成像人类免疫突触

该方法的目的是生成一个免疫突触，即由抗原呈递细胞与辅助性T淋巴细胞形成的细胞间连接的示例。我们的目标是记录免疫突触形成的初始阶段，并观察辅助性T淋巴细胞中发生的运输事件。这些过程最终将导致免疫突触处的极化分泌。

本文所述方法涉及细胞间接合、时间延时采集、宽场荧光显微镜观察以及后续的图像处理。该方法可提高图像的信噪比，增强时间分辨率，实现对新生突触接合体中多种荧光染料的同时采集，并减少荧光淬灭。此外，该方案与终点细胞固定方案兼容，可进一步进行免疫荧光染色与分析。

本方案还适用于激光扫描荧光显微镜及其他先进的显微技术。演示该实验步骤的是研究生安娜·贝洛（Ana Bello）、技术员亚历杭德罗·加里多（Alejandro Garrido）以及研究生索兰赫·莫雷诺（Solange Moreno）。开始此操作时，向八孔细胞培养板的每个孔中加入150 µL纤连蛋白，于37°C孵育30分钟至1小时。

孵育结束后，吸除纤连蛋白溶液，每孔加入200微升PBS，轻轻振荡洗涤2分钟。重复洗涤一次，并将第二次洗涤液保留在孔中。将10毫升融合生长的Raji细胞预培养物转移至15毫升V型底离心管中。

在室温下以300 × g离心五分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀物轻轻重悬于预热的完全培养基中，调整细胞浓度至每毫升含100万个细胞。为标记Raji细胞，将所需数量的细胞连同培养基转移至一个2毫升离心管中。

对于八孔微量培养板，共需要1.6毫升细胞悬液。加入细胞示踪染料蓝色（cell tracker blue），使其终浓度为10微摩尔。重悬经细胞示踪染料蓝色标记的细胞，并将200微升细胞悬液转移至已预先包被纤维连接蛋白的八孔板的每个孔中。

将腔室载玻片置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟至1小时。孵育结束后，轻轻晃动显微镜上的腔室载玻片，以确保Raji细胞已贴壁。用温热的完全细胞培养基小心洗涤每个孔，以去除过量的细胞追踪蓝色染料。

确保Raji细胞已贴附于培养板底部，细胞之间存在间隙，未达到融合状态。细胞融合度以50-60%为宜。首先，向每孔加入浓度为1 µg/mL的金黄色葡萄球菌肠毒素E。

确保Raji细胞已与超抗原孵育，否则Jurkat细胞的T细胞受体将无法识别SCE，突触也无法形成。将腔室载玻片在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育至少30分钟。接下来，取之前培养的Jurkat细胞，浓度为每毫升100万至200万个细胞。

在相差显微镜下观察细胞，然后将细胞转移至15毫升V型底离心管中。在室温下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，并在温热的完全培养基中轻轻重悬细胞，细胞浓度为每毫升100万个细胞。

随后将Jurkat细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养至可使用状态。从培养箱中取出含有经细胞示踪蓝色标记的肠毒素E脉冲处理并贴附的Raji细胞的腔室载玻片。用移液器从每个孔的一角开始，逐孔小心吸除培养基。

立即用 200 微升细胞培养基中重悬的 Jurkat 细胞替换培养基。如果进行时间序列成像，请迅速转移至显微镜。将带孔载玻片置于显微镜载物台支架上，并选择若干合适的视野。

在成像前准备好显微镜和培养箱。将Jurkat细胞加入含有Raji细胞的各孔后，迅速将微孔腔室载玻片放置于预热的显微镜载物台培养箱中，并选择若干XY位置。如果仅计划进行终点实验，则将腔室载玻片在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1至2小时。

培养一段时间后，检查偶联物的形成情况，随后按照文本方案中所述固定偶联物。固定细胞时，加入不含FCS的温热RPMI并轻轻振荡。吸去RPMI，每孔加入200 µL的PFA或预冷的丙酮。

将腔室载玻片在室温或冰上孵育20分钟。随后用PVS洗涤每个孔两次，并加入200 µL封闭溶液。在本研究中，生成了Jurkat-Raji免疫突触复合物，并对免疫突触形成的早期阶段进行了适当的成像。

该策略在诱导免疫突触形成的同时进行时间推移成像。此处展示了通过该技术获得的代表性 Jurkat-Raji 免疫突触结合物，包括透射通道图像、细胞追踪蓝染通道图像，以及这两个通道的合并图像。可以观察到一些突触结合物，其中包括仅由一个 Jurkat 细胞和多个 Raji 细胞组成的复杂结合物。

降低细胞浓度可避免形成复杂的细胞连接体，但可能导致用于后续极化运输分析的细胞连接体数量不足，从而降低发现和成像新生突触连接体的概率。使用适当的去卷积软件，选择宽场光学模式及正确的光学参数，对GFP-CD63荧光通道图像进行去卷积处理。随后，将去卷积后的通道与细胞追踪蓝色宽谱通道合并。

信号噪声比和图像清晰度均有所提升。此处展示的是一个固定的免疫突触结合体的代表性Z轴层扫图像。免疫荧光染色使用鬼笔环肽标记F-肌动蛋白，抗CD63抗体标记多泡体（MVB），抗γ-微管蛋白抗体标记微管组织中心（MTOC），同时使用细胞追踪蓝色荧光染料标记Raji细胞。

对Jurkat细胞进行可选的透化处理，可实现活细胞中分泌颗粒运输过程的可视化。例如，当表达GFP-CD63时，可记录由GFP-CD63标记的囊泡的运动情况。该方案与终点固定方案兼容，可进一步进行免疫荧光染色及相关分析。

现有的高效实验模型可能简化了免疫突触的成像过程，但这些模型无法模拟抗原呈递细胞上复杂且不规则的表面结构，因而可能在免疫突触处引发非生理性的相互作用。本文所述的方法适用于重现并验证免疫突触中发生的一些生物学复杂性。超抗原是一种危险毒素，因此请务必佩戴手套，并将使用过的枪头丢弃至有害废物盒中。