Name: 解剖果蝇黑色素组飞行肌肉为奥米克斯方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学习解剖果蝇蛹间接飞行肌的详细方案，利用GFP荧光标记技术获取高纯度肌肉样本。该方法适用于蛋白质组学和转录组学研究，可深入分析肌肉发育过程中的基因表达调控机制。

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我们感谢Andreas Ladurner和Frank Schnorrer提供的大力支持。感谢Sandra Esser提供的出色技术协助，以及Akanksha Roy在生成质谱数据方面的贡献。我们感谢布卢明顿和维也纳果蝇资源中心提供果蝇品系。感谢慕尼黑大学生物医学中心（LMU Biomedical Center，Martinsried，德国）的生物成像核心设施在共聚焦显微成像方面的帮助，以及蛋白质分析中心实验室（Zentrallabor für Proteinanalytik）对质谱样品的分析。本研究得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungs Gemeinschaft，MLS，项目编号SP 1662/3-1）、慕尼黑路德维希-马克西米利安大学的整合蛋白质科学中心（CIPSM，MLS）、Frederich-Bauer基金会（MLS）以及国际马克斯·普朗克研究学院（EN）的资助。

1. 蛹的分期
<ol>
	<li>在培养瓶中饲养所需基因型的果蝇（图1E）。可直接翻新解剖用果蝇品系，或设置杂交，至少使用20只雌性处女蝇。持续培养至果蝇开始化蛹。</li>
	<li>用湿润的画笔收集未成熟蛹，并转移至60 mm培养皿中的湿润滤纸上（图1F）。</li>
	<li>对蛹进行性别鉴定，收集实验所需的性别个体（图1G）。雄性蛹可通过其体内精巢识别，精巢在不透明的蛹体中呈现为透明球状结构。</li>
	<li>在培养皿上标注时间、日期和基因型，随后将蛹培养至所需发育阶段（图1H）。 
	注意：杂交组合/品系的维持及蛹的培养应在温度可控的培养箱中进行（例如，RNAi杂交使用25 °C或27 °C，因较高温度下Gal4活性增强，可提高基因敲低效率40）。确保湿度足够高，以防在多天培养过程中蛹体干燥。</li>
</ol>
2. 48 h APF 前的 IFM 解剖
<ol>
	<li>准备必要的设备，包括两把#5生物级镊子、移液器、移液器吸头、干冰，以及（针对RNA样本）裂解试剂（见材料表）。此外，将黑色解剖皿（见材料表）、1x磷酸盐缓冲液（PBS）和1.5 mL微量离心管置于冰上预冷。</li>
	<li>使用湿润的画笔将处于特定发育阶段的蛹转移至装有约三分之二冷1x PBS的黑色解剖皿中（图2A,B）。然后移至荧光解剖显微镜下进行操作。 
	注意：转移的蛹数量应控制在30分钟内可完成解剖的范围内。根据操作经验，通常为3–15只蛹。有关黑色解剖皿的替代方案，请参见补充方法。</li>
	<li>使用#5镊子将其中一只蛹推至黑色解剖皿底部，并调节显微镜的变焦和焦距，以清晰观察蛹体（图2C）。</li>
	<li>用一把镊子夹住蛹的前端（图2D），再用另一把镊子的单侧尖端在腹部略微偏离中心的位置、紧靠胸部后方刺入，以固定蛹体，防止间接飞行肌（IFMs）移入腹部（图2E）。 
	注意：从此时起开始计时解剖持续时间，即一旦蛹体完整性被破坏即开始计时。采用固定的解剖时长（例如20–30分钟），以尽量减少肌肉死亡及其相关的转录组和蛋白质组变化。在此时间段内尽可能多地完成解剖。</li>
	<li>使用第一把镊子移除蛹壳的前半部分（图2F）。</li>
	<li>使用同一把镊子在胸部后方夹住暴露的蛹体，并将腹部与胸部分离（图2G）。</li>
	<li>用镊子轻轻挤压胸部前部（对于&#60;35小时APF的样本），或撕开胸腔以暴露荧光标记的间接飞行肌（IFMs）（图2H）。由于早期时间点肌腱连接较脆弱，IFMs会容易从表皮脱离。使用镊子将剩余的残余组织推至解剖皿的另一侧并丢弃。</li>
	<li>重复步骤2.3–2.7，继续解剖其他蛹。</li>
	<li>用镊子收集IFM纤维，并将其整理成堆置于黑色解剖皿底部（图2I,J）。使用镊子将杂质推出视野范围以清除残留物。 
	注意：经过练习后，镊子尖端可在不相互接触的情况下靠近。该技术可用于松散抓取IFMs而不造成损伤。其他可选方法包括用单侧尖端或完全闭合的镊子轻轻推动或提起IFMs，或连同部分脂肪或其他组织一并夹取IFMs，并在步骤2.10中所述方法去除脂肪。</li>
	<li>使用镊子对IFM肌肉样本进行质量控制，去除样本中的非IFM肌肉、脂肪、几丁质外壳等杂质（图2K,L）。 
	注意：使用Mef2-Gal4驱动时，在早期时间点IFM的荧光标记强度高于其他类型的肌肉（图2K,K'），因此可根据荧光强度和肌肉形态去除跳跃肌和幼虫肌肉。脂肪和几丁质组织外观不同，且不会被肌肉特异性荧光标记所标记（图2K,K'）。有关其他可标记IFM的Gal4品系，请参见讨论部分。</li>
	<li>使用剪去尖端的移液器吸头，将成堆的IFMs转移至含有250 μL预冷1x PBS的1.5 mL微量离心管中（图2M-O）。随后立即进入第4节操作。 
	注意：IFM样本可能因粘附在移液器吸头壁上而丢失。在收集IFMs前，将缓冲液反复吹打数次可降低普通吸头的粘附性；使用硅化处理或全氟烷氧基（PFA）吸头（见材料表），因其表面张力较低，有助于防止样本损失。</li>
</ol>
3. 48 h APF 后的 IFM 解剖
<ol>
	<li>准备必要的设备，包括两把#5生物级镊子、精细剪刀、标准玻璃显微镜载玻片、双面胶带、移液器、移液器吸头、干冰，以及（用于RNA实验的）裂解试剂（见材料表）。将1×PBS和微量离心管置于冰上预冷。</li>
	<li>使用略微湿润的画笔，将发育阶段明确的蛹转移至固定在显微镜载玻片上的双面胶带条上（图3A）。将蛹按相同方向排成一行（腹面朝下，前端朝向载玻片底部）。 
	注意：注意不要在画笔或滤纸上使用过多水分，否则蛹无法牢固粘附。若蛹粘附不牢，可先将其转移至干燥的滤纸或纸巾上进行干燥处理。每次固定蛹的数量应控制在30分钟内可完成解剖的范围内，理想数量约为10只蛹。</li>
	<li>将蛹从蛹壳中取出。用镊子轻轻分离并打开位于前气门上方的蛹壳（图3B）。</li>
	<li>将一对镊子从背侧向后端轻轻滑动，随着镊子移动剪开蛹壳（图3B'）。注意避免刺破下方的蛹体。将蛹从打开的蛹壳中取出，并立即转移至另一张载玻片上的1×PBS液滴中（图3B&#34;,C）。</li>
	<li>对排列好的所有蛹重复步骤3.3和3.4，然后将带有双面胶的载玻片暂时放置一旁。</li>
	<li>使用精细剪刀将蛹的腹部从胸部切下，并推至一旁形成单独的堆（图3D,D'）。对剩余的蛹重复此操作。 
	注意：从步骤3.6开始计时解剖持续时间，因为一旦蛹体完整性被破坏即应开始计时。应在20–30分钟内尽可能多地完成果蝇解剖，以防止细胞死亡及其相关的转录组和蛋白质组变化。在解剖1日龄成虫或&#62;90小时蛹时，为便于后续操作，通常可额外使用精细剪刀去除头部。</li>
	<li>用纸巾吸除大部分1×PBS（通常因悬浮脂肪而呈浑浊状）以及腹部组织堆（图3E）。向剩余的胸部组织中加入一滴新鲜且预冷的1×PBS。</li>
	<li>使用剪刀沿身体纵轴从头部向下一次性将胸部纵向剪成两半（图3F,F'）。或者，若头部已被移除，可先将剪刀插入原头部连接处，沿IFM之间纵向剪开胸部上半部分，然后在同一方向进行第二次剪切，切开胸部腹侧。</li>
	<li>对所有待解剖的蛹重复步骤3.7和3.8，在载玻片中央附近形成一堆胸部半切组织。确保载玻片上有足够的预冷1×PBS，以防止半切组织干燥。 
	注意：在蛹发育48小时后（APF），间接飞行肌（IFMs）已足够大，经训练的观察者可在标准解剖显微镜下清晰识别。在此步骤中，若肌肉带有荧光标记，可将其转移至荧光解剖显微镜下以辅助IFM识别或用于培训目的，但此操作并非必需。</li>
	<li>从胸部组织中解剖出间接飞行肌（IFMs）。使用#5镊子夹取其中一个半切胸部组织（图3G,H）。将一把镊子的尖端轻轻插入IFMs中段的上方和下方（图3G',H'）。保持第一把镊子不动，使用精细剪刀将IFM的一端从表皮和肌腱上剪下，然后将另一端也从表皮上剪离（图3G'',H''）。 
	注意：根据首次切割后胸部的朝向，可将胸部旋转180°，以便更方便地进行第二次IFM切割。</li>
	<li>用镊子将IFM束从胸部组织中取出（图3G''',H'''），转移至PBS液滴边缘，利用表面张力将其固定（图3I）。将残余组织推至载玻片的另一侧。对剩余的胸部半切组织重复此操作，收集解剖得到的IFMs。 
	注意：若IFMs无法整齐堆叠，可用纸巾吸除部分1×PBS。注意避免PBS完全蒸发，并确保解剖后的IFMs和半胸部组织始终被缓冲液覆盖。</li>
	<li>完成所有IFMs解剖后，迅速进行质量控制。使用#5镊子去除可能混入样本中的跳跃肌或表皮碎片（图3J-K''）。 
	注意：跳跃肌在形态上与IFM不同。若在荧光下解剖Mef2-Gal4标记的肌肉，跳跃肌荧光较弱，且形状和质地不同；在普通光线下，其呈近乎透明状，而IFMs则为不透明的乳黄色（图3J-J'',K）。</li>
	<li>利用液体表面张力，用一对镊子夹住解剖得到的IFMs（但不要压碎）（图3L）。将IFMs转移至预先装有250 μL预冷1×PBS的1.5 mL微量离心管中（图3M）。立即进入第4节操作。 
	注意：当镊子尖端靠近并从缓冲液中提起时，液面张力会使缓冲液在镊尖间形成液泡。若IFMs位于该液泡中，则可随液泡被提起并轻松转移至另一个盛有缓冲液的容器中。操作时应轻压镊子使尖端接近但不接触，以避免压碎液泡中的组织。</li>
</ol>
4. 收集并保存 IFM 样本
<ol>
	<li>将1.5 mL微量离心管在台式离心机中以2,000 × g离心3–5分钟，沉淀IFMs（图4A,B）。</li>
	<li>使用移液器吸头吸除上清液（图4C）。</li>
	<li>如用于RNA实验，将IFM沉淀重悬于50–100 μL所需的RNA提取缓冲液中（见材料表，图4D）。否则，进入步骤4.4。 
	注意：IFMs可在步骤4.2后直接冷冻干燥，用于质谱分析或使用商业试剂盒提取RNA（见代表性结果）。对于RNA实验，立即将IFM沉淀重悬于提取缓冲液中并速冻，可获得更佳效果。</li>
	<li>将样品置于干冰上或在液氮中快速冷冻（图4E）。随后于-80 °C保存，直至进行后续样品制备步骤。 
	注意：冷冻保存后，样品可在数月内保持稳定，适合后续分析处理。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们介绍了从早期和晚期蛹中解剖Drosophila间接飞行肌（IFM）的基本技术，以用于后续分离蛋白质、DNA、RNA或其他大分子。该方案可轻松调整，用于成年果蝇IFM的解剖。我们展示了本解剖方案在mRNA-Seq、蛋白质组学和RT-PCR应用中的实用性。随着组学技术的不断进步，使得对起始材料更少、输入浓度更低的样本进行分析成为可能，此类解剖操作未来可能在更多研究领域中发挥重要价值。由于IFM是研究人类肌病4,24和肌肉类型特异性发育9,12的成熟模型，我们预期该技术可进一步应用于IFM富集的代谢组学分析、通过3C或4C技术研究染色质构象、通过CLiP相互作用评估剪接网络，或肌原纤维生成过程中的磷酸化蛋白质组学研究。
需要注意的是，这些解剖操作所获得的样品富含间接飞行肌（IFM），而非纯的间接飞行肌样品。由于运动神经元的支配、肌腱附着以及气管对肌纤维的侵入，这种情况不可避免。可以利用生物信息学分析来鉴定在IFM中富集的基因或蛋白质，但仍需进一步实验以证明其确实为IFM特异性表达。样品纯度可通过已发表的组织特异性标志物进行检测，例如Stripe45（肌腱）、Act79B4,44（管状肌）、Act88F15（IFM）或syb46（神经元特异性）。或许可利用这些标志物对数据集进行标准化处理，以校正IFM特异性成分的含量差异，但需注意，用于标准化的基因（例如IFM特异性基因或微管蛋白基因）在不同时间点的表达变化可能会影响该方法的准确性。
近年来已开发出多种基于基因编码的组织特异性标记方法，例如用于分离RNA的EC标记法47,48或PABP标记法49,50，这些方法有助于获得真正具有组织特异性的RNA样本。然而，EC标记法需要持续饲喂果蝇47，因此无法应用于蛹期阶段。PABP标记转录组的灵敏度和完整性可能存在一定局限性51。由于间接飞行肌（IFMs）细胞体积大且具有合胞体特性，采用FACS方法分离单个肌纤维较为复杂。类似INTACT52,53的技术可用于从IFMs中分离特定的亚细胞结构，这可能有助于纯化IFM细胞核或线粒体群体。目前，手工解剖仍是大多数下游应用中获取完整IFM组织的常规标准方法。
样品质量取决于解剖过程中的多个关键步骤。解剖操作在技术上具有较高要求，随着经验积累，解剖速度和样品纯度会逐步提高。在无去垢剂的预冷缓冲液中进行较短时间（20–30 分钟）的解剖，并立即冷冻样品，有助于保持样品完整性，这一点在此前的小鼠肌腱分离研究中已有报道54。在去除沉淀中所有缓冲液后，可成功对间接飞行肌（IFM）进行干冻保存；但若专门用于RNA提取，将样品在裂解缓冲液中冷冻通常可获得更优结果。在进行RNA或蛋白质提取前，可合并最多20次独立解剖所获得的IFM样品，从而实现样本扩增，即使对于早期时间点或突变体样本，也能收集到足够的材料用于后续分析16,32。
对于RNA相关应用，最关键的步骤可能是RNA本身的分离。硫氰酸胍-苯酚-氯仿法（上述方法1）的性能优于大多数经过测试的商业试剂盒，且如前所述，成本显著更低55。商业试剂盒在RNA提取得率上表现出的变异性，与以往的研究结果一致56,57。我们在异丙醇沉淀步骤中进一步加入糖原，以帮助回收全部RNA。除了RNA得率外，验证RNA完整性也十分重要，以确保样本在解剖和提取过程中未发生片段化或降解。此外，必须在无RNase的环境中操作。最后，逆转录（RT）试剂盒的选择会影响逆转录过程的灵敏度。尽管这些因素并不总是被详细讨论，但它们均会影响IFM样本的质量以及下游应用所获得数据的可靠性。
本方案与现有的间接飞行肌（IFM）解剖方案相比，具有几项重要改进。尽管已有详细的IFM免疫荧光解剖方案19，但本方案采用了一种不同的蛹期解剖方法，可更快速地分离IFM组织。这使得在较短的解剖时间内相对高效地收集大量IFM组织成为可能，从而避免蛋白质组或转录组发生改变。其他方案描述了成虫IFM的解剖，用于观察单个肌原纤维中的GFP染色39，或幼虫体壁肌的染色58，但并未涉及蛹期阶段的解剖，也未针对RNA或蛋白质的提取进行优化。本方法也不同于现有的从冷冻切片中显微解剖蛹期IFM的方案38，后者可能获得更纯净的IFM样本，但操作更为耗时且产量较低。与其他快速成虫IFM解剖方案38,39相比，本方法在不含去垢剂的PBS缓冲液中分离IFM，以限制应激反应的诱导及其他显著的表达变化。
本方案的关键改进在于引入了活体荧光报告基因，使得能够在蛹发育早期阶段分离间接飞行肌（IFM）。我们通常使用Mef2-GAL459驱动UAS-CD8::GFP或UAS-GFP::Gma60。这种方法可实现IFM的差异标记（飞行肌的标记强度更高，形态也与其他蛹期肌肉不同），并可用于开展基于GAL4-UAS系统的遗传操作，例如基因挽救或RNAi实验。此外，也可将Mef2-GAL4 与tub-GAL80ts联用，以避免RNAi导致的早期致死，或与UAS-Dcr2联用以提高RNAi效率40。
另有其他GAL4驱动子或GFP标记品系可供选择，其在肌肉类型特异性、时间表达模式和驱动强度方面各不相同19,61，可替代Mef2-GAL4使用。例如，Act88F-GAL4在羽化后约24小时（APF）才开始表达，因此不能用于更早的时间点；然而，它对间接飞行肌（IFM）具有强标记能力，可能有助于避免RNAi相关的早期致死效应。Him-GFP或Act88F-GFP也可标记IFM，但同样存在时间限制，其优势在于标记表达不依赖GAL4系统，因此在与感兴趣的突变背景联用时可能更具优势。其他潜在标记品系的列表已有报道19。还应注意，使用转基因和GAL4/UAS系统可能导致基因表达的人为假象，因此必须设置适当的对照，例如将驱动子品系与野生型背景品系杂交，以确保所有样本中此类假象保持一致。
通过配套视频，本详细方案旨在使蛹期间接飞行肌（IFM）解剖技术更易于掌握，推动组学方法在肌肉发育研究中的应用。结合强大的 果蝇 通过分离的间接飞行肌（IFM）可开展遗传学、细胞生物学以及生物化学和组学检测，这有望促进对肌发生机制和肌肉功能的深入理解。未来将转录组和蛋白质组调控的系统水平观测与代谢及功能输出相关联的研究，将有助于更深入地理解肌肉类型特异性发育以及肌肉疾病的发病机制。

现代组学技术为研究肌肉发育以及人类肌肉疾病机制提供了重要见解。例如，通过结合动物模型中的遗传学和生化验证手段对转录组学数据进行分析，揭示了剪接因子 RBM20 的缺失会导致扩张型心肌病，这是因为它调控着一个包含 30 多个与心脏疾病相关的肌节基因的目标网络，其中包括肌联蛋白1,2,3。
在第二个例子中，细胞培养、动物模型及人类患者的研究表明，强直性肌营养不良是由于RNA调控紊乱所致，其机制为肌肉盲样蛋白（MBNL）被隔离以及CELF1上调4,5MBNL 与 CELF1（也称为 CUGBP1 或 Bruno-Like 2）之间的交叉调控和时间动态有助于&#160;解释强直性肌营养不良症患者中持续存在的胚胎剪接模式。此外，这一庞大的失调靶点网络有助于阐明该疾病的复杂性4,6,7,8大多数此类研究利用模式生物中的组学方法来解析人类肌肉疾病的潜在机制。此外，这些研究强调，首先需要了解健康肌肉中时间特异性和组织类型特异性的基因表达、蛋白质修饰以及代谢模式，才能阐明病变或衰老肌肉中的异常变化。
Drosophila melanogaster 是另一种广泛应用的遗传学模式生物。从果蝇到脊椎动物，肌节的结构及其各个组分均高度保守4,9,10，而间接飞行肌（IFMs）已成为研究肌肉发育多个方面的有力模型11,12。首先，纤维状飞行肌在功能和形态上均不同于管状体壁肌11,13，这使得研究人员能够探究肌肉类型特异性的发育机制。包括 Spalt major（Salm）14、Extradenticle（Exd）和 Homothorax（Hth）15 在内的转录因子已被鉴定为纤维状肌肉命运的调控因子。此外，在 Salm 的下游，CELF1 的同源物 Bruno1（Bru1, Aret）可调控纤维状肌肉特异的剪接程序16,17。
其次，间接飞行肌（IFMs）是研究肌发生过程本身的重要模型，涵盖从成肌细胞融合、肌管附着到肌原纤维形成及肌节成熟的各个阶段。9,18,19第三， 果蝇 遗传学方法能够研究单个蛋白质、蛋白质结构域及蛋白质异构体在肌节形成、功能及其生物物理特性中的作用20,21,22,23最后，IFM模型已被开发用于研究多种人类肌肉疾病，如强直性肌营养不良、肌原纤维肌病、肌肉变性性疾病、肌动蛋白病等。24,25,26,27，并为疾病机制和潜在治疗方法提供了重要见解28,29,30因此， 果蝇 是研究肌生成领域诸多未解问题的有用模型，包括肌肉类型特异性转录、剪接及染色质调控机制，以及代谢在肌肉发育中的作用。现代组学技术的应用，特别是与该模型中已有的多种遗传学、生物化学和细胞生物学检测方法相结合， 黑腹果蝇有望极大地推动对肌肉发育、衰老及疾病机制的理解。
间接飞行肌（IFMs）是果蝇中最大的肌肉，在成虫体内横跨胸部全长，长度接近 1 mm31,32。然而，由于其体积微小，难以获取足够的组织样本，从而为在 Drosophila 中以组织特异性方式应用组学技术带来了挑战。此外，IFMs 属于在蛹期发育形成的成虫肌肉系统。成肌细胞融合形成肌管，约在蛹壳形成后 24 小时（APF）附着于肌腱，并在约 30 小时 APF 经历必要的压缩过程，以启动肌原纤维生成（图 1A-D）18,33,34。
随后，肌纤维生长至贯穿整个胸部，肌原纤维经历一个以增加肌节为主的初始生长期，直至约48 h APF，之后转入成熟阶段，在此阶段肌节在长度和宽度上继续生长，并经过重塑，于72 h APF时建立牵张激活能力（图1A-D）32,35。纤维成熟的起始至少部分受Salm和E2F调控32,36,37，且在此阶段会整合多种由Bru1调控其剪接的间接飞行肌特异性肌节蛋白异构体16,17。成熟果蝇于90–100 h APF期间羽化。这意味着，若要研究肌肉发育，必须从多个蛹期时间点分离出足量、高质量且高纯度的间接飞行肌，以支持采用组学方法进行分析。
已有多种关于间接飞行肌（IFM）解剖的实验方案发表。尽管这些方案在各自预期的应用中效果良好，但没有一种方案完全适用于组学研究。一些方案专注于保留蛹期和成虫期IFM的形态以进行免疫荧光分析19，另一些用于分离IFM纤维以进行力学性能评估31，或采用从冷冻切片中显微解剖蛹期IFM的方法38，这些方法过于专一，且耗时耗力，难以合理地获得足够量的IFM组织用于组学研究。此外，已有针对成虫IFM快速解剖的方案被开发出来38,39，但这些方案不适用于蛹期，并且所使用的缓冲液可能不适合甚至与某些组学应用（例如RNA提取）不兼容。因此，亟需建立新的方法以分离蛹期IFM，用于生物化学或组学研究。
本文介绍了一种在蛹期解剖间接飞行肌（IFM）的实验方案，该方案可用于研究&#160;已成功用于从16小时成蛹后至成虫阶段的mRNA-Seq分析16,32该方案采用绿色荧光蛋白（GFP）标记，在蛹期和成虫发育的各个阶段识别间接飞行肌（IFMs），从而可在荧光体视显微镜下进行活体解剖。该方法比现有的IFM解剖方案更省时省力，通量更高。这使得样品能够快速分离并冷冻保存，经过数轮解剖后可获得足量材料，适用于组学研究以及标准的逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）或蛋白质印迹（western blotting）。
本方案分为两部分，分别演示如何在48小时成蛹前（APF）（早期变态阶段，此时间接飞行肌（IFM）附着较不稳定）和48小时成蛹后（APF）（此时蛹体结构和IFM附着已清晰明确）快速解剖间接飞行肌。我们证明，可在各个时间点从解剖获得的IFM中提取高质量RNA，并提供了不同RNA提取与反转录方法的数据。最后，我们以CELF1同源基因Bruno1为例，展示该解剖方案在mRNA-Seq、质谱分析和RT-PCR中的应用。我们通过Bruno1突变体IFM的蛋白质组学数据揭示了肌原纤维蛋白异构体的异常表达，并分析了Bruno1对肌球蛋白重链（Mhc）C端剪接事件的调控作用。这些结果说明，组学数据可深入揭示生物学现象，与遗传学和生物化学实验相互补充。

<table><tbody><tr><td>5x 高保真（HF）缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>F518L</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z643084-600EA</td><td>Greiner 培养皿，60 mm × 15 mm，带透气孔</td></tr><tr><td>黑色解剖皿（玻璃）</td><td>奥古斯塔劳动力需求</td><td>42021010</td><td>骨盆，黑色玻璃，4 cm × 4 cm</td></tr><tr><td>黑硅解剖皿：活性炭粉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9157</td><td>也可在大多数药店购买到</td></tr><tr><td>黑硅解剖皿：Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td>将Sylgard（约50 g）与活性炭粉末（200 mg）混合，倒入培养皿中（约4个60 mm培养皿），固化成盘。</td></tr><tr><td>蓝色研钵杵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td>任何可灭菌的研钵研杵，也可与电机驱动的研磨器配合使用</td></tr><tr><td>手机摄像头，三星 Galaxy S9</td><td>三星</td><td>SM-G960F/DS</td><td>用于非显微镜下拍摄的照片</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3691,0500</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜，Leica SP8X 直立式共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜，蔡司 LSM 780 倒置共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>www.zeiss.com</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Scotch/3M</td><td>3M ID 70005108587</td><td>双面胶带，大多数办公用品供应商均有售</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Inox 直头尖端 11 厘米镊子，生物级，尖端尺寸 0.05 毫米 × 0.02 毫米</td></tr><tr><td>乙醇（100%，RNase free）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-M</td><td></td></tr><tr><td>荧光解剖显微镜相机，Leica DFC310 FX 相机</td><td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>荧光解剖显微镜软件，Leica Application Suite (LAS) 版本 4.0.0</td><td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>荧光解剖显微镜，Leica M165 FC</td><td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>果蝇：Bru1[M2]</td><td></td><td></td><td>果蝇品系；本文</td></tr><tr><td>果蝇：Bru1[M3]</td><td></td><td></td><td>果蝇品系；本文</td></tr><tr><td>果蝇：Mef2-GAL4</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>BDSC:27390</td><td>果蝇品系</td></tr><tr><td>果蝇：salm[1]</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>3274</td><td>果蝇品系</td></tr><tr><td>果蝇：salm[FRT]</td><td></td><td></td><td>果蝇品系；参见 Spletter 等，Elife，2018</td></tr><tr><td>果蝇：UAS-Bru1IR</td><td>维也纳果蝇研究中心</td><td>GD41568</td><td>果蝇品系，RNAi发夹结构</td></tr><tr><td>果蝇：UAS-GFP::Gma</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>BDSC:31776</td><td>果蝇品系</td></tr><tr><td>果蝇：UAS-mCD8a::GFP</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>BDSC:5130</td><td>果蝇品系</td></tr><tr><td>果蝇：w[1118]</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>3605</td><td>果蝇品系</td></tr><tr><td>果蝇：weeP26</td><td></td><td></td><td>果蝇品系；参见 Clyne 等，Genetics，2003</td></tr><tr><td>GFP检测试剂，GFP-Booster</td><td>ChromoTek</td><td>gba488-100</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>Invitrogen</td><td>10814-010</td><td></td></tr><tr><td>图像处理软件，Photoshop CS6</td><td>Adobe</td><td></td><td>www.adobe.com</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516-25ML</td><td>2-丙醇</td></tr><tr><td>方法1（RNA提取）：TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>异硫氰酸胍和苯酚单相溶液</td></tr><tr><td>方法2（RNA提取）：方法1 + TURBO DNA-free试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AM1907</td><td>TRIzol 提取后使用试剂盒去除 DNA</td></tr><tr><td>方法3（RNA提取）：Direct-zol RNA Miniprep Plus试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>R2070S</td><td>使用TRIzol提取RNA，但采用商用柱法而非相分离法。建议使用Monarch DNase I在Monarch DNase I反应缓冲液中进行DNase处理。</td></tr><tr><td>方法4（RNA提取）：RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>我们采用了提供的DNase处理方法。按照动物组织的建议，将IFM沉淀在RTL缓冲液中进行匀浆。</td></tr><tr><td>方法5（RNA提取）：ReliaPrep RNA组织微量提取系统</td><td>Promega</td><td>Z6110</td><td>我们应用了该方案以 &amp;lsquo;从纤维组织中纯化RNA&amp;rsquo;.</td></tr><tr><td>方法6（RNA提取）：Monarch总RNA小量提取试剂盒</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>T2010G</td><td>我们采用了适用于组织/白细胞的方案，并在300中进行裂解 &amp;mu;RNA保护剂L</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM12400</td><td>无RNase的微量离心管，1.5 mL</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12342108</td><td>标准载玻片，未带电，1 毫米</td></tr><tr><td>切片机刀片</td><td>PFM Medical</td><td>207500003</td><td>C35 羽毛 80 毫米</td></tr><tr><td>Monarch DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>T2004-21</td><td></td></tr><tr><td>Monarch DNase I 反应缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>T2005-21</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0480X</td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td>马腊布</td><td>1910000000</td><td>Marabu Fino 圆头 0 号画笔，或任何美术用品品牌的类似画笔</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS缓冲液（1×）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>用于配制1 L溶液的磷酸盐缓冲液片剂，pH 7.4</td></tr><tr><td>PFA PureTip 吸头</td><td>Elemental Scientific</td><td>ES-7000-0101</td><td>可选替代标准移液器吸头以减少样品损失；100 mL，0.8 mm 孔径</td></tr><tr><td>Phusion高保真聚合酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>F-530XL</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5161</td><td>通用 200 mL 吸头</td></tr><tr><td>Preomics iST 8x 试剂盒</td><td>Preomics</td><td>P.O.00001</td><td>用于质谱分析的多肽制备试剂盒</td></tr><tr><td>Q Exactive 质谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>725500</td><td>质谱分析在慕尼黑大学生物医学中心蛋白质分析单元进行</td></tr><tr><td>Qubit RNA 定量检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明-鬼笔环肽</td><td>Invitrogen，Molecular Probes</td><td>10063052</td><td></td></tr><tr><td>RNA浓度 方法1 &amp;amp; RNA 完整性检测，Bioanalyzer</td><td>安捷伦科技</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA浓度测定方法2：Nanodrop</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>RNA浓度测定方法3：Qubit 4荧光计</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>RNA Pico 芯片</td><td>安捷伦科技</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Promega</td><td>A7937</td><td></td></tr><tr><td>无RNase水，焦碳酸二乙酯（DEPC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>DEPC 处理水过夜，然后高压灭菌，以去除所有 RNase。</td></tr><tr><td>RT试剂盒#1：Super Script III反转录酶试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td>逆转录试剂盒</td></tr><tr><td>RT试剂盒 #2：LunaScript</td><td>New England Biolabs</td><td>E3010S</td><td>逆转录试剂盒</td></tr><tr><td>RT试剂盒#3：QuantiNova反转录试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>205410</td><td>逆转录试剂盒</td></tr><tr><td>封片缓冲液，Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>含 DAPI</td></tr><tr><td>统计分析软件：GraphPad Prism</td><td>GraphPad Prism</td><td></td><td>www.graphpad.com</td></tr><tr><td>统计软件：Microscoft Excel</td><td>微软</td><td></td><td>作为 Office Home 套餐的一部分购买 &amp;amp; 学生 2019</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5405000760</td><td>Eppendorf Centrifuge 5425 或同等型号离心机</td></tr><tr><td>组织/吸水纸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td>标准组织擦拭纸</td></tr><tr><td>移液管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z350796</td><td>塑料移液管</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td></td></tr><tr><td>万纳斯弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>3 mm 切割刃，尖端直径 0.05 mm，长度 8 cm</td></tr><tr><td>沃特曼滤纸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1004-070</td><td>滤纸圆片，4号，70 mm</td></tr></tbody></table>

解剖 黑腹果蝇 用于组学研究的飞行肌

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila 飞行肌是研究多种生物学过程的有力模型，这些过程包括转录调控、选择性剪接、代谢以及机械生物学，它们均影响肌肉发育和肌原纤维形成。组学数据（例如质谱或深度测序所产生的数据）可为理解这些生物学过程提供重要的机制性见解。在开展此类研究时，分析组织特异性样本有助于提高组学特征图谱的选择性和特异性。本文介绍了一种从活体蛹中解剖荧光标记飞行肌的实验方案，以获得高度富集的肌肉样本用于组学研究。我们首先描述了如何在蛹早期阶段（蛹壳形成后 [APF] &#60;48 小时）解剖飞行肌，此时肌肉可通过绿色荧光蛋白（GFP）标记进行识别。随后，我们描述了如何在蛹晚期（APF &#62;48 小时）或成虫阶段解剖肌肉，此时可在解剖显微镜下清晰分辨肌肉结构。随附的视频方案将使这些技术要求较高的解剖操作更广泛地被肌肉研究和 Drosophila 研究领域所采用。对于RNA相关应用，我们检测了在不同时间点及不同操作方法下所能提取RNA的数量和质量。我们进一步证明，Bruno1（Bru1）对于肌球蛋白重链（Mhc）剪接的时间转换是必需的，表明所获取的解剖肌肉可用于mRNA-Seq、质谱分析以及逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）等实验。该解剖方案将有助于推动组织特异性的组学分析，并可广泛应用于肌生成多个生物学方面的研究。

Drosophila 飞行肌是研究转录调控、选择性剪接、代谢以及机械生物学的有力模型。本文介绍一种从活体蛹中解剖荧光标记飞行肌的实验方案，可获得高度富集的样品，适用于蛋白质组学和深度测序分析。这些样品有助于深入理解肌肉发育的多种分子机制。

果蝇飞行肌是研究转录调控、选择性剪接、代谢及多种其他过程的有力模型。

本方案可实现对果蝇蛹发育不同时间点的绿色荧光蛋白（GFP）标记的间接飞行肌进行解剖，以评估基因和蛋白质表达的变化。通过这些技术，可获得高纯度的飞行肌样品，且RNA和蛋白质降解最小，适用于RT-PCR、蛋白质印迹或组学分析。此类特殊解剖操作需要练习和技巧，但随着经验积累，可解剖的蛹数量和样品质量均会提高。对该解剖过程进行可视化演示，对于确定如何区分飞行肌与非肌肉组织，并促进从蛹体样本中快速分离飞行肌至关重要。进行蛹期鉴定时，使用湿润的画笔将未完全发育的蛹收集并转移至直径60毫米的培养皿中，并在双目显微镜下对蛹进行性别鉴定。雄性个体可通过其体内精巢的存在来识别，精巢在不透明的蛹体中呈现为透明的球状结构。在培养皿上标记果蝇的时间、日期和基因型后，将蛹置于25至27摄氏度的培养箱中，使其发育至适当阶段。若需在48小时刚羽化后（H APF）之前进行IFM解剖，使用湿润的画笔将处于合适发育阶段的蛹转移至一个盛有约三分之二体积预冷PBS的黑色解剖皿中。在荧光解剖显微镜下，用5号镊子将其中一个蛹推至黑色解剖皿底部。调整显微镜的缩放倍数和焦距，直至能够清晰观察到蛹。用一对镊子夹住蛹的前部，用另一对镊子的单个尖端在腹部稍偏离中心、紧靠胸部后方的位置刺穿蛹体。用第一对镊子取下蛹壳的前半部分，并在胸部后方夹住暴露的蛹体，将腹部与胸部分离。接着，轻轻挤压胸部的前部，以暴露荧光标记的间接飞行肌（IFMs）。然后用镊子将剩余的尸体丢弃至培养皿的对侧，并以相同方式解剖后续的蛹。当所有蛹均完成解剖后，使用镊子收集IFM纤维，并将纤维整理成一小堆，置于黑色解剖皿底部。使用镊子将视野中的任何碎屑推出，并从样品中移除非间接飞行肌（IFM）的肌肉、脂肪、角质层或其他不需要的组织。然后，使用剪去尖端的移液器吸头将间接飞行肌（IFM）转移至含有250 µL预冷PBS的1.5 mL微量离心管中。对于48小时羽化后（H APF）的间接飞行肌（IFM）解剖，使用略微湿润的画笔将处于相应发育阶段的蛹转移至固定在显微镜载玻片上的双面胶带上。将蛹按腹面朝下、前端朝向载玻片底部的方向排成一行。当所有蛹放置完毕后，用镊子轻轻分开并打开第一个蛹壳前端气门上方的部分，然后将镊子轻轻向背侧、朝后端方向滑动，随着镊子移动切开蛹壳。将蛹从打开的蛹壳中取出，并立即转移到另一张载玻片上的PBS液滴中。当所有蛹均被分离后，使用精细剪刀将蛹的腹部从胸部切下，并将腹部推入另一堆中。当所有胸部组织均被分离后，用一张纸巾吸除大部分 PBS 液体及腹部组织堆。向剩余的胸部组织中加入一滴新鲜且预冷的 PBS，然后用剪刀从头部沿身体纵轴一次性剪开，将胸部平分为两半。当所有蛹均已解剖后，使用5号镊子选取其中一个半侧部分，将一把镊子的尖端轻轻插入间接飞行肌（IFMs）中部的上方和下方。保持第一把镊子不动，使用精细剪刀将IFM的一端从体壁和肌腱上剪下，然后将蛹旋转180度，以便将IFM的另一端从体壁和肌腱上完全剪离。用镊子将IFM肌束从胸部转移至PBS液滴边缘，利用液体表面张力使肌束固定在原位。然后，将尸体推至载玻片的另一侧，并以相同方式解剖其余的间接飞行肌（IFMs）。当所有间接飞行肌收集完毕后，使用5号镊子去除可能混入样品中的跳跃肌或角质层碎片。接着利用水的表面张力，用一对镊子轻轻夹住已解剖的间接飞行肌，并将其放入含有250 µL预冷PBS的1.5 mL微量离心管中。与野生型测序数据相比，BRUNO1 IR IFM 的 mRNA 测序数据显示基因单位水平上的表达变化。通过对分离的 IFM 进行全蛋白质组质谱分析，在蛋白质及蛋白质亚型水平上也观察到类似的调控现象。将蛋白捕获品系插入 Mhc 基因的最后一个内含子后，可在 90 小时蛹期（H APF）的 IFM 中观察到 GFP 标记蛋白的整合，表现为 M 线两侧各一个荧光点；而在腿部肌肉组织中，GFP 信号则沿肌节 M 线均匀分布。在27摄氏度条件下，使用RT-PCR检测解剖所得的间接飞行肌（IFM）时，可在蛹壳形成后30至48小时之间检测到肌球蛋白重链（Mhc）同工型由标记GFP的外显子34至37事件向未标记的外显子34至35事件的转换。根据mRNA测序数据，腿部肌肉和跳跃肌组织表达全部三种Mhc同工型，并在成熟肌肉中持续表达标记GFP的同工型。Spalt major突变体和BRUNO1 IR-IFM在发育过程中均未能关闭标记GFP的Mhc同工型的表达，导致其同工型表达谱与腿部肌肉和跳跃肌组织相似。请注意，解剖操作应在30分钟内完成，以防止RNA降解。同时，需注意避免其他细胞类型的污染。该方法可获得富含IFM的样本，适用于RT-PCR或蛋白质印迹等生物化学方法，以及质谱分析、高通量测序、染色质构象捕获和代谢组学等组学研究方法。这些解剖操作可将果蝇中强大的遗传学方法与系统水平的数据相结合，用于研究发育和基因调控的基本机制。

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