巨噬细胞报告器细胞分析，以检查聚合物表面的吸附蛋白层上的收费类似受体介导NF-kB/AP-1信号

该协议能够快速评估在吸附蛋白层培养的记者巨噬细胞中的NF-kappa-B和AP-1活性，以及细胞信号通路（如收费受体）对该反应的贡献。该技术的主要优点是它的简单性，允许细胞培养超自然使用直接酶分析快速分析NF-kappa-B和AP-1活性。首先在烟罩中以每毫升20毫克的最终浓度溶解氯仿中的PMMA。

在小瓶中放置一个磁搅拌棒，搅拌混合物至少两个小时。当所有固体溶解后，将 PMMA 溶液的 400 微升转移到每个玻色玻璃显微镜的中央，每个玻色玻璃显微镜在旋转涂布器上按照计划条件滑动，然后以每分钟 3，000 次旋转的速度将 PMMA 旋转到幻灯片上两分钟。然后将旋转涂层的幻灯片存放在 70% 乙醇喷洒的清洁盒中。

接下来，在生物安全柜中，使用无菌钳子和无菌技术将八室粘井连接到 PMMA 涂层滑轨上，用力压在每口粘井的顶部，以确保它们牢固地连接。注意将粘性孔与显微镜幻灯片的边缘对齐，以便所有孔都连接到幻灯片上，并且不会泄漏。在37摄氏度下孵育粘性良好的滑梯过夜，以确保密封。

然后在每口井中加入200微升细胞培养级无内毒素水，在室温下进行60分钟的孵育，第二天早上测试密封。在孵化结束时，吸水，注意不要打扰PMMA涂层。每井用300微升新鲜无内毒素水清洗三次，每次洗涤一小时，然后一次12小时和一次24小时清洗，然后使用以去除任何剩余的溶剂。

然后紫外线对幻灯片进行消毒 30 分钟。为了获得3T3细胞解酶，当3T3细胞培养物在T150培养瓶中达到70%的汇合时，用5毫升PBS洗涤每个培养物，并在37摄氏度下用5毫升动物源性重组细胞分离酶处理，每瓶37度，用3至5分钟。在孵育结束时，轻轻倾斜每个烧瓶来回几次，以分离细胞，然后用每培养的五毫升PBS中和酶。

将分离的细胞集中到一个50毫升的离心管中，并使用移液器分解任何细胞团。计数后，通过离心收集细胞。吸升液，并在新鲜PBS中以每毫升浓度的1倍10再给6个细胞。

然后将细胞冷冻在零下80摄氏度的冰柜中至少两个小时，直到样品完全冷冻，然后将冷冻细胞溶液放入37摄氏度的水浴中，直到完全解冻。为了评估吸附蛋白层对收费样受体中继的NF-kappa-B/AP-1活性的影响，在适当大小的烧瓶中将记者巨噬细胞生长到70%汇合后，使用适当的酶分离溶液分离细胞，如所证明的。在测定介质中，每毫升浓度的细胞浓度为7.3倍至5个细胞，并在三根管子之间均匀地将细胞等匀。

用每毫升一微克的TLR4抑制剂治疗第一管细胞，在室温下60分钟，用每毫升50微克抗TLR2抗体治疗第二管，在室温下30分钟，在室温下将第三管留在室温下，无需治疗。当细胞孵育时，每个情况在三个粘性孔中加入200微升的乳酸和10%的胎儿牛血清。允许蛋白质在37摄氏度下吸附，在适当的实验期间，然后用新的巴斯德移液器为每井吸进蛋白质溶液，并洗涤粘性井表面三次，每井用250微升PBS，每次洗涤5分钟。

在记者宏噬细胞治疗结束时，每井加入200微升细胞溶液。将 Pam3CSK4 添加到每毫升 150 毫微克的最终浓度中，以两个孔作为 TLR2 正对照，如示意图所示。对于 TLR4 阳性控制，将脂多糖添加到每毫升 1.5 微克的最终浓度中，以两口井。

在37摄氏度下20小时后，每口井中20微升的上经液在96孔的板块中重复，包括三口井，每口有20微升的检测介质，以及背景控制。接下来，在每口井中加入200微升的SEALP检测试剂，用胶粘剂密封覆盖板，在37摄氏度下孵育2个半小时。将上经液的剩余部分转移到每粘井一个1.5毫升的管中，通过离心沉淀碎屑。

然后将超级钠转移到新的1.5毫升管中，用于零下80摄氏度的储存，由ELISA进行下游的发炎细胞因子分析。在孵化结束时，从板中取出胶粘剂密封，并在 635 纳米的板读卡器上读取吸光度。将 PMMA 涂层显微镜浸泡在 70%乙醇中一小时，可去除 PMMA 涂层，而 70% 乙醇和紫外线灭菌均不会影响 fPTFE 涂层盖玻片的水接触角度。

西方对3T3 lysates的印迹分析揭示了HMGB1和热休克蛋白60的存在，这两种有据可查的损伤相关分子模式。TLR配体从赖酸盐吸附到聚合物表面，可以通过在蛋白质吸附的聚合物表面培养记者巨噬细胞20小时，然后通过酶测定间接评估NF-kappa-B/AP-1活性来证实。在抑制TLR2或TLR4信号后，此活性降低。

此外，与吸附的FBS或血浆相比，记者巨噬细胞显著增加了NF-kappa-B/AP-1活性，以响应吸附的赖酸盐，并且没有预吸附的蛋白质。此外，与血清相比，血清中稀释的少量酸盐诱导的NF-kappa-B/AP-1反应显著增加，有效稀释程度最低取决于聚合物表面。为避免涂层表面的内毒素污染，在清洁区域工作，不使用时覆盖表面，并使用细胞培养分级水和缓冲液进行冲洗。

按照这个程序，可以对剩余的超级物进行免疫测定，以评估蛋白质分泌，巨噬细胞可以通过流细胞测定和qPCR基因表达分析进行分析。