研究使用正交乳腺癌模型的三阴性乳腺癌

我们的协议通过包括一个GPC标签，克服了有限的生物发光成像窗口，这也有助于通过PCR分析检测和定量微米位。由于GP标签绕过有限的生物发光采集窗口，更多的受试者可以成像，而不会丢失信号，并且错误阴性结果的可能性是有限的。这项研究将有助于研究人员评估抗癌剂的疗效。

这种方法为对EMT、耐药性和与转移过程相关的癌症干细胞机制以及抗癌药物开发感兴趣的研究人员提供了一个有用的模型。在确认对踏板反射缺乏反应后，用酒精拭子左第四乳腺，并使用细的鼠牙钳稍微抬起第四乳腺。确保尖端是斜面，插入一个25表针连接到一毫升注射器，其中包含100微升的细胞地下室膜基质混合，并稍微缩回柱塞，以确保针不接触任何血管。

为了进行比较结果，肿瘤细胞注射部位必须在所有接受动物之间保持一致。如果没有血液进入注射器，慢慢将整个溶液的体积注射到乳腺脂肪垫中。一个圆形凸起的质量将出现在皮肤下。

等待 10 到 15 秒，让地下室膜基质硬化，然后取出针头，让异种移植在执行肿瘤尺寸测量前 7 到 10 天自由生长，而不会中断。然后使用卡钳测量所有小鼠异种移植的大小，并使用指示的方程确定肿瘤体积。在成像研究动物之前，使用指示的参数，每隔两分钟对三只额外的肿瘤携带小鼠进行成像，间隔为 40 分钟，以获得用于研究的荧光素动力学。

使用峰值测量的生物发光信号定义所有后续时间点的最佳图像采集时间窗口。要执行转移成像，请用黑手套的袖子切割覆盖原发性肿瘤，将麻醉小鼠放入扫描仪中，然后使用与鼠标对着相机的腹侧相同的参数对白西林信号进行成像，而小鼠的背侧则面对相机进行脑转移成像。使用扫描仪和数据分析软件，绘制图像区域感兴趣的区域，以确保覆盖整个感兴趣的器官，以便评估转移性负担，并量化生物发光输出为总通量和光子/秒。

生物发光信号量化后立即采集大脑和肺组织，并迅速冲洗PBS中的器官，以去除任何表面的血渍。将器官放在低自动荧光黑色塑料板上，将样品运送到配备光谱非混合功能的多光谱荧光扫描仪中，以进行 GFP 检测。为了获得提取器官的多光谱GP图像，扫描500至720纳米的器官，步幅为10纳米。

为了获得组织自动荧光剖面，扫描未注射对照小鼠的切除器官。此外，图像GP正组织，如原发性肿瘤获得自动荧光混合GP配置文件。根据制造商的协议处理这些光谱，以建立具有纯 GFP 和自动荧光配置文件的光谱库。

在确认光谱库的准确性并分离GGFP信号与组织自动荧光背景后，利用同一库将研究的所有图像解混合。对于捕捉冷冻后提取的DNA，将整个大脑放在一个五毫升均质管中，其中包含两毫升的DNA解解缓冲液，并使用设置为50的均质剂使组织均质化。当组织完全均质化后，将一毫升的莱酸盐转移到脱氧核糖核酸和RNAse自由两毫升微离心管中，并按照制造商的协议分离DNA。

将 500 微升 100%乙醇添加到分离物中，然后通过反转混合样品。在室温下三分钟后，使用移液器将羊毛状DNA沉淀物转移到新的两毫升DNAse和RNASe自由管中。让样品风干一分钟，然后向管中加入一毫升 75%乙醇，并反转管子三到六次以清洗样品。

上次倒置后丢弃乙醇，然后每次洗涤用新鲜乙醇清洗DNA两次，正如刚刚证明的。最后一次洗涤后，将样品风干10秒钟，然后溶解在52微升8毫摩尔氢氧化钠中的DNA。将两微升的DNA等分物转至分光光度计小瓶，根据公式使用 A260 和 280 之间的吸收比量化样品中的 DNA 浓度。

使用额外的八毫摩尔氢氧化钠将样品的DNA浓度调整为每微升50毫微克，并使用开源底转设计网页门户设计特定于内部外源绿色GP序列的底像对，以便实时检测GP标签和侵入和殖民肿瘤的转移细胞的PCR。然后使用快速实时 PCR 试剂和实时 PCR 机，支持快速实时 PCR 协议，以便对样品进行实时定量 PCR 分析。为了检测肺部转移性乳腺癌细胞，使用解剖剪刀打开胸腔，切过心脏和胸腺以暴露气管。

将一个22表针连接到一个10毫升的注射器，其中包含Bouin溶液到气管中，并压抑柱塞，直到折叠的肺肿了约两毫升溶液。一旦肺被充气，取出注射器和针头，将整个肺转移到含有新鲜 Bouin 溶液的 15 毫升管中。轻轻反转管子几次，然后离开组织在室温下浸泡24小时。

第二天，用水冲洗肺部，将样品放入70%乙醇管中。然后使用解剖显微镜计算肺部表面转移性白色斑块和结节的数量。钳子肿瘤体积测量是评估治疗效果的成熟方法。

为了获得研究组之间的可比信号，必须进行成像前BLI动力学研究，以确定最佳成像时间框架。由于信号与背景比率优越，与GP方法相比，整个体内的BLI在检测低电平转移信号方面相当敏感。然而，由于GP分子的稳定性质，研究人员有足够的时间在捕获目标器官的GGF信号之前处理尸体在双记者研究中。

这个真实的例子演示了卡钳肿瘤大小测量如何扭曲数据解释，因为这个异种移植失去了大部分可行的肿瘤细胞含量，同时仍然保持其大质量和形状。通过实时PCR进行分子检测，还可以利用外源性GP DNA测序，在正畸乳腺癌模型中提供脑转移的令人信服的证据，因为转染的GGFP DNA序列在人类或啮齿动物中并不自然存在。植入点应与癌症恶性肿瘤在生理和解剖学上有关。

肿瘤基因和蛋白质表达都可以在原位和远点位进行评估，转移细胞可以分离，以进一步表征。