成像人类免疫学突触
2019年12月26日
该协议图像免疫突触形成和随后的极化分泌流量对免疫突触。细胞结合形成于超抗原脉冲拉吉细胞（作为抗原呈现细胞）和Jurkat克隆（作为效应帮助剂T淋巴细胞）之间。
该方法的目的是产生一个免疫突触，这是一个细胞与细胞结合的例子，由抗原呈现细胞和T-帮助淋巴细胞形成。我们的目标是记录免疫突触形成的第一阶段，并记录在T-帮助淋巴细胞中发生的贩运事件。这些最终将导致免疫突触的两极分化分泌。
此处介绍的方法涉及细胞到细胞的结合、延时采集、广场荧光显微镜以及后续的图像处理。这提高了图像的声噪比，提高了时间分辨率，并允许在新兴突触结合中同时采集多个氟化物，并减少荧光漂白。此外，该协议与端点细胞固定协议兼容，允许免疫荧光染色和分析。
该协议还与激光扫描荧光显微镜和其他最先进的显微镜技术兼容。展示这个程序的将是安娜·贝洛，一个研究生，亚历杭德罗·加里多，一个技术员，和索朗格·莫雷诺，一个研究生。要开始此过程，在 8 个微井室滑梯的每个井中加入 150 微升的纤维素，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟到 1 小时。
孵育期后，用200微升PVS清洗每井，轻轻摇动两分钟。再次重复此洗涤，将第二次洗涤留在井中。将 Raji 细胞的汇合预培养的 10 毫升转移到 15 毫升 V 底管。
在300倍G下离心，在室温下离心5分钟。丢弃上一提液，以每毫升100万细胞的浓度，轻轻地将细胞颗粒重新在温暖、完整的培养中等中。要给Raji细胞贴上标签，请将培养基中所需数量的细胞转移到两毫升管。
对于八个微井室滑动，总共需要1.6毫升的细胞悬浮液。将细胞跟踪器蓝色添加到 10 微摩尔的最终浓度中。重新悬浮细胞跟踪器蓝色染色细胞，将细胞悬浮液的200微升转移到准备好的纤维素涂层腔室幻灯片的每个井中。
用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵化室内滑动，30分钟到1小时。之后，轻轻摇动显微镜上的腔室，以确保Raji细胞得到粘附。用温暖、完整的细胞培养培养培养器仔细清洗每个井，以消除多余的细胞跟踪器蓝色。
确保 Raji 细胞粘附在板的底部，并且它们彼此之间显示间隙，并且它们不汇合。50-60%的细胞汇合是适当的。首先，将葡萄球菌肠毒素E以每毫升1微克的浓度添加到每口井中。
确保Raji细胞用超抗原脉冲，否则来自Jurkat细胞的T细胞受体将不能识别SCE，突触不会形成。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵化室内滑梯，至少30分钟。接下来，以每毫米100万至200万个细胞的浓度获得以前生长的Jurkat细胞培养。
在相对比显微镜下观察细胞，然后将细胞转移到15毫升V底管。在300倍G下离心，在室温下离心5分钟。丢弃上一直液，以每毫升100万个细胞的浓度轻轻地在温暖、完整的培养培养中重新暂停细胞。
然后将培养中的Jurkat细胞保持在37摄氏度，并吸收5%的二氧化碳，直到准备好使用。从培养箱中检索包含细胞跟踪器蓝色标记的葡萄球菌肠毒素 E 脉冲粘附的 Raji 细胞的腔室幻灯片。小心地从每一个井中吸出培养介质，将移液器放在井的一角。
立即用细胞培养培养培养的200微升的重新释放的Jurkat细胞取代该培养物。如果正在执行时间推移，请快速进入显微镜。在显微镜分期侍者上找到室滑梯，并选择一些合适的字段。
在成像前准备显微镜和孵化室。将Jurkat细胞添加到每个含有Raji细胞的井中后，快速找到预热显微镜上微井室幻灯片，并选择一些XY位置。如果只计划进行终点实验，在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵化腔室，一到两个小时。
在培养期之后，检查偶联形成，然后修复文本协议中概述的偶联体。要修复电池，请添加不带 FCS 的暖 RPMI 并轻轻摇动。吸气RMPI，并添加200微升的PFA或预冷丙酮到每一个井。
在室温下或冰上孵育腔室滑梯20分钟。然后用 PVS 洗两次每孔，并加入 200 微升淬火溶液。在这项研究中，Jurkat-Raji免疫突触结合产生，免疫突触形成的早期阶段被正确成像。
此策略诱导免疫突触的形成，同时执行时间推移成像。此处显示了从该技术获得的代表突触 Jurkat-Raji 结合，包括传输通道的图像、细胞跟踪器蓝色通道以及这两个通道的合并。可以看到一些突触结合物，包括那些只由一个Jurkat细胞和几个Raji细胞组成，这是复杂的结合物。
细胞浓度的降低将绕过复杂细胞结合的形成，但可能无法提供足够的细胞结合，以便随后分析极化交通，进而减少发现和成像新兴突触结合的机会。使用宽场光学选项和适当的光学参数，使用适当的去卷积软件执行 GFP-CD63 荧光通道图像的去卷积。此除算通道随后合并到单元格跟踪器蓝色宽通道。
信噪比和锐度都有了提高。此处显示了固定免疫突触结合的代表性 Z 堆栈。使用 phaloidin 进行免疫荧光，以可视化 F-actin，抗 CD63 可视化 MVB，防伽马-图布林可视化 MTOC，而细胞跟踪器蓝色标记 Raji 细胞。
Jurkat 细胞的可选转换将允许在活细胞中对分泌颗粒的流量进行可视化。例如，当表示 GFP-CD63 时，可以记录 GFP-CD63 装饰囊泡的运动。该协议与端点固定协议兼容，允许进一步的免疫荧光染色协议和分析。
生产力实验模型的存在，可以简化免疫突触的成像，但这些模型不模仿抗原演示细胞的复杂和不规则的表面，这些表面可能在免疫突触上产生非生理相互作用。此处描述的方法适合在免疫突触中重现和确认一些生物复杂性。Superantigen 是一种危险的毒素，所以请务必戴上手套，将用过的尖端掉在危险盒上。
概述
该协议描绘了免疫学突触的形成和朝向它们的极化分泌交通。它涉及超抗原脉冲的Raji细胞和Jurkat T辅助淋巴细胞之间的细胞结合物。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 显微镜技术
背景
- 免疫学突触对T细胞活化至关重要。
- 了解突触形成可以提供对免疫反应的见解。
- 时间跃迁成像允许观察动态细胞过程。
- 荧光显微镜增强了细胞相互作用的可视化。
研究目的
- 生成和成像免疫学突触。
- 观察T辅助淋巴细胞中的交通事件。
- 分析免疫突触处的极化分泌。
使用的方法
- Raji和Jurkat细胞的细胞间结合。
- 使用广视野荧光显微镜进行时间跃迁采集。
- 图像处理以提高信噪比。
- 与免疫荧光染色和激光扫描显微镜兼容。
主要结果
- 成功形成Jurkat-Raji免疫突触结合物。
- 免疫学突触形成早期阶段的成像。
- 极化分泌事件的演示。
- 获得了突触结合物的代表性图像。
结论
- 该协议有效地可视化了免疫学突触动态。
- 时间跃迁成像为免疫细胞相互作用提供了宝贵的见解。
- 未来的研究可以利用这种方法进行进一步的免疫学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Imaging the immunological synapse provides a physiologically relevant model for studying T-cell activation mechanisms, which is critical for immunotherapeutic target validation. This approach enables mechanistic de-risking by visualizing early signaling events and secretory trafficking in a disease-relevant system. The method supports predictive confidence in lead identification by linking molecular interactions to functional outcomes in immune cell conjugation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing antigen-presenting cell and T-helper lymphocyte conjugate formation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of immunological synapse interfaces and early trafficking events.
- Predictive Value: Facilitates target validation by correlating molecular engagement with functional secretory polarization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated biological systems for downstream assay standardization using time-lapse wide-field fluorescence microscopy.
- Operational Value: Improves signal-to-noise ratio and temporal resolution, enabling synchronized multi-fluorochrome acquisition for quantitative readouts.
- Assay Readiness: Compatible with endpoint fixation and immunofluorescence staining, supporting scalable screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses a disease-relevant system that emulates the complex, irregular surface of antigen-presenting cells, promoting physiological interactions.
- Preclinical Model: Supports risk-adjusted advancement decisions by imaging polarized secretion events linked to immune effector function.
- Mechanistic De-risking: Avoids non-physiological simplifications by preserving biological complexity at the immunological synapse.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct visualization of immune synapse formation and trafficking.
- Screening: Enables assay readiness via improved signal-to-noise ratio, temporal resolution, and multiplexed fluorochrome acquisition.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements through image processing and deconvolution of trafficking events.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling physiological antigen-presenting cell surfaces and immune conjugate formation.
- Enterprise Reuse: Compatible with multiple microscopy platforms, allowing reuse across immunology and cell biology discovery teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through visualization of early immunological synapse dynamics and secretory trafficking.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via compatible fixation, imaging, and image processing protocols.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in T-cell activation pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on synapse formation and polarized secretion efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence microscopy, and image deconvolution for accurate synapse visualization.
- Needs wide-field fluorescence microscopy with environmental control and deconvolution software for signal-to-noise optimization.
- Demands cross-team standardization in cell preparation, superantigen pulsing, and conjugate formation timing.
- Involves adaptation considerations for different antigen-presenting cell and T-cell models while maintaining physiological relevance.
- Limited to synapses oriented at 90 degrees to the focal plane, which may restrict sampling but ensures accurate boundary analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:26
Adhesion of Raji Cells to the Chamber Slides and 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC, Cell Tracker Blue) Labeling
3:31
Pulse of CMAC labeled Raji Cells with Staphylococcal Enterotoxin E and Preparation of Jurkat Cells
4:51
Co-seeding of Raji and Jurkat Cells and Time Lapse Imaging of Emerging Synaptic Conjugates
5:51
End Point Formation of Synaptic Conjugates and Fixation
6:38
Results: Imaging the Human Immunological Synapse
8:28
Conclusion
