毫升 PBS。用封口膜密封培养板，并在 4 摄氏度条件下保存，最长可保存三个月。

将 HUVEC 细胞和 EMB-2 在含 2% FBS 的培养基中培养至完全汇合。随后更换为不含 FBS 的 EBM-2 培养基，孵育八小时。为准备用于接种细胞的基质，将其从冰箱中取出，并在室温下放置一小时。

通过加入2毫升热变性的2% BSA封闭基质，并在37°C下孵育1小时。然后吸除BSA，用2毫升PBS洗涤。将2 × 10⁵个HUVEC细胞接种至涂有成纤维细胞来源基质的培养板各孔中。

将细胞在37摄氏度下孵育16小时，然后在标准明场显微镜下以20-40倍放大倍数观察管状结构。该方案用于检测PDGF处理对成纤维细胞来源基质形成的影响。与未添加PDGF孵育的细胞相比，经PDGF孵育的BGH第三代表皮成纤维细胞在基质中表现出更有序的细胞分布。

PDGF 刺激的成纤维细胞来源的基质中，I 型胶原和纤连蛋白的蛋白表达增加，因此基质厚度也随之增加。此外，方向性直方图显示，I 型胶原和纤连蛋白呈现平行排列模式。当将 HUVEC 细胞接种于 PDGF 刺激的成纤维细胞来源的去细胞化基质上时，其形成的毛细血管样结构多于未受刺激条件下的情况。

证实由 PDGF-BB 刺激的成纤维细胞衍生的基质可促进内皮细胞活化。进行此操作时，重要的是提前准备好溶液，并确保细胞在开始前已处于合适状态。除内皮细胞研究外，这些基质也可接种上皮细胞，以观察其对外部因素（如培养基条件或细胞毒性药物）的反应。

在肿瘤大环境实验设计中，细胞外基质的生成至关重要。