Name: 脱氧核糖核酸介导基板无机结构纳米图案用于传感应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学习利用DNA折纸技术与自上而下纳米制造方法相结合，在基底上并行制造具有亚10纳米特征尺寸的无机纳米结构。该技术可一次性创建数十亿个精确纳米结构，适用于表面增强拉曼光谱等传感应用。

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本工作由芬兰科学院（项目编号：286845、308578、303804、267497）、Jane 和 Aatos Erkko 基金会以及 Sigrid Jusélius 基金会资助。本研究在芬兰科学院卓越研究中心计划（2014–2019）下开展。我们感谢阿尔托大学生物经济设施、OtaNano – 纳米显微中心（Aalto-NMC）和 Micronova 纳米加工中心提供的设施与技术支持。

1. DNA折纸结构的设计
注意：本方案中描述了一种使用二维（2D）领结形DNA折纸结构进行纳米图案化的工艺（图1）34。如需设计新的DNA折纸结构形状，请遵循以下指南：
<ol>
	<li>使用 caDNAno 设计所需的 DNA 折纸结构形状及相应的引物链序列35。为生成平坦的单层折纸结构，采用 caDNAno 的方形晶格选项，并通过在设计中跳过部分碱基手动调整交叉点间距（见图1及补充 caDNAno 文件），以消除由方形晶格堆积引起的结构扭曲36,37。</li>
	<li>用含有 poly-T（8 nt）突出端的链延伸每条 DNA 螺旋的末端；这将防止结构通过平末端碱基堆积相互作用发生多聚化（图1及补充 caDNAno 文件）。</li>
	<li>对设计进行计算分析。CanDo38,39 可用于预测 DNA 折纸的三维（3D）形状和结构刚性。CanDo 还可用于迭代优化校正扭曲所需的碱基跳过次数，并相应调整设计。</li>
	<li>在 caDNAno 中选择合适的支架链长度，并生成折叠结构所需的引物链。对于领结形结构，使用长度为 7249 nt 的 M13mp18 支架链和 205 条独特的引物链（见补充 caDNAno 文件）。 
	注意：还有其他可用于设计 DNA 折纸结构的计算工具40,41,42,43。根据所选工具/软件的不同，也可使用其他模拟工具43,44。</li>
</ol>
2. DNA 折纸的组装
<ol>
	<li>通过混合构建蝶形结构所需的所有寡核苷酸（共205条支架链）等量混合物来制备支架链母液34。所有寡核苷酸的初始浓度应相同（例如，在无RNase的水中为100 µM）。</li>
	<li>在0.2 mL PCR管中配制100 μL的DNA折纸折叠反应体系，其中包含20 μL M13mp18骨架链（p7249型，浓度为100 nM）、40 μL支架链母液（每条链浓度为500 nM，相对于骨架链约为10倍摩尔过量）以及40 μL 2.5倍折叠缓冲液（FOB）。FOB包含添加了MgCl2的Tris-乙酸-乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（TAE）。FOB组分浓度详见表1。</li>
	<li>将反应体系在热循环仪中从90 °C退火至27 °C。采用表2中所示的热折叠程序。</li>
</ol>
3. DNA折纸结构的纯化
注意：可使用非破坏性的聚乙二醇（PEG）纯化方法从DNA折纸溶液中去除过量的连接链。该方案改编自 Stahl 等人45。
<ol>
	<li>将200 μL组装好的DNA折纸结构用600 μL的1x FOB（见表1）稀释，得到初始体积为800 μL的溶液。</li>
	<li>将稀释后的DNA折纸溶液与800 μL PEG沉淀缓冲液（15% PEG 8000 (w/v)、1x TAE、505 mM NaCl）按1:1比例混合，并通过反复吹打充分混匀。</li>
	<li>在室温下以14,000 x g 离心30分钟。</li>
	<li>使用移液器小心移除上清液。</li>
	<li>加入200 μL的1x FOB，并通过移液操作轻轻混匀。也可根据需要加入不同体积的1x FOB，以获得所需的DNA折纸结构浓度。</li>
	<li>为重新溶解DNA折纸结构（管底可见微小透明沉淀），将经PEG纯化的DNA折纸结构在室温下孵育过夜。</li>
	<li>通过紫外/可见分光光度计在260 nm波长处测定吸光度，估算PEG纯化后的DNA折纸结构浓度。计算时采用比尔-朗伯定律及消光系数1.1∙108 M-1 cm-16。PEG纯化后典型的DNA折纸结构浓度为15–20 nM。</li>
	<li>将经PEG纯化的DNA折纸结构在4 °C下保存。DNA折纸结构通常可稳定数月，因此可制备大量储备液以供后续使用。 
	注意：过量的短链DNA也可采用其他纯化技术去除46，例如离心过滤47、速率区带离心48和琼脂糖凝胶提取49。DNA折纸结构在多种缓冲溶液中均具有稳定性50，如有需要，可在PEG纯化后通过离心过滤更换保存介质51。</li>
</ol>
4. 琼脂糖凝胶电泳
注意：可使用琼脂糖凝胶电泳验证折叠的质量以及过量支架链的去除情况。
<ol>
	<li>取1 g琼脂糖加入45 mL 1×TAE缓冲液中，置于锥形瓶内，配制成约2%（w/v）的琼脂糖凝胶。将混合物在微波炉中加热，直至琼脂糖完全溶解，形成澄清溶液。</li>
	<li>将溶液置于流动水下冷却，至锥形瓶触手温热（50–60 °C）即可。</li>
	<li>向溶液中加入5 mL 110 mM MgCl2和40 µL溴化乙锭溶液（0.58 mg mL-1），轻轻振荡混匀。 
	注意：溴化乙锭为潜在致癌物，操作时应格外小心。</li>
	<li>安装好凝胶制备模具，将液态琼脂糖倒入模具中，在室温下静置至少30分钟，使其充分凝固。</li>
	<li>将凝胶从制备模具中取出，放入凝胶电泳槽中，并加入电泳运行缓冲液（含11 mM MgCl2的1×TAE缓冲液）至覆盖凝胶表面。</li>
	<li>每5 µL样品溶液中加入1 µL 6×凝胶上样染料，充分混匀。用移液器小心将适量样品溶液分别加入凝胶的加样孔中。</li>
	<li>以95 V恒定电压进行电泳，运行时间为45分钟。电泳过程中将凝胶电泳槽置于冰浴中，以防止凝胶因发热而受损。</li>
	<li>使用凝胶成像系统在紫外光下观察并成像凝胶结果（图2A）。</li>
</ol>
5. 底物制备（图3A）
注意：除二氧化硅（SiO2）生长步骤（步骤9）外，以下所有步骤均在洁净室内进行。如果该清洗过程不足以完全去除基底上的残留物，可用标准的 piranha 溶液清洗步骤替代。
<ol>
	<li>从晶圆上切割出 7 mm × 7 mm 的芯片，用作基底。对于氮化硅（SiN）材料，可使用硅片切割机、金刚石划片笔或其他类似工具。切割蓝宝石（Al2O3）则需要专用工具或锯片。芯片尺寸无需完全精确。</li>
	<li>清洗芯片。
	<ol>
		<li>将切割好的芯片浸入盛有热丙酮的玻璃容器中（丙酮加热至 52 °C），保持加热至少 15 分钟。根据基底初始洁净程度，可能需要更长时间。</li>
		<li>在热丙酮浴中，用棉签轻轻擦拭芯片表面，以机械方式去除任何残留薄膜。</li>
		<li>使用镊子将芯片从热丙酮中取出，并用洗瓶以室温丙酮冲洗芯片。</li>
		<li>将芯片浸入盛有异丙醇的玻璃容器中，超声处理 2 分钟。</li>
		<li>用镊子将芯片从异丙醇中取出，并立即使用氮气流彻底吹干。操作时仅接触芯片的侧面和边缘，因为被镊子夹持的区域无法充分干燥，可能导致残留物或其他污染。为获得最佳效果，应使用尽可能高的氮气流速，并使芯片表面与气流方向平行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将芯片存放于洁净室内的带盖容器中，以备后续使用。</li>
</ol>
6. 非晶硅（a-Si）层的等离子体增强化学气相沉积（PECVD）（图3B）
<ol>
	<li>将芯片放入等离子体增强化学气相沉积（PECVD）设备中。</li>
	<li>设置沉积参数，以生长约 50 nm 的非晶硅（a-Si）。具体参数因设备型号和校准情况而异。此处所用参数详见表3。运行 a-Si 沉积程序以生长该层。</li>
	<li>处理完成后，将芯片置于洁净室标准条件下，并存放在带盖容器中。</li>
</ol>
7. 非晶硅层的氧气等离子体处理（图3B）
注意：此步骤将使底物表面略带负电荷并具有亲水性，从而在额外镁离子的辅助下，使DNA折纸结构能够有效地吸附到表面。
<ol>
	<li>将芯片放入反应离子刻蚀（RIE）设备中。</li>
	<li>设置刻蚀参数以产生氧等离子体。具体参数设置因设备型号和校准情况而异。此处所用参数见表3。运行氧等离子体处理程序。</li>
	<li>应立即进行下一步操作，因为处理效果会迅速减弱。通常，基底应在等离子体处理后30分钟内使用。</li>
</ol>
8. DNA折纸结构的沉积（图3C）
<ol>
	<li>通过将 5 µL 折叠/纯化的 DNA 折纸溶液（约 20 nM）与 4 µL 1x FOB 和 1 µL 1 M MgCl2 混合，制备用于沉积的 DNA 折纸混合液。所得溶液含有约 10 nM 的 DNA 折纸结构和约 100 mM 的 Mg2+。</li>
	<li>将 10 µL DNA 折纸混合液滴加到经氧等离子体处理的芯片表面，室温下加盖孵育 5 分钟。加盖可防止意外干燥，并有助于后续去除多余的盐分和未吸附的 DNA 折纸结构。</li>
	<li>孵育后，先用移液器将 100 µL 去离子水（例如 MilliQ 水）滴加到芯片上进行清洗。用移液器将水在芯片表面来回冲洗数次，注意避免触碰芯片中心区域。随后用移液器吸走大部分水分，使仅有正确吸附的折纸结构保留在表面。</li>
	<li>重复此清洗步骤（步骤 8.3）3 至 4 次。</li>
	<li>清洗完成后，立即用氮气流吹干样品。操作方式与基底制备中的干燥步骤（步骤 5）相同。应尽可能彻底地干燥样品。 
	注意：沉积结构的密度，即金属纳米结构的密度，可通过调节沉积溶液中 DNA 折纸和 Mg2+ 的浓度进行调控。较高的 Mg2+ 浓度可增强 DNA 折纸的吸附，从而提高密度，但过高的浓度最终会导致 DNA 折纸结构发生聚集。因此，应优先调节 DNA 折纸的浓度。</li>
</ol>
9. 二氧化硅的生长2 口罩图3D)
注意：此步骤可在洁净室外进行。以下版本将产生负性显影图案，但也可修改工艺以获得正性显影图案。SiO2 生长工艺改编自 Surwade 等人52，由作者进一步发展53，并最终针对本实验方案进行了优化。
<ol>
	<li>取一个可密封的干燥器（1.5 L）、一个可放入干燥器内的培养皿（可选），以及一个可在干燥器内用作平台的带孔板。</li>
	<li>取100 g硅胶，与30 g蒸馏水在培养皿中或直接在干燥器内混合。建议至少提前24小时进行此步骤，以使硅胶充分稳定。 
	注意：此步骤用于控制干燥器内的湿度，从而调控SiO2薄膜的生长速率和形貌。湿度越高，生长速率越快，结构越粗糙。也可将硅胶置于气候试验箱中进行固化。</li>
	<li>将硅胶放入干燥器中，并用带孔板将其与上方区域隔开。</li>
	<li>将吸附有DNA折纸结构的芯片、一个敞口的（新鲜的）10 mL原硅酸四乙酯（TEOS）试剂瓶，以及另一个10 mL 25%氢氧化铵（NH4OH）试剂瓶放置于干燥器内的带孔平台上。将试剂瓶置于样品附近且相对的两侧。建议使用烧瓶塞或类似的扁平底座，将芯片略微抬高，使其脱离平台表面。 
	警告：NH4OH和TEOS在皮肤接触时有害，其蒸气可刺激眼睛和呼吸系统。操作时应在通风良好的环境中进行，并佩戴防护手套、护目镜及防护服。</li>
	<li>密封干燥器，在室温下孵育20小时。此过程将在DNA折纸结构未覆盖的区域生长SiO2薄膜，从而形成具有DNA折纸形状孔洞的10–20 nm图案化掩膜（图4）。</li>
	<li>孵育结束后从干燥器中取出样品，存放在加盖容器中。此步骤可暂停后续处理。废弃使用过的TEOS和NH4OH试剂。若在使用间隔期间将硅胶批次密封保存于干燥器内，并在2–3周内使用，该批次硅胶可重复使用2–3次。</li>
</ol>
10. 二氧化硅（SiO2）和非晶硅（a-Si）的反应离子刻蚀（RIE）（图3E）
<ol>
	<li>将芯片放入反应离子刻蚀（RIE）设备中。</li>
	<li>设置刻蚀参数，仅刻蚀 2–5 nm 的 SiO2，以暴露 SiO2 掩模孔下方的非晶硅（a-Si）层。具体参数需根据所用设备通过实验确定。此处使用的参数见表3。运行各向异性 SiO2 等离子体刻蚀程序。</li>
	<li>设置刻蚀参数，以完全穿透 50 nm 的 a-Si 层。此处使用的参数同样见表3。运行各向同性 a-Si 等离子体刻蚀程序。</li>
	<li>从 RIE 设备中取出样品，并加盖保存。此步骤后可再次暂停后续处理。</li>
</ol>
11. 金属的物理气相沉积（PVD）（图3F）
<ol>
	<li>将芯片装入物理气相沉积（PVD）仪器的蒸发腔室中。</li>
	<li>选择靶材金属。首先选择一种粘附层金属，此处使用 2 nm 厚的铬（Cr）。</li>
	<li>为靶材材料和目标厚度设置厚度控制程序。控制方法取决于具体仪器，此处采用石英晶体微天平（QCM）进行监测。测量得到的厚度需根据靶材材料的密度和 Z 因子进行调整，并通过针对该设备及每种靶材材料实验测定的工具因子（tooling factor）进行校正。</li>
	<li>启动电子束，调节束流方向对准靶材，逐步增加束流，直至沉积速率达到 0.05 nm/s。持续蒸发，直至最终厚度达到 2 nm。</li>
	<li>在不放气或中断工艺流程的情况下，选择第二种靶材金属（例如金）。若中途放气或中断，会导致粘附层金属开始氧化，从而降低其作为粘附层的有效性。</li>
	<li>重复步骤 11.3 至 11.4，继续蒸发直至厚度达到 20 nm。这样即可通过 SiO2 掩模上的孔洞形成总高度为 22 nm 的 DNA 折纸形状金属结构。</li>
	<li>对腔室放气并取出样品。</li>
	<li>若将样品覆盖保存，此处可暂停后续处理流程。</li>
</ol>
12. 使用氢氟酸（HF）进行剥离（图3G）
<ol>
	<li>将50%的氢氟酸（HF）基蚀刻液倒入合适的塑料容器中。混合液中不得使用盐酸（HCl），因为HCl会腐蚀样品中的铬（Cr）层。 
	警告：氢氟酸（HF）具有极强腐蚀性，接触皮肤或吸入后会引起严重刺激和灼伤，甚至可能致命。仅可在专用通风橱或通风良好的湿法操作台中使用，并穿戴防护围裙、耐化学腐蚀手套和面罩，或采取其他完整的化学防护措施。</li>
	<li>将样品浸入氢氟酸基蚀刻液中，并用塑料镊子轻轻搅拌。</li>
	<li>等待二氧化硅（SiO2）层完全被蚀刻，金属层随之脱落。蚀刻时间会因掩模孔密度的不同而有明显差异：孔越多，蚀刻速度越快。若金属层难以剥离，可进行5至10秒的短暂超声处理。</li>
	<li>金属薄膜脱落后，用双蒸水和异丙醇冲洗样品。</li>
	<li>冲洗后，用氮气流吹干样品，操作方式与基底制备步骤（步骤5）中的说明相同。避免镊子接触芯片中心区域，以免破坏已形成的纳米结构。 
	注：样品可在此步骤暂存，后续处理可暂停。</li>
</ol>
13. 剩余非晶硅的反应离子刻蚀（RIE）（图3H）
<ol>
	<li>将芯片放入反应离子刻蚀（RIE）设备中。</li>
	<li>设置刻蚀参数，以彻底去除全部50 nm的非晶硅（a-Si）。参数可与步骤10相同，但可略微延长刻蚀时间（40 s），以确保完全去除所有a-Si。具体参数见表3。&#160;运行各向同性的a-Si等离子体刻蚀程序，以去除残留的a-Si。</li>
	<li>从RIE设备中取出样品，并加盖保存。至此完成样品处理。</li>
</ol>
14. 原子力显微镜（AFM）
注意：原子力显微镜和扫描电子显微镜可用于监测薄膜生长与图案化的成功情况，以及成像折叠的DNA折纸结构图2B，C）。如果以下样品制备步骤可跳过&#160; 对第5至13步处理后的样品进行成像。
<ol>
	<li>AFM 样品制备
	<ol>
		<li>为了成像折叠的 DNA 折纸结构，取一片云母基底芯片。</li>
		<li>使用粘合剂将云母芯片固定在玻璃显微镜载玻片上。</li>
		<li>通过将约 20 nM 的 DNA 折纸原液用 1x FOB&#160;稀释 50 倍，配制 10 µL 的 DNA 折纸溶液，终浓度约为 0.4 nM。稀释的目的是防止基底表面过于密集。</li>
		<li>用弱粘性胶带剥离云母片的顶层，以获得新鲜解理且带电的表面。</li>
		<li>将稀释后的 DNA 折纸溶液滴加到新鲜解理的云母表面，并在室温下加盖孵育 1 分钟。</li>
		<li>孵育后，使用移液器以 100 µL 去离子水洗涤表面 3–4 次。此步骤可使仅正确吸附的折纸结构保留在表面。</li>
		<li>在云母表面滴加 100 µL 去离子水。</li>
		<li>将显微镜载玻片倾斜并快速轻敲桌面，以去除大部分液体。</li>
		<li>重复此洗涤步骤 3–4 次。</li>
		<li>洗涤完成后立即用氮气流彻底吹干样品。样品即可用于 AFM 成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 DNA 折纸样品或处理好的芯片放入原子力显微镜（AFM）中并进行扫描。扫描尺寸为 1–10 µm 时，可清晰分辨结构。</li>
</ol>
15. 扫描电子显微镜（SEM）
<ol>
	<li>将样品放入扫描电镜（SEM）中。处理好的芯片可直接使用（无需进一步的样品制备）。</li>
	<li>选择加速电压。由于样品基底（Al2O3 或 SiN）为绝缘体，应使用较低电压（5–10 kV）以减少电荷积累效应。</li>
	<li>扫描任意感兴趣的区域。尽量缩短扫描时间，以减少电荷积累并避免污染物沉积。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方案在所制备纳米结构的形状方面提供了极大的自由度和精确性。通过改变DNA折纸的设计，可以控制金属纳米结构的形状。金属结构最终的精确形状还由掩模生长步骤（步骤9）决定，在较小程度上也受掩模刻蚀步骤（步骤10）的影响（如果该刻蚀不具备各向异性）。如果掩模生长时间足够延长，掩模中的孔洞将开始逐渐闭合。这一现象可用于省略某些结构中最细小的特征，并调控间隙尺寸，正如Shen等人34在领结形折纸分离三角形结构中所展示的那样（图5B）。相反，通过缩短氧化层生长时间，可以更好地保留较细的结构形貌。这意味着不仅可以借助改变所用折纸设计来调控图6中展示的光学特性，还可以通过调节SiO2薄膜的生长过程实现进一步优化。

如果掩模厚度发生显著变化，则该变化也必须在SiO中予以体现2 RIE 步骤。仅残留极薄的 SiO 层2 应进行刻蚀（2-5 nm），以刚好穿透掩模上的孔洞。这是整个流程中最敏感且最关键的步骤。由于刻蚀时间极短，仅为10–20秒，因此在使用新设备首次操作时，必须通过实验确定精确的参数设置。此要求同样适用于步骤10.4，因为某些SiO₂2 在非晶硅刻蚀过程中，SiO 的刻蚀程度也同时被影响。2 由所采用的非晶硅（a-Si）刻蚀参数、设备乃至单台设备的校准差异决定。需注意避免将整个SiO完全刻蚀掉2 在上述两个过程中，该层。

另一个敏感的步骤是 SiO2 的生长。生长过程依赖于反应室内的湿度以及所用 TEOS 的当前活性。TEOS 会因从空气中吸附水分而降解，导致其随时间推移效果降低。即使妥善储存，该化学物质在数月内也可能表现出明显更慢且更难控制的生长速率34。如果生成的 SiO2 层比预期更薄，则可能表明 TEOS 存在问题，而非反应室湿度问题。虽然较低的湿度同样可能导致生长速率降低和薄膜变薄，但所得薄膜应比正常情况更光滑。相反，若薄膜呈现粗晶粒且表面粗糙，则表明湿度过高。 

也可以在任何其他自由选择的基底上执行此方案，但需满足两个条件：必须能够耐受氢氟酸刻蚀（步骤12）以及等离子体增强化学气相沉积（PECVD）的200–300 °C温度（步骤6）。如果使用更敏感的基底，PECVD沉积非晶硅的温度可安全降低至100 °C，但如果严格按照本方案描述操作，则无法避免使用氢氟酸。若要避免使用氢氟酸，需引入额外的牺牲层。若取消氢氟酸刻蚀的要求，该方案将可适用于更广泛的基底材料和金属。

由于本方案包含常用的成熟微纳加工工艺，因此可与其他多种微加工方案结合，适用于需要小尺寸特征和复杂金属结构的场景。在不久的将来，特别是随着低成本DNA折纸大规模生产的实现31，该方法有望推动基于界面的纳米光子学和等离激元学55领域的通用化应用和高通量纳米图案化发展。

在过去十年中，结构DNA纳米技术迅速发展1,2，而该领域最具影响力的发展无疑是DNA折纸术的发明3,4。DNA折纸技术能够以精确的结构特征构建几乎任意的纳米形状3,4。这一强大方法可用于其他纳米物体的（亚）纳米级精度空间排列与固定，例如碳纳米管5、金属纳米颗粒6,7,8,9、酶/蛋白质10,11,12,13以及治疗材料14,15,16,17。重要的是，这些结构不仅限于静态形态，还可以被编程以实现动态行为18,19。DNA折纸的应用极为广泛，涵盖从药物递送20,21,22到分子电子学/等离激元学5,23,24,25，以及从材料科学26,27到新型成像与校准技术28等多个领域。

除了上述应用之外，DNA折纸结构的极高空间分辨率还可用于纳米图案化和精细的纳米级光刻29,30。本实验方案描述了一种利用DNA折纸模板在基底上制备离散且精确的无机纳米结构的光刻方法。这些模板可高效地大量制备出多种不同形状31，并能轻松地大规模沉积到选定的基底上32。这些特性使得该方法能够在一步内实现数十亿纳米结构的高通量并行制造，相较于常用的电子束光刻或其他基于扫描的纳米加工技术（通常速度较慢），具有显著优势。

本文通过在氮化硅和蓝宝石基底上制备金质领结形结构，演示了该制造工艺；换言之，DNA折纸的空间信息被转移至完全由金属构成的纳米结构上。如文中所述，该技术并不局限于所选的领结形DNA折纸结构，因为该方法几乎可适用于任意形状的DNA折纸。此外，通过系统性的改进，该技术还可拓展至不同的金属和基底，为超构表面的制备开辟了道路33。

通过DNA折纸介导的制造方法所制备的图案化表面可作为多功能传感器；例如，可用于表面增强拉曼光谱（SERS）。由于单个纳米结构尺寸微小，所制备的表面可在可见光波长范围内用于光学和等离激元应用。

<table><tbody><tr><td>丙酮</td><td>Honeywell</td><td>40289H</td><td>半导体级ULSI，&amp;ge; 99.5 %</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>1036603</td><td>低电渗、多用途及分子生物学级</td></tr><tr><td>氢氧化铵</td><td>Fisher Chemical</td><td>10652251</td><td>25 % 氨溶液，分析纯认证，d = 0.91</td></tr><tr><td>BRANSON 5510</td><td>Branson</td><td></td><td>超声波清洗仪</td></tr><tr><td>Dimension Icon</td><td>Bruker</td><td></td><td>原子力显微镜</td></tr><tr><td>电子束蒸发仪 IM-9912</td><td>Instrumentti Mattila</td><td></td><td>物理气相沉积用蒸发仪</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8751</td><td>用于DNA染色的荧光染料</td></tr><tr><td>Eon 微孔板分光光度计</td><td>BioTek</td><td></td><td>用于DNA折纸浓度测定的紫外/可见光分光光度计</td></tr><tr><td>Gel Doc XR+ 成像系统</td><td>BioRad</td><td></td><td>凝胶成像系统</td></tr><tr><td>凝胶上样染料，蓝色（6&amp;times;）</td><td>New England Biolabs</td><td>B7021S</td><td>基于溴酚蓝的琼脂糖凝胶电泳上样染料</td></tr><tr><td>G-storm GS1 梯度PCR仪</td><td>Gene Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBR 4</td><td>IKA</td><td></td><td>加热浴</td></tr><tr><td>氢氟酸</td><td>Honeywell</td><td>40213H</td><td>半导体级，49.5-50.5 %</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Honeywell</td><td>40301H</td><td>半导体级VLSI，&amp;ge; 99.8 %</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>无水，&amp;ge; 98 %</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT 水平电泳系统</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmalab 80+ PECVD</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>PECVD系统</td></tr><tr><td>Plasmalab 80+ RIE</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>RIE系统</td></tr><tr><td>聚乙二醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>89510</td><td>BioUltra，8,000</td></tr><tr><td>PowerPac HC 高电流电源</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蓝宝石基底（Al2O3）</td><td>University Wafer</td><td></td><td>厚度：430 &amp;mu;m，抛光：DSP，尺寸：50.8 mm</td></tr><tr><td>Sigma VP</td><td>Zeiss</td><td></td><td>扫描电子显微镜</td></tr><tr><td>硅胶</td><td>Merck</td><td>1019691000</td><td>含指示剂（橙色凝胶），颗粒 ~1-3 mm</td></tr><tr><td>单链支架DNA，p7249型</td><td>Tilibit Nanosystems</td><td></td><td>浓度为100 nM</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>ACS试剂，&amp;ge; 99.0 %</td></tr><tr><td>订书钉链（寡核苷酸）</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>序列可订购，例如在无RNase水中配制成100微摩尔浓度</td></tr><tr><td>TAE缓冲液（50&amp;times;）pH 8.0</td><td>VWR Chemicals</td><td>444125D</td><td>Electran电泳级</td></tr><tr><td>Take3 微体积检测板</td><td>BioTek</td><td></td><td>用于DNA折纸浓度测定</td></tr><tr><td>正硅酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86578</td><td>&amp;ge; 99.0 %（GC）</td></tr></tbody></table>

用于传感应用的dna折纸介导的无机结构基底纳米图案化

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

结构DNA纳米技术提供了一条以DNA为构建材料自下而上进行组装的有效途径。最常见的DNA纳米制造技术称为DNA折纸术，它能够以纳米级精度高通量地合成结构精确且高度多功能的纳米结构。本文展示了如何通过将自下而上的DNA折纸技术与传统的自上而下的光刻方法相结合，将DNA折纸的空间信息转移至金属纳米结构上。该方法可在选定的基底上一步制备数十亿个微小纳米结构。本方法以蝶形DNA折纸为例，在氮化硅或蓝宝石基底上制备出金属蝶形天线结构。该方法依赖于在折纸沉积基底表面选择性生长一层二氧化硅，从而形成后续光刻步骤的图案化掩模。由于特征尺寸极小（亚10 nm），这些带有纳米结构的表面可进一步用于分子传感（例如表面增强拉曼光谱，SERS）以及可见光波段的多种其他光学应用。通过方法学上的改进，该技术可拓展至其他材料体系，因此所获得的光学活性表面在超材料和超表面的开发中具有潜在应用价值。

蝴蝶结形DNA折纸结构的设计示意图及其结构细节如图所示 图1琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜用于分析DNA折纸结构的折叠情况以及PEG纯化的质量图2）。纳米光刻步骤的工艺流程如图所示 图3. SiO₂处理后的代表性原子力显微镜图像2 显示了遮蔽生长的情况 图4 （此步骤如图所示） 图3D），而最终金属纳米结构的SEM图像如图所示 图5 （此步骤如图所示） 图3H). 图6 展示了由领结形DNA折纸模板构建的金属纳米结构的光学功能。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">折叠缓冲液（FOB）组分浓度 [mM]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Tris</td>
			<td>乙酸</td>
			<td>EDTA</td>
			<td>氯化镁</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5x FOB</td>
			<td>100</td>
			<td>47.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>31.25</td>
			<td>~8,3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x FOB</td>
			<td>40</td>
			<td>19</td>
			<td>1</td>
			<td>12.5</td>
			<td>~8,3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：折叠缓冲液（FOB）的组成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>温度范围 [oC]</td>
			<td>降温速率</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-70</td>
			<td>-0.2 °C / 8 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70-60</td>
			<td>-0.1 °C / 8 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-27</td>
			<td>-0.1 °C / 2 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>保持至停止</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：蝴蝶结折纸结构折叠的温度梯度程序。退火后，折纸结构将在12 oC保存，直至程序被手动终止。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PECVD 与 RIE 参数</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>气体</td>
			<td>气体流速 [sccm]</td>
			<td>腔室压力 [mTorr]</td>
			<td>射频功率 [W]</td>
			<td>温度 [oC]</td>
			<td>持续时间 [s]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-Si 的 PECVD</td>
			<td>5% SiH4 in N2</td>
			<td>500</td>
			<td>1000</td>
			<td>15</td>
			<td>250</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 等离子体处理</td>
			<td>O2</td>
			<td>50</td>
			<td>40</td>
			<td>200</td>
			<td>30</td>
			<td>1200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiO2 的 RIE</td>
			<td>CHF3</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Ar</td>
			<td>25</td>
			<td>30</td>
			<td>100</td>
			<td>25</td>
			<td>10-22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-Si 的 RIE</td>
			<td>O2</td>
			<td>8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SF6</td>
			<td>100</td>
			<td>90</td>
			<td>50</td>
			<td>30</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>剩余 a-Si 的 RIE</td>
			<td>O2</td>
			<td>8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SF6</td>
			<td>100</td>
			<td>90</td>
			<td>50</td>
			<td>30</td>
			<td>35-40</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：等离子体增强化学气相沉积（PECVD）和反应离子刻蚀（RIE）的工艺参数。 这些器件的工艺参数针对特定仪器而设定，使用时可能需要进行相应调整。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60313/60313fig1.jpg" /> 
图1：蝴蝶结形DNA折纸结构的设计。（A）蝴蝶结形折纸结构设计的示意图，其中核心结构显示为双螺旋，polyT突出端以波浪线表示。（B）在caDNAno软件中蝴蝶结形折纸结构设计部分的截图。红色叉号表示用于扭转校正的碱基对跳跃，T8-突出端的添加用于防止平末端的碱基堆积。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/60313fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60313/60313fig2.jpg" /> 
图2：蝴蝶结形DNA折纸结构的表征。（A）蝴蝶结结构在聚乙二醇（PEG）纯化前后的琼脂糖凝胶电泳图。以7249个核苷酸长度的支架链作为参照。（B）纯化前蝴蝶结结构的原子力显微镜（AFM）图像。（C）PEG纯化后蝴蝶结结构的AFM图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/60313fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60313/60313fig3.jpg" /> 
图3制备工艺流程示意图 (尺寸未按比例绘制。 (A将基底切块并清洗干净。B) 通过等离子体增强化学气相沉积（PECVD）沉积一层非晶硅（a-Si）。*可在a-Si下方使用额外的牺牲层，以便采用除氢氟酸以外的蚀刻剂进行剥离。C) 用 O 处理样品表面2 血浆并将DNA折纸沉积到其上。 (D) 培养SiO2 置于干燥器中避光。E) 刻蚀一层薄的SiO₂2 并通过反应离子刻蚀（RIE）刻蚀其下方的非晶硅（a-Si）。(F通过物理气相沉积（PVD）在掩模下沉积金属。G) 氢氟酸剥离。H) 通过反应离子刻蚀（RIE）去除剩余的非晶硅（a-Si）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/60313fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60313/60313fig4.jpg" />
图4：具有DNA折纸形状图案的SiO2薄膜的代表性原子力显微镜图像。（A）10 μm × 10 μm 扫描区域展示了图案形成的高产率。（B）更近距离的3 μm × 3 μm 扫描显示了SiO2薄膜中精确的单个图案。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/60313fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60313/60313fig5.jpg" /> 
图5：代表性扫描电子显微镜图像 (不同结构DNA折纸模板化的金属纳米结构的扫描电镜（SEM）图像。 (A十字形DNA折纸，即所谓的Seeman砖块折纸54. (B）Bowtie天线。C) 手性双L型（CDL）结构。插图显示单个结构，标尺框尺寸为150 nm × 150 nm。蝴蝶结形DNA折纸结构的精确结构制备产率最高可达76%，其他所示结构的产率约为50%34该图已根据 Shen 等人的研究进行改编和修改。34该图经作者许可转载，由美国科学促进会于2018年出版。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/60313fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60313/60313fig6.jpg" /> 
图6：所获得纳米结构的代表性光学/功能特性。（A）单个金纳米蝶形结构在不同偏振方向下的局域表面等离子体共振（LSPR）测量结果（分别以橙色和蓝色编码）。实线为实测光谱，虚线为模拟结果。插图显示了所测颗粒的扫描电镜图像（左）以及用于模拟的模型（右）。（B）在覆盖有蝶形纳米结构的表面上测得的罗丹明6G和2,2-联吡啶的表面增强拉曼光谱（SERS）。各样品的基线表示未存在纳米结构时的信号水平。本图改编并修改自Shen等人的研究34。该图已获得作者及美国科学促进会（AAAS）2018年出版许可。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/60313fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="补充文件 1" src="/files/ftp_upload/60313/60313sup1.jpg" /> 
补充文件 1：CaDNAno 文件 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/bowtie_poly-T.json" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
<img alt="补充文件 2" src="/files/ftp_upload/60313/60313sup2.jpg" /> 
补充文件 2：m13mp18 序列 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/m13mp18_sequence.txt" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
<img alt="补充文件 3" src="/files/ftp_upload/60313/60313sup3.jpg" /> 
补充文件 3：引物链序列 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/bowtie_staple_sequences.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种利用DNA折纸结构作为引导模板，在基底上制备离散且精确的无机纳米结构的实验方案。该方法通过在透明基底（蓝宝石）上制备等离激元金纳米弓形天线加以验证。

用于传感应用的DNA折纸介导的无机结构基底纳米图案化

结构DNA纳米技术提供了一条以DNA为构建材料自下而上进行组装的有效途径。最常见的DNA……

该方案结合了自下而上的DNA折纸技术与自上而下的纳米制造方法，可在不同基底上并行制备特征尺寸小于10纳米的无机纳米结构。该技术能够一次性精确制造数十亿个纳米结构，几乎可形成任意形状，且无需依赖昂贵的图案化方法。该方法有望应用于表面增强拉曼光谱等传感领域，也可用于构建新型光学超表面。尽管本实验方案相对简单，但仍需要较高的跨学科制备技能，因此，对于不同背景的研究人员而言，可视化演示将非常有帮助。本次实验操作将由本实验室的另一位研究生索菲亚·朱林（Sofia Julin）与佩特里·皮斯库宁（Petteri Piskunen）共同示范。制备 staples 链母液时，取构建蝴蝶结结构所需的所有寡核苷酸等量混合；随后，在一个 200 微升的 PCR 管中，加入 20 微升 M13 MP18 支架链、40 微升 staples 母液以及 40 微升 2.5 × 折叠缓冲液。然后，按照表格中的说明，将反应混合物在热循环仪中从90°C退火至27°C。制备基底时，将从蓝宝石晶圆上切割的约7 mm × 7 mm的芯片浸入盛有52°C丙酮的玻璃容器中，至少超声处理15分钟，随后将芯片转移至盛有异丙醇的玻璃容器中，超声处理2分钟。超声结束后，用镊子将芯片从异丙醇中取出，并立即用氮气吹干，氮气流速调至最高，吹干时使芯片表面与气流方向平行。对于非晶硅层的等离子体增强化学气相沉积，将干燥后的芯片放入等离子体增强化学气相沉积仪器中，并根据仪器型号和校准情况设定沉积参数，生长约50纳米的非晶硅层。对于非晶硅层的氧气等离子体处理，将芯片放入反应离子刻蚀仪器中，并根据仪器型号和校准情况设定刻蚀参数以产生氧气等离子体，然后运行氧气等离子体处理程序。在氧气等离子体处理后的30分钟内，将5微升折叠并纯化的DNA折纸溶液与4微升折叠缓冲液和1微升1摩尔的氯化镁混合。将10微升DNA折纸混合液滴加到每片经氧气等离子体处理的芯片上，并盖上盖片，在室温下孵育5分钟。孵育结束后，用100微升蒸馏水清洗芯片表面，使用移液器将水来回冲洗数次，注意避免触碰芯片的中心区域。按照上述方法再进行两到三次灰化后，立即用氮气流干燥芯片。为了生长二氧化硅掩模，将100克硅胶与30毫升蒸馏水混合。将硅胶混合物放入干燥器中，并用带孔板将凝胶分隔开。24小时后，将吸附有DNA折纸结构的芯片放置于干燥器内的穿孔平台上，在芯片的一侧放置含有10毫升正硅酸四乙酯的试剂瓶，另一侧放置含有10毫升25%氢氧化铵的试剂瓶。然后密封腔室，在室温下孵育20小时。孵育结束后，未被DNA折纸结构覆盖的区域将形成二氧化硅薄膜，从而产生具有DNA折纸形状孔洞的10至20纳米图案化掩模。对于二氧化硅的反应离子刻蚀，将芯片放入反应离子刻蚀仪器中，并设置刻蚀参数，仅刻蚀2至5纳米的二氧化硅，以暴露二氧化硅掩模孔洞下方的非晶硅层。所有刻蚀参数应根据所选用的仪器进行优化，因为合适的参数取决于设备类型和具体配置，可能需要进行多次调试。运行各向异性二氧化硅等离子体刻蚀程序后，设置刻蚀参数以穿透50纳米非晶硅层。然后运行各向同性硅等离子体刻蚀程序。进行物理气相沉积时，将芯片装入物理气相沉积仪器的蒸发腔室，并选择一种粘附性金属靶材。为靶材和目标厚度设置厚度控制程序，启动电子束，将光束对准靶材并逐渐增加束流，直至达到每秒0.05纳米的沉积速率。随后开始蒸发，直至最终厚度达到2纳米。蒸发结束后，在不放空腔室或中断过程的情况下选择第二种靶金属，并设定其厚度。调整电子束至目标位置，直至沉积速率达到0.05纳米每秒，然后开始蒸发，直至厚度达到20纳米。DNA折纸形状的金属结构将通过二氧化硅掩模上的孔形成，总高度为22纳米。放气后取出样品。对于氢氟酸剥离，将样品浸入基于氢氟酸的刻蚀液中，并使用塑料镊子轻轻搅拌样品。待二氧化硅层完全刻蚀且金属层脱落后，用双蒸水和异丙醇冲洗样品。然后如图所示，用氮气流吹干样品。对于剩余非晶硅的反应离子刻蚀，将芯片放入反应离子刻蚀仪中，并设置刻蚀参数，以完全去除全部50纳米的非晶硅。运行各向同性非晶硅等离子体刻蚀程序，去除剩余的非晶硅。随后从反应离子刻蚀设备中取出样品，并将其存放在带盖容器中。琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜可用于分析DNA折纸的折叠情况以及聚乙二醇纯化的质量。此处展示了二氧化硅掩模生长后的代表性原子力显微镜图像。在这些图像中，还可观察到最终金属纳米结构的扫描电子显微镜结果。在这些图中，分析了由领结形 DNA 折纸模板化的金属纳米结构的光学功能。二氧化硅掩模的生长对整个过程至关重要，且对 TEOS 的湿度和反应活性较为敏感。因此，应严格控制这些参数以确保可重复性。如果DNA折纸技术能进一步与高度有序的DNA图案相结合，则有望推动可见光波长范围内的超材料和表面结构的制备。

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