Name: 研究使用正交乳腺癌模型的三阴性乳腺癌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 了解利用GFP标记和生物发光成像技术评估三阴性乳腺癌肿瘤负荷的先进方案。该方法通过实时PCR分析检测微转移，为抗癌药物疗效评价和转移机制研究提供可靠模型。

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作者感谢美国国立卫生研究院、国家癌症研究所、贝塞斯达马里兰州癌症与炎症项目以及弗雷德里克国家实验室—小型动物成像项目、Leidos 生物医学研究公司，弗雷德里克马里兰州，美国机构内研究计划的支持。

肿瘤生长分析采用经国家癌症研究所动物实验伦理委员会批准的方案进行，并遵循美国国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》、美国公共卫生服务部《实验动物护理和使用指南》以及《实验动物人道护理和使用政策》的建议。
1. 植入前细胞的制备
注意：MDA-MB-231 人乳腺腺癌细胞（商业获取）通过慢病毒稳定转染了荧光素酶基因 III 和增强型绿色荧光蛋白（GFP）标记，并在筛选抗生素（嘌呤霉素）存在条件下培养。
<ol>
	<li>以 1 × 106 个 MDA-MB-231-Luc/GFP 细胞开始细胞培养，在 T75 培养瓶中加入 15 mL 预热至 37 °C 的 RPMI 1640 培养基（含 10% 胎牛血清，FBS）。将细胞置于 37 °C、5% CO2 的恒温细胞培养箱中培养，每周至少更换两次完全培养基。 
	注意：避免干扰细胞生长，每天需检查细胞生长状况。当细胞融合度达到 85%−90% 时，需进行传代培养，以维持其增殖状态。</li>
	<li>在细胞接种前一周，通过以下步骤从培养瓶中去除嘌呤霉素：首先移除培养瓶中的全部培养基，然后用 10 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗两次，最后更换为不含嘌呤霉素的完全培养基。在添加培养基和冲洗过程中，避免扰动细胞。此后所有培养基补充步骤中，切勿再使用含筛选抗生素的完全培养基。</li>
	<li>在准备接种细胞的当天，胰酶消化前应先移除所有完全培养基，以避免胰酶失活。向培养瓶中加入 5 mL 胰酶进行消化，观察细胞并确认其从培养瓶表面脱落。</li>
	<li>当大部分细胞脱落后，加入 10 mL 完全培养基以中和胰酶活性。随后将细胞悬液转移至 50 mL 离心管中，在约 150 × g 条件下离心以收集细胞。离心后弃去上清液，加入 10 mL 1× PBS 重悬细胞，准备进行细胞计数。</li>
	<li>使用细胞计数仪计数细胞，并用含 25% 基底膜基质的冷 1× PBS 将细胞浓度调整至 20 × 106 个/mL。每只小鼠的第四对乳腺脂肪垫中注射 0.1 mL 含 25% 基底膜基质的 1× PBS 悬液，其中包含 2 × 106 个细胞。细胞接种时应准备额外的针头和注射器，并在接种前将细胞与基底膜基质的混合物置于冰上保存。 
	注意：注射器和针头存在死腔。根据所选针头和注射器的长度、类型及规格不同，一支 0.5 英寸 26 G 针头的结核菌素注射器死腔体积可达 70 µL10。为补偿死腔及其他可能的意外损失，应额外准备 40%−50% 的细胞接种混合液。</li>
</ol>
2. 原位乳腺癌模型建立及肿瘤大小测量
<ol>
	<li>让6周龄雌性裸鼠在细胞植入前于饲养设施中适应至少1周。 
	注意：使用相同年龄的小鼠可减少数据变异。</li>
	<li>每一轮实验中，使用4%异氟烷对五只小鼠进行麻醉，异氟烷需经过滤处理（0.2 µm以1 L/min的流速通入空气3−4分钟。注意观察小鼠呼吸频率和呼吸模式的变化，并通过夹趾反应确认小鼠是否处于适当的麻醉状态。当小鼠不再活动后，取出一只小鼠，将其口鼻置于鼻罩中，继续给予相同的麻醉气体。</li>
	<li>擦拭左侧 4th 用酒精擦拭乳腺组织。使用精细的鼠齿镊，提起4th 轻轻插入25 G针头至乳腺组织。确保针尖斜面朝上，然后轻微回抽活塞，确认针头未刺入血管。若注射器内无血液进入，则继续缓慢注射 100 µL 将细胞-基底膜-基质混合物注入乳腺脂肪垫。 
	注意：皮肤下方会出现一个圆形隆起区域。</li>
	<li>等待基底膜基质硬化10−15秒，然后移除针头。对诱导室中剩余的小鼠重复此操作。将所有使用过的针头和注射器放入锐器盒中。</li>
	<li>对所有小鼠使用相同的乳腺注射位点。密切观察注射部位，注意是否有细胞植入混合物从注射部位渗出。 
	注意：几分钟内，小鼠将开始恢复意识。</li>
	<li>在进行任何肿瘤大小测量之前，让异种移植瘤自由生长7−10天，期间不作任何干预。</li>
	<li>检查所有小鼠的异种移植瘤大小。使用游标卡尺测量肿瘤尺寸。确定肿瘤体积（mm3）使用以下公式： 
	 
	<img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq1.jpg" alt="肿瘤体积计算公式，\(L \times W \times W / 2\)；癌症研究分析示意图" data-altupdatedat="1788250015000"> 
	 
	其中L为最长维度，W为与L垂直的最短维度。</li>
	<li>识别并剔除超出均值一个标准差的离群值。仅使用肿瘤大小相近的小鼠进行实验。将小鼠随机分配至不同的治疗组，并开始治疗。</li>
	<li>每周使用游标卡尺测量肿瘤大小两次。记录异种移植瘤的所有物理变化（如坏死、裂伤）。</li>
</ol>
3. 体内生物发光与离体荧光成像
注意：本研究中，二维生物发光成像和荧光成像均在实验终点进行。生物发光成像（BLI）使用配备有16位冷却CCD相机和加热成像平台的商用临床前光学扫描仪完成。
<ol>
	<li>成像前，在诱导室中通过将异氟烷设为3%并使用过滤的（0.2 µm以1 L/min的流速通入空气，持续3−4分钟。通过夹捏脚趾判断麻醉效果。确保将诱导室置于通风橱内，以尽量减少工作人员接触异氟烷。</li>
	<li>使用27 G针头通过腹腔注射途径向麻醉小鼠给予D-荧光素钠（150 mg/kg），并将麻醉后的小鼠转移至成像室。在扫描仪成像室内，维持异氟烷浓度为2%−2.5%，并以氧气供气2 以1 L/min的流速作为载气。 
	注意：将小鼠体温维持在约~37 °C 在麻醉诱导室、成像台（如果载物台未加热）和术后恢复笼下放置加热垫，以在操作过程中维持体温。</li>
	<li>在对研究用小鼠进行成像之前，使用以下参数对三只额外的荷瘤小鼠（未分配至任何实验组的动物）进行成像，以获取荧光素动力学数据：激发滤光片关闭，发射滤光片打开，光圈 f/1，视野 D（FOV-D），中等 binning（8 × 8），自动曝光，每 2 分钟成像一次，持续 40 分钟。根据测得的最高生物发光信号，确定后续所有时间点成像的最佳采集时间窗口。</li>
	<li>进行转移灶成像时，用黑色手套剪下的套管遮挡原发肿瘤产生的强BLI信号。采用第3.3步所述相同参数获取图像，进行肺转移成像时使小鼠腹侧朝向相机，进行脑转移成像时使小鼠背侧朝向相机。 
	注意：必须测试几种不同品牌的黑色手套，以选择自发光程度最低的品牌。</li>
	<li>使用扫描仪和数据分析软件，在胸腔或脑部绘制一个标准形状的感兴趣区域（ROI），确保完全覆盖目标器官，以评估转移负荷。将生物发光（BL）信号定量为总通量（光子/秒）。</li>
	<li>BLI 后立即通过 CO2 根据动物护理使用委员会（ACUC）指南及机构批准的动物实验方案实施窒息处死，使用解剖剪和镊子取出肺和脑组织，用于离体成像。 
	注意：由于操作步骤不兼容，无法在同一小鼠上同时进行离体成像和肺转移结节数量计数。</li>
	<li>用1×PBS快速冲洗所有器官，以去除表面血渍，并将器官置于低自发荧光的黑色塑料板上。将器官转移至配备光谱分离功能（固态液晶波长调谐）和12位CCD相机的多光谱荧光扫描仪，用于GFP检测。</li>
	<li>采集无肿瘤对照小鼠的离体器官及实验组器官的多光谱GFP图像（激发滤光片 = 457 ± 23 nm；发射滤光片 = 490 nm长通），扫描波长范围为500−720 nm，步长10 nm。利用无肿瘤对照小鼠的离体器官校正自发荧光。</li>
	<li>在多光谱GFP成像后，确定最佳成像参数。根据制造商的操作说明，对所有目标器官进行图像采集，并开展图像分析（即生成自体荧光和GFP的光谱库，用于光谱分离程序）。</li>
</ol>
4. 转移性乳腺癌细胞的分子检测
<ol>
	<li>体外成像后，将整个脑组织在液氮中速冻，并于 -80 °C 冰箱中保存，直至进行 DNA 提取。</li>
	<li>进行 DNA 提取时，将整个脑组织放入含有 2 mL DNA 裂解缓冲液的 5 mL 匀浆管中。使用匀浆器（功率设置为 50）对速冻的全脑组织进行匀浆。待脑组织完全匀浆后，将 1 mL 悬液（裂解物）转移至无 DNase 和 RNase 的 2 mL 微量离心管中，并按照试剂盒说明书继续进行 DNA 提取。 
	注意：为尽量减少 DNA 残留污染，每次处理样品后需彻底清洗匀浆器，先用无 DNase 和 RNase 的水中配制的 75% 乙醇冲洗，再用 1 M NaOH 溶液冲洗，最后再用无 DNase 和 RNase 的水中配制的 75% 乙醇冲洗，以有效降解并清除任何残留的 DNA。</li>
	<li>向裂解物中加入 0.5 mL 100% 乙醇的 DNA 裂解缓冲液。通过倒置混匀样品，并在室温下静置 3 分钟。 
	注意：避免过度或剧烈倒置。DNA 将以羊毛状沉淀的形式可见。</li>
	<li>使用移液器吸头将 DNA 转移至新的无 DNase 和 RNase 的 2 mL 微量离心管中。让样品在空气中干燥 1 分钟。加入 1 mL 75% 乙醇，倒置微量离心管 3−6 次以洗涤 DNA 样品。每次洗涤后用移液器弃去乙醇。重复洗涤步骤 2 次。</li>
	<li>将 DNA 样品在空气中干燥 10 秒。然后加入 52 µL 8 mM NaOH 以溶解 DNA 样品。取 2 µL DNA 样品用于 DNA 定量，其余 50 µL 在调整浓度后用于实时 PCR 检测。 
	注意：NaOH 有助于 DNA 样品充分溶解。</li>
	<li>使用分光光度计对每个 DNA 样品取 2 µL 进行定量，并以 A260/A280 吸光度比值作为质量评估参考。使用以下公式计算 DNA 浓度： 
	 
	<img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq2.jpg" alt="双链 DNA 浓度计算公式，50 μg/mL × OD₆₂₀ × 稀释倍数，计算方法。" data-altupdatedat="1788250015000"></li>
	<li>将 DNA 浓度调整至 50 ng/µL。对每个 DNA 样品，使用 50 ng DNA 作为起始模板进行实时 PCR 检测。使用 8 mM NaOH 溶液或无 DNase 和 RNase 的水稀释 DNA 样品。</li>
	<li>利用开源引物设计网络平台，自行设计针对外源性绿色荧光蛋白（GFP）序列的特异性引物对，用于检测转移细胞在远端部位侵袭和定植时的 GFP 标签。 
	注意：本研究使用引物序列为 F: 5'-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3'，R: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'。</li>
	<li>使用快速实时 PCR 试剂及支持快速实时 PCR 程序的实时 PCR 仪器。除常规的 30 个扩增循环外，运行结束时增加解离曲线步骤，以检测是否存在非特异性扩增。 
	注意：以下条件用于分子检测：95 °C 预变性 2 分钟，40 个循环（95 °C 5 秒，60 °C 15 秒），最后进行熔解曲线分析。GFP 扩增产物长度为 135 bp。</li>
	<li>使用未接种 MDA-MB-231 细胞的小鼠脑组织 DNA 作为阴性对照。使用从 MDA-MB-231-GFP/Luc 细胞中提取的 DNA 作为阳性对照。所有 PCR 试剂中不添加任何 DNA 模板作为空白模板对照（NTC）。 
	注意：每次 PCR 检测均需设置 PCR 对照。</li>
</ol>
5. 肺中转移性乳腺癌细胞的检测
<ol>
	<li>对于选择用于计数转移性肺结节的小鼠亚组，在体外成像后立即使用异氟烷（同步骤 2.2）对小鼠进行麻醉，进行心脏穿刺采集血液，随后通过颈椎脱臼实施安乐死。</li>
	<li>使用解剖剪打开胸腔，剪开心脏和胸腺后方以暴露气管。</li>
	<li>将装有 22 G 针头并含有 Bouin 氏液的 10 mL 注射器插入气管。推动注射器活塞，直至塌陷的肺被约 2 mL Bouin 氏液充盈膨胀。肺组织充气完成后，移除注射器和针头。</li>
	<li>将整个肺组织放入含有 Bouin 氏液的 15 mL 离心管中，轻轻倒置管子数次，于室温下浸泡 24 小时。</li>
	<li>24 小时后，从管中移除 Bouin 氏液，用清水冲洗肺组织，然后将其重新放回管中，并加入 70% 乙醇。使用解剖显微镜观察肺表面的转移灶（白色斑块或结节）并进行计数。</li>
</ol>
6. 数据收集与分析
<ol>
	<li>将肿瘤体积数据以及体内和体外成像数据记录在电子表格中，以便于数据录入、收集和管理。</li>
	<li>实验结束时，将所有数据 transferred 至电子表格和统计软件中，用于数据绘图和统计分析。</li>
</ol>

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<li>Troy, T., Jekic-Mullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Comparison+of+the+Sensitivity+of+Detection+of+Fluorescent+and+Bioluminescent+Reproters+in+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reproters in Animal Models.</a> Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在动物中研究三阴性乳腺癌（TNBC）时，已开发出两种小鼠模型：在免疫缺陷小鼠（即无胸腺裸鼠、NSG小鼠）中接种MDA-MB-231人乳腺腺癌细胞，以及在免疫健全的BALB/c小鼠中接种4T1细胞。这两种模型各有优势，具体选择取决于研究目标。例如，MDA-MB-231模型是在免疫缺陷小鼠中生长的人源TNBC细胞系，可模拟免疫抑制状态下的乳腺癌患者。另一方面，原位接种的4T1三阴性小鼠乳腺癌细胞在BALB/c小鼠中表现出的侵袭性表型，能够高度模拟Ⅳ期人类乳腺癌患者的转移过程。与静脉注射细胞的方法不同，在原位乳腺癌模型中，人源MDA-MB-231乳腺癌细胞被直接注射至乳腺脂肪垫11,12，与临床病理过程更为接近11,13。该模型中肿瘤生长周期较长，并逐步获得转移能力，生理相关性更强，因此并非人为诱导的转移性癌症模型4,14。这种自发性转移模型除肿瘤起始阶段外，能高度模拟人类乳腺癌的发展过程，是进行体内药物筛选和评估转移性乳腺癌治疗效果的关键模型。
小鼠体内肿瘤移植部位在提供维持肿瘤生长的微环境以及选择与人类相似的转移表型方面起着至关重要的作用。邻近的淋巴结和脂肪组织是影响乳腺癌疾病进展的关键因素15,16。在人类患者中，淋巴结和脂肪组织同样是影响乳腺癌恶性程度和发病率的关键相互作用因素17,18,19。因此，选择正确的解剖位置作为注射部位，可显著提高肿瘤模型与人类疾病的相似性。本研究选用第四对乳腺作为移植部位，主要基于上述要求，且该部位在解剖上更易接近，操作更为方便。
目前有多种肿瘤体积计算方法可供选择，研究人员可根据需要选用合适的方法。本研究采用的算法基于Faustino-Rocha等人的研究结果，该研究比较了不同的肿瘤体积计算公式，得出以下公式最为准确20。
<img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq3.jpg" alt="肿瘤体积计算公式，方程 L×W×W/2，用于医学研究分析。" data-altupdatedat="1788250015000">
基底膜基质是一种重要的细胞外基质，广泛应用于多种体外21和体内22,23实验。关于基底膜基质对异种移植瘤恶性程度的影响，目前存在相互矛盾的报道22,24,25。研究表明，其似乎仅影响异种移植瘤的初始定植，而对后续的肿瘤生长无明显作用25。在本实验所描述的异种移植过程中，将基底膜基质与癌细胞混合，以提高细胞/凝胶混合液在接种前的黏度。基底膜基质的存在可减少注射过程中混合液在注射部位的流失，并使混合液保留在移植部位，从而提高所植入异种移植瘤体积的一致性。
MDA-MB-231 细胞系是一种恶性永生化的人乳腺腺癌细胞系，因其三阴性状态而成为乳腺癌研究中的常用工具。使用双报告基因（荧光素酶和 GFP）细胞系可为活体和离体成像提供更大的灵活性。已有充分证据表明，与 GFP 信号相比，生物发光信号具有更高的灵敏度、更深的检测深度以及更优的对比度（信噪比），因此生物发光成像被广泛用于全身成像。然而，生物发光检测受限于较短的时间窗口（注射荧光素后约 15−20 分钟），仅在此期间信号检测呈线性关系。当动物被处死后，生物发光信号迅速减弱。如果实验中需要处死大量小鼠并采集多个组织或器官，则会成为实验设计上的难题。在本研究中，通过直接心脏穿刺采集血液，并对 40 只小鼠的脑、原发肿瘤、肺和受累淋巴结进行检测。当器官被采集并准备进行离体成像时，生物发光信号已无法检测到。因此，在此类情况下，GFP 检测更为适用。GFP 信号的发射波长位于可见光范围，在这些波长下，血液（即血红蛋白）对信号的吸收显著增强。此外，由于 NADH、脂色素和黄素类物质在可见光范围内的自发荧光，会产生较强的背景信号，使得低水平的 GFP 信号与自发荧光背景难以区分。采用多光谱荧光成像方法替代传统的滤光片组合成像，并结合光谱解混算法，有助于识别目标器官中的真实 GFP 信号。因此，通过结合生物发光成像在活体全身检测中的优势与多光谱 GFP 成像在离体器官/组织评估中的优势，可在大规模小鼠队列中最大化获取可定量的数据。
无论选择何种方法进行动物实验，都强烈建议在获取器官/组织之前彻底清除全部血液，尤其是针对转移负荷的研究。本方案通过实时PCR检测从小鼠原位乳腺癌模型中采集的全血样本中的GFP信号（数据未显示）。尽量减少器官/组织中的血液体积，可降低靶器官中的假阳性信号。
综上所述，使用 MDA-MB-231-Luc/GFP 细胞构建的原位乳腺癌模型是一种高度相关的动物模型，能够紧密模拟人类三阴性乳腺癌（TNBC）患者的病情。该模型对于在类似于人类的肿瘤微环境中研究、监测和评估治疗效果至关重要。双报告基因细胞系的应用进一步增强了该原位乳腺癌模型的实用性。

在美国，大约每八名女性中就有一人在其一生中会患上侵袭性乳腺癌，其中10%−20%的患者将被诊断为侵袭性的三阴性乳腺癌（TNBC）亚型。尽管在大多数情况下原发性病灶可通过手术切除，但亚临床微转移和化疗耐药性使其成为一种难以治疗的疾病。尤为重要的是，即使在早期接受过治疗，大多数转移性TNBC患者最终仍会复发1。因此，肿瘤异质性、微转移以及治疗耐药性是限制TNBC患者获得良好临床疗效的三大主要挑战。因此，迫切需要更深入地理解TNBC复杂的分子背景，并开发能够有效抑制转移性疾病的治疗药物。
肿瘤转移是一个多步骤的过程，在此过程中，肿瘤细胞通过降解细胞膜并从原发灶逃逸，侵入（即内渗）和逸出（即外渗）血管系统，并最终在远端组织中适应和定植，从而控制并劫持其微环境以促进自身的播散2。为研究乳腺癌转移，已开发出多种动物模型，其中常用的有两种方法：直接血液循环注射和原位移植。直接血液循环注射的常用方法包括尾静脉注射，此外也有采用直接心脏注射3、直接脑内注射4和直接肝脏注射5等方法。直接血液循环注射通常被称为人工转移模型，操作快速简便，但生理相关性较低，因为它绕过了肿瘤细胞从原发灶逃逸及内渗的过程6,7,8。与直接注射模型相比，原位乳腺癌模型在肺等远端器官中出现可检测的转移病灶所需时间更长，但其生理相关性更高，因为它更贴近人类体内发生的多步骤转移过程。重要的是，一项2013年的研究9比较了尾静脉注射与原位移植模型，发现通过尾静脉注射的乳腺癌细胞，以及从尾静脉注射后肺转移灶中分离出的细胞，其全局基因表达谱相似。相反，原位注射的乳腺癌细胞与其所形成的肺转移灶之间的全局基因表达谱却存在显著差异9。这些结果表明，原位模型具有更高的生理相关性，因为其转移病灶经历了类似于人类转移多步骤过程的选择性演化。
本研究描述了一种在裸鼠中建立的原位乳腺癌（MDA-MB-231-Luc/GFP）模型，该模型由我们实验室优化，适用于成像检测技术，以及新型生物标志物的鉴定和靶向化疗药物的开发。

<table><tbody><tr><td>波因氏液</td><td>Sigma</td><td>HT10132-1L</td><td>肺转移性结节染色</td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-1G</td><td>荧光素酶底物</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>ThermoFisher</td><td>10503027</td><td>DNA提取试剂盒</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>电子表格软件</td></tr><tr><td>匀浆器</td><td>Virtis</td><td>Cyclone Virtishear</td><td>用于组织匀浆</td></tr><tr><td>IVIS SPECTRUM 扫描仪</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>荧光与生物发光成像系统</td></tr><tr><td>Maestro GNIR-FLEX 荧光扫描仪</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>荧光成像系统</td></tr><tr><td>Matrigel 基质胶</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>储存于 -20°C，使用时置于 4°C 保存</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP 稳定细胞系</td><td>GenTarget</td><td>SC044</td><td>双报告基因人乳腺癌细胞系</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS</td><td>组织学图像采集</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>冲洗缓冲液</td></tr><tr><td>Primer3</td><td>MIT</td><td></td><td>引物设计</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>统计分析软件</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113803</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>61870127</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>SeniFAST SYBR Lo-ROX 试剂盒</td><td>Bioline</td><td>BIO-94020</td><td>快速实时荧光定量 PCR 试剂</td></tr><tr><td>StepOne Plus 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>实时荧光定量 PCR 仪</td></tr></tbody></table>

利用原位乳腺癌模型研究三阴性乳腺癌

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性强且治疗选择有限的乳腺癌亚型。与侵袭性较低的乳腺肿瘤患者相比，TNBC患者的5年生存率仅为77%，这归因于其特有的耐药表型和转移负担。为此，研究人员已建立了小鼠模型，旨在发现能够限制TNBC肿瘤生长和转移扩散的新型治疗策略。本文介绍了一种实用的TNBC原位模型操作指南：将悬浮于基底膜基质中的MDA-MB-231乳腺癌细胞植入小鼠第四对乳腺脂肪垫中，该模型可高度模拟人类癌细胞的行为。文中讨论了使用游标卡尺测量肿瘤、通过活体和离体成像评估肺转移以及分子检测方法。该模型为研究治疗效果提供了优良平台，尤其适用于原发性肿瘤与远端转移灶之间相互作用的研究。

使用游标卡尺测量肿瘤体积是评估治疗效果的一种成熟方法（图1）。接种细胞数量、基底膜基质的使用、微生物组、设施洁净度以及注射部位是影响肿瘤生长速率的关键因素。
与GFP成像不同，BLI在成像前至少需要提前15−20分钟注射荧光素酶底物。此外，小鼠品系、细胞系、处理方式以及荧光素酶报告基因均会影响生物发光信号的强度。因此，为了获得各研究组之间可比较的信号，必须在正式成像前进行BLI动力学研究，以确定最佳的成像时间窗口（图2）。
由于信噪比较高26,27，与GFP方法相比，活体全身生物发光成像在检测低水平转移信号方面具有更高的灵敏度（图3）。此外，生物发光信号的组织穿透深度比GFP深数毫米。然而，生物发光信号的产生依赖ATP，这在评估离体组织样本时成为限制因素。如果动物样本能够快速处理，则生物发光成像（BLI）仍可作为获取转移定量结果的有效方法。一种可行的策略是逐只处理动物。但本研究因使用了大量小鼠群体，该方法不可行。当器官在注射荧光素后约45分钟进行成像时，已无法检测到BLI信号。在此情况下，使用双报告基因细胞系具有重要意义。由于GFP分子性质稳定，研究人员可在采集靶器官的GFP信号前，有充足时间完成尸体解剖处理（图4）。
图5 提供了一个实际例子，说明卡尺测量肿瘤大小可能如何扭曲数据解读：因为该异种移植瘤已失去大部分有活力的肿瘤细胞，但仍保持较大的体积和形态。对这些异种移植瘤的组织病理学检查显示瘤体内部存在坏死（图5B）。
对于质疑原位乳腺癌模型中脑转移成像结果的研究人员，实时PCR的分子检测可提供令人信服的证据（图6）。在此情况下，外源性GFP DNA序列是解决该问题的最佳方法，因为转染的GFP DNA序列在人类或啮齿类动物中并不存在。
<img alt="描绘 MDA-MB-231 肿瘤在40天内体积增长并带有误差线的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：肿瘤体积测量。 在异种移植植入后第10天开始使用游标卡尺测量肿瘤体积/负荷，之后每周测量两次，直至实验结束。误差线由标准误（SEM）值计算得出。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="活体小鼠实验中的生物发光成像、荧光素动力学曲线图及光子发射分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：确定最佳图像采集时间窗口。 左图：选择一只携带大型异种移植瘤的小鼠和一只携带小型异种移植瘤的小鼠，用于确定最佳荧光素动力学范围。右图：通过每 2 分钟采集一次图像，持续 40 分钟所获得的荧光素动力学曲线。在 15−22 分钟之间观察到平台期，该时间段被用作后续所有成像实验的最佳图像采集时间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="活体小鼠生物发光成像，光学标记物分布，实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：全身生物发光成像（BLI）。 左：全身BLI成像。中：腹侧视图，下半身覆盖黑色手套的套筒部分。右：背侧视图，下半身覆盖黑色手套的套筒部分。通过BLI成像在腹侧视图中检测到腋窝淋巴结转移。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="GFP、BLI、NAIVE成像比较；脑和肺信号分析；荧光研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：离体BLI/GFP信号检测。 在小鼠处死后20分钟，从小鼠的脑和肺中检测到GFP信号。在注射荧光素45分钟后未检测到BLI信号。在未处理小鼠的脑和肺中未检测到GFP信号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="动物肿瘤成像、组织学分析、显微镜观察、肿瘤生长及组织结构的定量分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5：光学成像技术相较于卡尺测量的优势。（A）体内原位肿瘤中GFP信号检测的代表性图像。仅异种移植瘤的一小部分显示GFP信号，提示肿瘤的大部分为间质组织。这一信息无法通过传统的卡尺测量获得，可能导致错误结论。此例凸显了光学成像在动物模型研究中的重要性。（B）同一只小鼠的组织病理学切片显示，坏死区域（即内部区域）也被计入肿瘤体积的计算中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="熔解曲线分析；导数报告信号 vs 温度；图表；DNA稳定性评估。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：熔解曲线分析。 熔解曲线图显示了GFP扩增子的特异性。检测了来自植入MDA-MB-231-Luc/GFP细胞的小鼠脑组织提取的DNA，以及体外培养的MDA-MB-231-Luc/GFP细胞中分离的DNA（阳性对照）。通过实时PCR检测评估脑组织中的GFP含量。（A,B）分别为阳性对照和从小鼠脑组织提取的DNA的熔解曲线。（C）A和B图谱的叠加曲线，表明来自小鼠脑组织DNA的峰值信号特异性针对外源性GFP序列。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本研究提出了一种先进的方案，通过检测绿色荧光蛋白和生物发光信号，并结合定量分子检测技术，精确评估肿瘤负荷。

三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性强且治疗选择有限的乳腺癌亚型。与病情较轻的患者相比……

本方案通过引入GFP标签，克服了生物发光成像时间窗口有限的问题，同时也有助于通过PCR分析对微转移灶进行检测和定量。由于GFP标签避开了生物发光信号采集时间窗口的限制，可对更多样本进行成像，且减少了信号丢失的风险，从而降低了假阴性结果的可能性。本研究将有助于科研人员评估抗癌药物的治疗效果。该方法为研究上皮-间质转化、药物耐药性以及与转移过程相关的癌症干细胞机制的研究人员，以及抗癌药物开发提供了有用的模型。在确认小鼠对足底反射无反应后，用酒精擦拭左侧第四对乳腺，并使用精细的鼠齿镊轻轻提起第四对乳腺。确保针尖斜面朝上，将连接于含有100微升细胞基底膜基质混合物的一毫升注射器上的25号针头插入，并轻微回抽注射器活塞，以确认针头未接触任何血管。为了获得可比较的结果，所有受体动物的肿瘤细胞注射部位必须保持一致。若无血液进入注射器，应缓慢将全部溶液体积注入乳腺脂肪垫。皮肤下会出现一个圆形隆起的肿块。等待基底膜基质硬化10至15秒后移除针头，并在进行肿瘤大小测量前，让异种移植瘤自由生长7至10天。随后使用游标卡尺测量所有小鼠中异种移植瘤的大小，并按照所示公式计算肿瘤体积。在对实验动物成像前，另取三只荷瘤小鼠，根据所示参数，以两分钟为间隔，连续成像40分钟，以获取本研究所需的荧光素动力学数据。利用测得的峰值生物发光信号来确定后续所有时间点的最佳图像采集时间窗口。进行转移灶成像时，用黑色手套剪下的套管覆盖原发肿瘤，将麻醉后的小鼠放入扫描仪，然后使用与前述相同的参数进行成像：肺转移成像时使小鼠腹侧朝向相机，脑转移成像时使小鼠背侧朝向相机。使用扫描仪及数据分析软件，在成像区域绘制感兴趣区域（ROI），确保完全覆盖目标器官，以便评估转移负荷，并将生物发光信号定量为总通量（photons per second）。在完成生物发光信号定量后，立即采集脑组织和肺组织，并用 PBS 快速冲洗器官以去除表面血渍。将器官置于低自体荧光的黑色塑料板上，运送至配备光谱分离功能的多光谱荧光扫描仪，用于检测 GFP。为获取所提取器官的多光谱 GFP 图像，以 10 纳米为步长，在 500 至 720 纳米波长范围内扫描器官。为了获得组织自发荧光谱，需扫描未注射对照小鼠的切除器官。此外，对表达GFP的组织（如原发性肿瘤）进行成像，以获取包含自发荧光与GFP混合信号的荧光谱。按照仪器制造商的说明书处理这些光谱数据，建立包含纯GFP和自发荧光谱的光谱库。在确认光谱库的准确性并分离GFP信号与组织自发荧光背景后，使用同一光谱库对研究中的所有图像进行非混合分析。在快速冷冻后进行DNA提取时，将整个脑组织放入一个5毫升的匀浆管中，管内含有2毫升DNA裂解缓冲液，使用匀浆器以50的设定对组织进行匀浆。当组织完全匀浆后，将1毫升裂解液转移至无DNA酶和RNA酶的2毫升微量离心管中，并根据制造商的说明书分离DNA。向分离物中加入 500 µL 100% 乙醇，通过倒置混匀样品。室温静置 3 分钟后，使用移液器将絮状 DNA 沉淀转移至一个新的 2 mL 无 DNA 酶和 RNA 酶的离心管中。在加入 1 mL 75% 乙醇前，让样品在空气中干燥 1 分钟，然后倒置离心管 3 至 6 次以洗涤样品。最后一次翻转后弃去乙醇，随后按照上述方法用新鲜乙醇再清洗DNA两次，每次均使用新鲜乙醇。最后一次清洗后，将样品在空气中干燥10秒，然后将DNA溶解于52微升8毫摩尔的氢氧化钠溶液中。取2微升DNA等分试样转移至分光光度计比色皿中，根据A260与A280之间的吸光度比值，按照公式测定样品中DNA的浓度。使用额外的 8 毫摩尔氢氧化钠将样品的 DNA 浓度调整至每微升 50 纳克，并利用开源引物设计网页工具自行设计针对外源性绿色荧光蛋白（GFP）序列的特异性引物对，用于实时 PCR 检测 GFP 标签以及已侵袭并定植于肿瘤远端部位的转移性细胞。随后，采用快速实时 PCR 试剂及支持快速实时 PCR 程序的实时 PCR 仪，对样品进行实时定量 PCR 分析。为检测肺部的转移性乳腺癌细胞，使用解剖剪刀打开胸腔，剪开心脏和胸腺后方以暴露气管。将连接有10毫升注射器（内含Bouin溶液）的22号针头插入气管，推动针栓，直至塌陷的肺组织膨胀，注入约2毫升溶液。肺组织充盈后，取下注射器和针头，将整个肺组织转移至含有新鲜Bouin溶液的15毫升离心管中。轻轻颠倒混匀数次，然后于室温下浸泡24小时。第二天，用水冲洗肺组织，将样本放入含有70%乙醇的离心管中。然后使用解剖显微镜计数肺表面转移性白色斑块和结节的数量。使用游标卡尺测量肿瘤体积是评估治疗效果的一种成熟方法。为了在不同研究组之间获得可比较的信号，必须在成像前进行生物发光成像（BLI）动力学研究，以确定最佳成像时间点。由于信噪比较优，整体活体BLI在检测低水平转移信号方面比GFP方法更为敏感。然而，由于GFP分子具有较高的稳定性，在双报告基因研究中，研究人员有充足的时间在采集目标器官的GFP信号前对尸体进行处理。这一实际案例表明，游标卡尺测量肿瘤大小可能会扭曲数据解读，因为该异种移植瘤虽然仍保持较大的体积和形态，但已失去大部分有活力的肿瘤细胞。通过实时 PCR 进行分子检测也可为原位乳腺癌模型中的脑转移提供有力证据，利用外源性 GFP DNA 测序，因为转染的 GFP DNA 序列在人类或啮齿类动物中并不存在。移植部位应与癌症的恶性特征在生理学和解剖学上相关。原发灶和远端病灶均可检测肿瘤基因和蛋白表达，且可分离转移细胞以进行进一步表征。

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