Name: 巨噬细胞报告器细胞分析，以检查聚合物表面的吸附蛋白层上的收费类似受体介导NF-kB/AP-1信号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学习利用巨噬细胞报告器检测吸附蛋白层上Toll样受体介导的NF-κB/AP-1信号活性。该方法通过酶学分析快速评估细胞培养上清液中的转录因子活性，为生物材料表面免疫反应研究提供简便高效的技术手段。

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作者衷心感谢加拿大卫生研究院项目（PTJ 162251）、女王大学参议院研究咨询委员会提供的运营资金，以及加拿大创新基金会约翰·埃文斯领导基金（项目编号 34137）和安大略省研究与创新部研究基金（项目编号 34137）提供的基础设施支持。L.A.M. 获得了女王大学 R. Samuel McLaughlin 研究员奖学金、加拿大自然科学与工程研究理事会加拿大研究生奖学金硕士奖项以及安大略省研究生奖学金的支持。作者谨此感谢 Myron Szewczuk 博士慷慨赠送 NF-κB/AP-1 报告基因巨噬细胞细胞系，以及 Michael Blennerhassett 博士和 Sandra Lourenssen 博士提供凝胶成像系统和酶标仪的使用。

1. 培养基与试剂的配制
<ol>
	<li>制备成纤维细胞培养基。将450 mL的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、50 mL胎牛血清（FBS）和5 mL青霉素/链霉素混合。4 °C保存，可保存最长3个月。</li>
	<li>以50 mL分装制备报告巨噬细胞生长培养基。将45 mL DMEM、5 mL FBS、5 μg/mL支原体清除试剂（材料表）和200 μg/mL博来霉素D1（材料表）混合。4 °C保存，可保存最长3个月。</li>
	<li>以50 mL分装制备报告巨噬细胞检测培养基。将45 mL DMEM、5 mL热灭活胎牛血清（HI-FBS）、5 μg/mL支原体清除试剂和200 μg/mL博来霉素D1混合。4 °C保存，可保存最长3个月。</li>
</ol>
2. 使用聚甲基丙烯酸甲酯包被细胞培养表面
<ol>
	<li>在20 mL玻璃闪烁瓶中，将聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）溶于氯仿，配制成20 mg/mL的溶液（例如，将100 mg PMMA溶于5 mL氯仿中）。在瓶中放入磁力搅拌子，搅拌至少2小时，直至所有固体完全溶解。 
	注意：氯仿吸入有害。务必在通风橱内操作，并佩戴PVA手套使用溶剂。</li>
	<li>使用移液器将400 µL PMMA溶液滴加至旋涂仪中硼硅酸盐玻璃载玻片的中心，以3000 rpm转速旋涂2分钟。根据实验所需数量制备载玻片，并额外准备3−5片用于水接触角测量。将载玻片存放于洁净盒中（用70%乙醇喷洒并擦拭），以备后续使用。 
	注意：旋涂常用于在平坦表面沉积一层薄而均匀的涂层。旋涂仪通过高速旋转基底，利用离心力将涂覆液均匀铺展在表面。
	<ol>
		<li>使用接触角测量仪，在额外制备的涂层载玻片表面随机选取两个位置测量水接触角，以确认玻璃表面已完全被聚合物覆盖。 
		注意：水接触角测量应使用最高纯度的水（例如，玻璃三重蒸馏水）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在生物安全柜（BSC）中，使用无菌镊子按照无菌操作技术将8孔粘性小室固定在PMMA涂层载玻片上。用力按压粘性小室顶部，确保其牢固粘附。将带有粘性小室的载玻片在37 °C孵育过夜，以确保密封牢固。
	<ol>
		<li>通过向每个小室加入200 µL细胞培养级（无内毒素）水来测试粘性小室的密封性。室温（RT）孵育60分钟，确认无泄漏后方可继续操作。吸除水分时注意不要破坏PMMA涂层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在使用前，通过向每个小室加入300 µL无内毒素水，分别孵育1小时（三次）、12小时和24小时，进行无内毒素水清洗，以去除残留溶剂。</li>
	<li>检测用于细胞培养的载玻片的内毒素浓度。在每张载玻片的一个小室中加入200 µL无内毒素试剂水（材料表），孵育1小时。使用终点显色法内毒素检测试剂盒（材料表）测定提取液中的内毒素浓度。 
	注意：以下方案专用于材料表中所列的内毒素检测试剂盒。</li>
	<li>本实验中仅可使用经认证为无热原（即无内毒素）的水及耗材（如移液器吸头、微量离心管和孔板）。此外，用于制备聚合物涂层表面的所有玻璃器皿在使用前应通过干热灭菌法（250 °C，30分钟）进行去热原处理10。如本处所述，在提取液中检测内毒素可能导致对材料表面内毒素水平的低估11,12。因此，建议在开发聚合物涂层方案时，直接在含有涂层样品的小室中进行内毒素检测反应（即对测试样品[试剂水]或加标对照执行步骤2.5.4−2.5.6），以确保在涂层过程中不会无意引入内毒素污染源。
	<ol>
		<li>将所有测试样品（即提取液）和内毒素检测试剂恢复至室温（RT）。用检测缓冲液重悬显色试剂，用试剂水溶解内毒素标准品，溶解5分钟后轻轻混匀再使用。不使用时，所有瓶口均需用石蜡膜封盖。</li>
		<li>通过在试剂水中对内毒素标准品进行系列稀释，配制涵盖检测范围下限至上限的5−8个点的标准稀释曲线。</li>
		<li>为控制测试样品中内毒素检测可能存在的增强或抑制效应，通过在未使用的测试样品溶液中稀释已知量的内毒素，制备阳性对照（也称加标对照或加标样品）。 
		注意：阳性对照的浓度应与标准曲线中段某一标准品浓度相同。若加标内毒素的回收量（即阳性对照浓度减去未加标测试样品浓度）在加标量标称浓度的50−200%范围内，则可认为提取液对检测无显著干扰。</li>
		<li>向96孔板的每个孔中以复孔或三复孔形式加入50 µL标准品、样品或加标对照。以试剂水作为空白对照。</li>
		<li>向每个孔中快速加入50 µL显色试剂，并记录向所有孔加完试剂所需的时间。加完后用压敏封板膜封板，在37 °C孵育（孵育时间依试剂批次而定，具体见显色试剂盒附带的分析证书说明）。或者，在孵育期间每15分钟检查一次，直至所有标准品孔均出现颜色变化。</li>
		<li>孵育结束后，向每个孔中加入25 µL 50%乙酸（终浓度为每孔10%乙酸）以终止反应。加入乙酸的顺序应与加入显色试剂的顺序一致。使用酶标仪在405 nm波长读取吸光度。吸除液体后弃去孔板。 
		注意：加入乙酸的时间应与加入显色试剂的时间相近（±30秒）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在进行细胞培养实验前，对载玻片进行30分钟紫外（UV）灭菌。</li>
</ol>
3. 使用聚二甲基硅氧烷包被细胞培养表面
<ol>
	<li>按10:1的质量比（基础剂：固化剂）混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体。在生物安全柜中，用移液器将约10 mL的PDMS基础剂加入无菌管中。称量该管重量，然后缓慢加入固化剂，直至添加量达到10%。 
	注意：使用PDMS试剂时应在通风良好的环境中操作，并佩戴护目镜以避免接触眼睛。</li>
	<li>使用无菌血清移液管头搅拌并反复吹打，充分混匀弹性体溶液。将约200 μL溶液加入48孔板的每个孔中。缓慢倾斜孔板，确保各孔被弹性体溶液完全覆盖。</li>
	<li>将含有弹性体的孔板放入真空烘箱中，设置条件为50 cmHg、40 °C。取下孔板盖，并用单层擦拭纸覆盖，防止其他碎屑落入孔内。孵育至少48 h。
	<ol>
		<li>通过目视检查确认各孔已完全包被。在取出前，用无菌移液管头轻轻触碰，确保弹性体已完全固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每个孔中加入300 µL 70%乙醇（使用纯乙醇和无内毒素水配制），在室温下孵育1 h。吸去乙醇后，进行无内毒素水洗涤：向每个孔中加入300 µL无内毒素水，分别在使用前孵育1 h（共三次）、12 h和24 h，以去除任何残留溶剂。
	<ol>
		<li>在每块板的三个孔中各加入200 µL无内毒素水，孵育1 h。使用终点显色法内毒素检测试剂盒测定水提取物中的内毒素浓度（步骤2.5.1−2.5.6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用氟化聚四氟乙烯包被细胞培养表面
<ol>
	<li>在20 mL玻璃闪烁瓶中配制1 mg/mL的氟化聚四氟乙烯（fPTFE）溶液（例如，将10 mg fPTFE加入10 mL氟化溶剂中）[材料表]。在瓶中放入一个磁力搅拌子，持续搅拌至少24小时，直至所有固体完全溶解。</li>
	<li>向每个聚苯乙烯48孔板孔中加入约150 μL聚合物溶液（即未经组织培养处理的孔板）。缓慢倾斜孔板，确保所有孔均被聚合物溶液完全覆盖。盖上盖子。
	<ol>
		<li>为确保孔板孔的有效fPTFE包被，应将玻璃盖玻片进行fPTFE包被，并用于水接触角测量（步骤4.3.1）。将盖玻片放入24孔板的孔中。向每个含有盖玻片的孔中加入约400 μL聚合物溶液。使用无菌镊子将盖玻片压下，确保其完全浸没在聚合物溶液中，并盖上孔板盖子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有聚合物溶液和/或盖玻片的孔板置于真空烘箱中，设置压力为50 cmHg，温度为40 °C。打开盖子，并用单层擦拭纸覆盖，以防止其他碎屑落入孔中。孵育至少48小时。
	<ol>
		<li>使用接触角测量仪测定fPTFE包被盖玻片的水接触角，以确认包被效果。 
		注意：水接触角测量应仅使用最高纯度的水（例如，玻璃三重蒸馏水）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每孔加入300 µL 70%乙醇（使用无水乙醇和无内毒素水配制），在室温下孵育1小时。吸除乙醇后，用无内毒素水洗涤：向每孔加入300 µL无内毒素水，在使用前分别孵育1小时（共三次）、12小时和24小时，以去除残留溶剂。
	<ol>
		<li>在每块板的三个孔中各加入200 µL无内毒素水，孵育1小时。使用终点显色法内毒素检测试剂盒测定水提取物的内毒素浓度（步骤2.5.1−2.5.6）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在进行细胞培养实验前，对孔板进行30分钟的紫外灭菌。</li>
</ol>
5. 从3T3细胞制备裂解液
<ol>
	<li>将3T3细胞在多个T150培养瓶中培养至70%汇合度。消化细胞时，吸除培养基，用5 mL PBS洗涤培养表面，随后吸除PBS。加入5 mL无动物来源、重组细胞解离酶（材料表），于37 °C孵育3−5分钟。</li>
	<li>通过轻轻前后倾斜培养瓶使细胞脱落。加入5 mL PBS以中和用于细胞解离的重组酶。将脱落的细胞从培养瓶转移至离心管中，并用移液器混匀。使用血细胞计数板和活细胞染色剂进行活细胞计数。 
	注意：选择可通过PBS稀释中和的细胞解离酶，以避免在裂解液制备过程中引入血清来源蛋白。若使用胰蛋白酶消化细胞，则需用含血清的溶液中和，并额外进行一次PBS洗涤，以减少血清蛋白带入裂解液。</li>
	<li>以200 × g离心5分钟。吸除上清液，用原始体积（即每瓶10 mL × 培养瓶数量）的PBS重悬细胞，以去除残留培养基。重复一次。</li>
	<li>再次以200 × g离心5分钟，吸除上清液。加入适量PBS，使最终细胞浓度达到1 × 106 个细胞/mL。将细胞悬液置于-80 °C冰箱中冷冻至完全凝固（至少2小时）。</li>
	<li>将细胞悬液在37 °C水浴中解冻。完全解冻后，重新放回-80 °C冰箱中冷冻至完全凝固。共重复3次冻融循环。</li>
	<li>对细胞裂解液进行多种稀释度（如1/100、1/200、1/500、1/1000）的微量双辛可宁酸（BCA）蛋白定量检测，以确定蛋白浓度。将细胞裂解液稀释至蛋白浓度为468.75 µg/mL，分装后于-80 °C保存以备后续使用。 
	注意：在48孔板中最终蛋白浓度为125 µg/cm2（基于单个孔的表面积0.75 cm2）。</li>
	<li>通过Western blot检测裂解液中损伤相关分子模式分子（DAMPs）的存在情况（如热休克蛋白60 [HSP60]、高迁移率族蛋白B1 [HMGB1]），将40−60 µg裂解液蛋白加入上样缓冲液，上样至厚度为1.5 mm的10%聚丙烯酰胺凝胶，并按照标准Western blot流程操作。</li>
</ol>
6. 评估吸附蛋白层和Toll样受体对巨噬细胞NF-κB活性的影响
注意：有关实验流程示意图和孔板布局，请分别参见图1A和补充图1。
<ol>
	<li>将报告基因巨噬细胞在适当大小的培养瓶中培养至70%融合度。吸除培养基，用PBS洗涤表面，再吸除PBS。加入重组细胞解离酶，并在37 °C孵育8分钟。</li>
	<li>通过用力轻敲培养瓶侧面使细胞脱落。加入等体积含10%胎牛血清（FBS）的生长培养基以终止重组细胞解离酶的作用。使用血细胞计数板和活细胞染料进行活细胞计数。 
	注意：报告基因巨噬细胞经细胞解离酶孵育8分钟后，预期存活率约为90%。</li>
	<li>在200 × g条件下离心细胞5分钟。吸除上清液，并用原始体积的PBS重悬细胞以洗涤。再次离心后，将细胞重悬于检测培养基（含热灭活FBS）中，浓度为7.3 × 105 个细胞/mL。</li>
	<li>将细胞悬液分装至3个不同的离心管中：TLR4抑制剂组、抗TLR2抗体组和未处理组。分别在室温下用1 µg/mL TLR4抑制剂孵育60分钟，或用50 µg/mL抗TLR2抗体孵育30分钟。</li>
	<li>向48孔板（或等效板）中每孔加入200 µL裂解液、10% FBS、10%商用小鼠血浆（材料表）或蛋白溶液混合物，于37 °C孵育所需时间（例如30分钟、60分钟或24小时），使蛋白吸附。使用新的巴斯德吸管分别吸除各孔中的蛋白溶液，每孔用250 µL PBS洗涤5分钟，随后吸除PBS。重复洗涤共3次。 
	注意：根据所需的吸附时间，此步骤可能需要在实验流程早期开始。请相应调整实验流程。</li>
	<li>在TLR4抑制剂或抗TLR2抗体孵育结束后，用移液器吹打使细胞重悬。向每个孔中加入200 µL细胞悬液。</li>
	<li>对于TLR2阳性对照组，加入Pam3CSK4至终浓度为150 ng/mL；对于TLR4阳性对照组，加入脂多糖（LPS）至终浓度为1.5 µg/mL。将细胞在37 °C孵育20小时。</li>
	<li>从每个孔中取20 µL上清液，重复加样至96孔板中。同时设置三孔仅含20 µL检测培养基作为空白背景对照。每孔加入200 µL SEAP报告基因检测试剂。用粘性封板膜封板，在37 °C孵育2.5小时。 
	注意：孵育时间可能因实验条件而异，应优化至阳性对照孔与阴性对照孔之间的吸光度差异显著。
	<ol>
		<li>将剩余的上清液转移至1.5 mL离心管（每孔一管）。在1,000 × g条件下离心10分钟以沉淀残余碎片。将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，并于-80 °C保存。通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）分析上清液中促炎性细胞因子（如TNF-α、白细胞介素6）的存在情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除粘性封板膜。使用酶标仪在635 nm波长下读取吸光度。吸除液体并丢弃微孔板。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们实验室的一个主要研究方向是宿主对固体生物材料软组织植入物的反应，特别是植入手术过程中造成的细胞损伤如何影响宿主反应。本文所述工作描述了使用报告基因巨噬细胞系和体外制备的含损伤相关分子模式（DAMP）的细胞裂解液进行的初步实验，旨在研究细胞损伤（例如植入手术中发生的损伤）所释放的分子对巨噬细胞响应生物材料的影响。采用成纤维细胞裂解液来模拟因生物材料植入导致的细胞损伤及DAMP的释放。选择成纤维细胞制备裂解液，是因为成纤维细胞在软组织中广泛存在，并且能够分泌多种细胞外基质（ECM）蛋白，包括纤连蛋白18。采用冻融循环作为裂解方法，以同时释放细胞内和细胞外基质来源的DAMP，这与实际植入环境中的情况相似。制备裂解液时未使用蛋白酶抑制剂。尽管像冻融循环这样的非受控细胞裂解可能导致蛋白酶释放，进而降解DAMP，但这些酶在植入手术造成细胞损伤时同样可能存在于生物材料植入环境中。通过Western blot（图1B；HMGB1和HSP60）和SEAP报告基因检测（图...

异物反应（FBR）是一种慢性宿主反应，可通过持续释放炎性介质以及阻碍植入材料与周围组织之间的整合，对植入材料或装置（例如药物递送装置、生物传感器）的性能产生负面影响1。这种先天免疫反应由植入手术引发，其特征是在植入物周围长期存在先天免疫细胞及纤维囊的形成1。在材料宿主反应的背景下，巨噬细胞与材料之间的相互作用对宿主反应的进展及异物反应的发生具有重要影响1。巨噬细胞是一类多样化的先天免疫细胞群体，可从组织驻留的巨噬细胞群体或血液中的单核细胞来源巨噬细胞被募集至植入部位。它们在植入后不久即开始在植入部位聚集，并在数天内成为植入微环境中的主要细胞群体。附着于材料表面的巨噬细胞，以及通过巨噬细胞融合形成的异物巨细胞（FBGC），可在植入物表面持续存在，直至植入物的整个生命周期2,3。因此，由于巨噬细胞在协调异物反应典型阶段——急性炎症反应、组织重塑以及纤维化组织形成——中发挥关键作用，被认为是异物反应中的关键效应细胞1。
Toll样受体（TLRs）是一类模式识别受体，由包括巨噬细胞在内的多种免疫细胞表达，在炎症和伤口愈合过程中发挥重要作用。除了病原体来源的配体外，TLRs还能够结合内源性分子，即所谓的损伤相关分子模式（DAMPs），这些分子在细胞坏死过程中释放，并激活炎症信号通路，从而诱导促炎性细胞因子的产生4。我们及其他研究者提出，软组织生物材料植入过程中造成的损伤会释放DAMPs，这些DAMPs除了与血液蛋白一起吸附到生物材料表面外，还会调节后续的细胞-材料相互作用5,6。当巨噬细胞与植入物表面吸附的蛋白层相互作用时，其表面的TLRs可能识别吸附的DAMPs，进而激活促炎性信号级联反应，导致NF-κB和AP-1转录因子的活化以及促炎性细胞因子的产生。我们先前已证实，与仅吸附血清或血浆（即不含DAMPs）的表面相比，小鼠巨噬细胞在含有DAMPs的吸附蛋白层上表现出显著增强的NF-κB/AP-1活性以及肿瘤坏死因子α（TNF-α，一种促炎性细胞因子）的分泌；该反应主要由TLR2介导，而TLR4的作用较小5。
本方案中使用的NF-κB/AP-1报告基因巨噬细胞系（材料表）是一种便捷的方法，可用于检测巨噬细胞中NF-κB和AP-1的相对活性5,7,8。结合TLR通路抑制剂，该细胞系是研究TLR激活及其在多种刺激下介导炎症反应中作用的有力工具5,7,8。该报告细胞系源自一种经修饰的小鼠类巨噬细胞系，可在NF-κB和AP-1转录因子激活后稳定分泌胚胎型碱性磷酸酶（SEAP）9。随后可通过比色法碱性磷酸酶酶学检测（材料表）定量SEAP的表达水平，从而间接反映NF-κB/AP-1的活性。由于NF-κB和AP-1位于多种细胞信号通路的下游，因此可使用针对特定TLR（如TLR2）或TLR接头分子（如MyD88）的中和抗体或抑制剂，验证特定通路的作用。本文所述方法提供了一种简单、快速的手段，用于评估在模拟植入性生物材料的体外模型中，多种带有吸附蛋白层（包含血液蛋白和损伤相关分子模式分子DAMPs）的聚合物表面刺激下，TLR信号通路在小鼠巨噬细胞反应中的贡献。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;细胞培养试剂&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠/人 CD282（TLR2）</td><td>Biolegend</td><td>121802</td><td></td></tr><tr><td>CLI-095（TLR4抑制剂）</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-CLI95</td><td></td></tr><tr><td>C57 补体血浆 K2 EDTA 10 ml，创新级，美国来源</td><td>InnovativeResearch</td><td>IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml</td><td>小鼠血浆</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td>无钙，无镁</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），研究级</td><td>Wisent</td><td>98150</td><td></td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-EKLPS</td><td>大肠杆菌K12脂多糖</td></tr><tr><td>NIH/3T3 成纤维细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Pam3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td>合成三酰基化脂肽 - TLR1/2 配体</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-MPP</td><td>支原体清除试剂</td></tr><tr><td>RAW-Blue 细胞</td><td>Invivogen</td><td>原始数据-sp</td><td>NF-кB&amp;kappa;NF-κB/AP-1 报告基因巨噬细胞系</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1X）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12604021</td><td>无动物源性重组细胞解离酶</td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-ZN-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;试剂盒与检测方法&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠IL-6 ELISA预包被板</td><td>Biolegend</td><td>B213022</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 预包被板，小鼠 TNF-&amp;alpha;</td><td>Biolegend</td><td>B220233</td><td></td></tr><tr><td>内毒素（大肠杆菌）— 控制标准内毒素（CSE）</td><td>Cape Cope 公司合伙人</td><td>E0005-5</td><td>显色内毒素检测中标准曲线用内毒素</td></tr><tr><td>LAL 水，100 mL</td><td>Cape Cope 公司合伙人</td><td>WP1001</td><td>与显色内毒素检测联用</td></tr><tr><td>微量BCA蛋白测定</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI23235</td><td></td></tr><tr><td>鲎变形细胞溶解物（LAL）Pyrochrome 内毒素检测试剂盒</td><td>Cape Cope 公司合伙人</td><td>C1500-5</td><td>显色内毒素检测试剂</td></tr><tr><td>QUANTI-Blue 碱性磷酸酶检测试剂</td><td>Invivogen</td><td>rep-qb2</td><td>碱性磷酸酶检测法用于间接测量 NF-&amp;kappa;B/AP-1 活性</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;聚合物涂层试剂&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯仿，无水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306-1L</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P006EAAN</td><td>Sigma：试剂级酒精，无水，676829-1L</td></tr><tr><td>直锥形细尖镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-113</td><td></td></tr><tr><td>Fluorinert FC-40 溶剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9755-100ML</td><td>用于氟化聚四氟乙烯的氟化溶剂</td></tr><tr><td>细胞培养级水（无内毒素）</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30529LS</td><td></td></tr><tr><td>聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>182230-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 弹性体试剂盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>50822180</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯-AF（fPTFE）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>469610-1G</td><td>Poly[4,5-二氟-2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧戊烯-co-四氟乙烯]</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;耗材&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>粘性板密封膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 微量离心管，1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-155</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃闪烁瓶，带白色聚丙烯瓶盖</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>透明 PS 48 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-52</td><td></td></tr><tr><td>透明 TCPS 96 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-2C</td><td></td></tr><tr><td>透明 TCPS 48 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1C</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，圆形</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 组织培养处理的锥形瓶，T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-10</td><td></td></tr><tr><td>sticky-Slide 8 孔板</td><td>Ibidi</td><td>80828</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>组织培养处理的锥形瓶，T150</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-48</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于在聚合物表面吸附蛋白层上研究toll样受体介导的nf-κb/ap-1信号通路的巨噬细胞报告细胞检测方法

A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces

植入性生物材料引发的持续性炎症宿主反应，即异物反应，是生物医学装置和组织工程构建物在研发与应用过程中面临的重要挑战。巨噬细胞作为一种先天免疫细胞，在异物反应中起着关键作用，因为它们会在植入物部位长期存留，因此常被用于研究这种有害的宿主反应。许多生物材料研究人员已证实，植入材料表面吸附的蛋白质层会影响巨噬细胞的行为，进而影响宿主反应。本文所述方法介绍了一种体外模型，该模型利用在聚合物生物材料表面含有细胞损伤分子的吸附蛋白层，来评估巨噬细胞的反应。采用NF-кB/AP-1报告基因巨噬细胞系及相应的比色法碱性磷酸酶检测，作为快速间接检测NF-кB/AP-1转录因子活性的方法，以模拟体内生物材料表面形成的含有血液蛋白和损伤相关分子模式的复杂吸附蛋白层对巨噬细胞信号通路的影响。

测试了聚合物涂层表面的清洁方法，以确保涂层未被破坏，否则水接触角会发生变化，接近未涂层的玻璃盖玻片（图2）。发现将PMMA涂层的载玻片浸泡在70%乙醇中1小时会导致PMMA涂层被去除（图2，左图），这可能是由于PMMA在80 wt%乙醇中具有溶解性13。因此，PMMA涂层表面仅采用30分钟紫外灭菌进行清洁。PMMA涂层的浓度此前已优化5。PDMS的清洁采用70%乙醇浸泡1小时，而未使用紫外灭菌，因为紫外光可引起PDMS的链断裂并影响其表面润湿性14。70%乙醇浸泡和紫外灭菌均未影响fPTFE涂层盖玻片的水接触角（图2，右图），因此这两种方法依次联合使用以清洁fPTFE涂层。fPTFE涂层的方法此前已由Grainger课题组描述15。
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本方案为研究人员提供了一种快速、间接的方法，用于检测小鼠巨噬细胞系在响应多种聚合物表面及吸附蛋白层时，TLR依赖性的NF-кB/AP-1转录因子活性，这些表面和蛋白层可模拟生物材料植入物的微环境。

一种用于在聚合物表面吸附蛋白层上研究Toll样受体介导的NF-κB/AP-1信号通路的巨噬细胞报告细胞检测方法

植入生物材料后宿主持续存在的炎症反应，即异物反应，是生物材料研发中的重大挑战……

本方案可实现对培养在吸附蛋白层上的报告型巨噬细胞中 NF-κB 和 AP-1 活性的快速评估，并分析细胞信号通路（如 Toll 样受体）在该反应中的作用。该技术的主要优势在于其简便性，可通过简单的酶法检测快速分析细胞培养上清液中的 NF-κB 和 AP-1 活性。首先，在通风橱中，将 PMMA 溶解于氯仿中，配制成终浓度为 20 毫克/毫升的溶液，置于 20 毫升玻璃闪烁瓶中。在小瓶中放入一个磁力搅拌子，搅拌混合物至少两小时。当所有固体完全溶解后，将400微升PMMA溶液转移至每个硼硅酸盐玻璃载玻片的中心位置（根据计划的实验条件），置于旋涂仪上，以每分钟3,000转的速度旋涂两分钟。随后将旋涂后的载玻片存放于经70%乙醇喷洒消毒的洁净盒中。接下来，在生物安全柜中，使用无菌镊子和无菌操作技术将八孔粘性小室固定到PMMA涂层载玻片上，用力按压每个粘性小室的顶部，确保其牢固粘附。注意将粘性小室与显微镜载玻片的边缘对齐，以确保所有小室均粘附在载玻片上且不会泄漏。将粘附有粘性小室的载玻片在37摄氏度下孵育过夜，以确保密封牢固。然后每孔加入 200 µL 细胞培养级无内毒素水，在室温下孵育 60 分钟，次日早晨检测密封性。孵育结束后，吸去水分，注意不要破坏 PMMA 涂层。每孔用 300 µL 新鲜的无内毒素水洗涤三次，每次洗涤 1 小时，使用前再分别进行一次 12 小时和一次 24 小时的洗涤，以去除任何残留的溶剂。然后对载玻片进行30分钟的紫外灭菌。为获得3T3细胞裂解物，当T150培养瓶中的3T3细胞培养物达到70%融合度时，用5毫升PBS洗涤每瓶细胞，并在每瓶中加入5毫升无动物来源的重组细胞解离酶，在37°C下处理3至5分钟。孵育结束后，轻轻前后倾斜每个培养瓶数次，使细胞脱离，随后每瓶加入5毫升PBS中和酶活性。将解离的细胞汇集至一个50毫升离心管中，用移液器吹打分散任何细胞团块。计数后，通过离心收集细胞。吸除上清液，并用新鲜PBS将细胞重悬至浓度为1 × 10⁶ 个细胞/毫升。然后将细胞置于–80摄氏度冰箱中冷冻至少两小时，直至样品完全冻结，再将冻存的细胞悬液放入37摄氏度水浴中，直至完全解冻。为评估吸附性蛋白层对Toll样受体介导的NF-κB/AP-1活性的影响，在适当大小的培养瓶中将报告巨噬细胞培养至70%融合度后，用适当的酶解离溶液将细胞解离，操作如所示。用检测培养基将细胞重悬至浓度为7.3 × 10⁵ 个细胞/毫升，并将细胞悬液等量分装至三个离心管中。将第一管细胞在室温下用浓度为1微克/毫升的TLR4抑制剂处理60分钟，将第二管细胞在室温下用浓度为50微克/毫升的抗TLR2抗体处理30分钟，第三管细胞在室温下不作任何处理。在细胞孵育的同时，每种条件下向三个黏附孔中分别加入200微升裂解液和10%胎牛血清。让蛋白质在37摄氏度下吸附适当的实验时间，然后使

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巨噬细胞报告器细胞分析，以检查聚合物表面的吸附蛋白层上的收费类似受体介导NF-kB/AP-1信号

唾液酸酶检测是一种简便的技术方法，可用于阐明TLR感受器在活体巨噬细胞细胞表面受体水平上识别微生物感染的新型分子机制及其在炎症性疾病中的作用。...

检测Neu1唾液酸酶活性在调控TOLL样受体激活中的作用

来源： Barbero, A. M., 等。 用于研究的荧光检测方法 结核分枝杆菌 与免疫受体SLAMF1的相互作用。 J. Vis. Exp. ( (2025)本视频展示了一种基于荧光的检测方法，用于研究巨噬细胞受体与结核分枝杆菌（Mycobacterium...

基于荧光的巨噬细胞受体与细菌抗原相互作用研究方法

本视频展示了一种检测巨噬细胞中Toll样受体（TLR）依赖性转录因子核因子κB（NF-κB）和激活蛋白-1（AP-1）活性的实验方法。当TLR识别损伤相关分子模式（DAMPs）后，会启动促炎性信号级联反应，从而激活NF-κB和AP-1。经基因工程改造的报告巨噬细胞在NF-κB和AP-1激活后会分泌胚胎碱性磷酸酶（SEAP），该酶的活性可被检测 通过...

一种用于检测巨噬细胞中 TLR 依赖性 NF-κB/AP-1 转录因子信号通路的实验方法

本视频展示了一种基于报告细胞的检测方法，用于筛选可抑制Toll样受体（TLR）信号通路的潜在生物活性纳米颗粒。该检测方法包括将脂多糖（LPS）与肽-金纳米颗粒杂合物混合后加入报告巨噬细胞中，这些细胞表达报告蛋白——分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）和荧光素酶。通过检测报告信号的变化，评估杂合物对LPS诱导的TLR信号通路的抑制作用。...

一种用于筛选抑制Toll样受体信号通路的生物活性纳米颗粒的检测方法

树突状细胞（DCs） 在Toll样受体8（TLR8）识别合成嘌呤类物质R848后，经黑素菌素（nigericin）激活NLRP3炎性小体，进而分泌IL-1β，因此IL-1β可用于检测NLRP3炎性小体的活性。通过细胞内细胞因子染色、免疫印迹和ELISA方法，可准确检测IL-1β的表达水平，从而评估NLRP3炎性小体的启动和激活状态。...

利用人单核细胞来源的树突状细胞中IL-1β检测NLRP3炎性小体的激活与活性测定

在本实验方案中，我们描述了利用 Amaxa Nucleofector 96 孔 Shuttle 系统将 siRNA...

利用RNA干扰技术研究小鼠巨噬细胞的先天免疫反应

我们介绍一种简单高效的生成人巨噬细胞的方案。通过双密度梯度离心法处理血沉棕黄层，分离单核细胞，随后在特氟龙涂层细胞培养袋中将其分化为巨噬细胞。该方法可最大化巨噬细胞产量，并便于后续实验的细胞收获。...

通过双梯度离心法分离人单核细胞及其在特氟龙涂层细胞培养袋中向巨噬细胞的分化

双梯度离心法，人单核细胞，巨噬细胞分化，特氟龙涂层培养袋，细胞培养，外周血单个核细胞，Ficoll密度梯度，Percoll梯度，单核细胞分离，巨噬细胞

本文介绍了一种利用荧光测定法定量分析贴壁巨噬细胞系吞噬荧光颗粒的实验方案。该方法可实现对颗粒内化及伴随发生的肌动蛋白聚合的高通量定量分析。...

高通量荧光测定法评估巨噬细胞吞噬作用与肌动蛋白聚合

我们描述了一种实验装置，利用全内反射荧光显微镜，在活体巨噬细胞中以前所未有的高分辨率三维可视化吞噬体的形成与闭合过程。该方法可实时监测吞噬杯底部、延伸的伪足，以及吞噬体断裂的精确位点。...

利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）进行“吞噬体闭合检测”以三维可视化吞噬体形成过程

Toll样受体（TLR）信号通路在多种人类炎症性疾病的病理生理过程中发挥重要作用，而通过生物活性纳米颗粒调控TLR反应有望在多种炎症状态下产生有益效果。基于THP-1细胞的报告细胞系统为筛选新型TLR信号通路抑制剂提供了一个多功能且可靠的筛选平台。...

筛选吞噬性免疫细胞中抑制Toll样受体信号通路的生物活性纳米颗粒

学习利用巨噬细胞报告器检测吸附蛋白层上Toll样受体介导的NF-κB/AP-1信号活性。该方法通过酶学分析快速评估细胞培养上清液中的转录因子活性，为生物材料表面免疫反应研究提供简便高效的技术手段。

一种用于在聚合物表面吸附蛋白层上研究Toll样受体介导的NF-κB/AP-1信号通路的巨噬细胞报告细胞检测方法

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