Name: 恒流中原发性人类内皮细胞的肺炎球菌感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 了解在剪切应力条件下利用人原代内皮细胞进行肺炎球菌粘附的显微监测技术。该方法可实时可视化细菌与血管von Willebrand因子弦的相互作用，为研究感染机制和血管完整性提供重要框架。

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该项目由德国研究联合会（DFG (BE 4570/4-1)）资助给 S.B.。

微流控细胞培养实验采用商业化的原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行。该公司在供体知情同意的情况下分离了这些细胞。本研究已获得德国巴登-符腾堡州医师协会伦理委员会批准，批准编号为219-04。
注意：实验所需材料请参见材料表。
1. 原代内皮细胞的预培养
<ol>
	<li>在37 °C下轻轻解冻一支含有1 × 105个来自三位不同供体的原代HUVEC的冻存甘油管，将细胞接种于25 cm2细胞培养瓶中，加入7 mL预热的内皮细胞生长培养基（ECGM，含补充剂，即用型）。 
	注意：原代内皮细胞在经历超过5次增殖周期后会丧失分化能力。因此，若需要高程度的细胞分化，仅可使用传代次数少于5次的细胞。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养60分钟，以促进细胞贴壁，随后更换ECGM培养基，以去除冷冻保存残留物。</li>
	<li>继续在37 °C、5% CO2的环境中培养细胞，直至形成亚融合的细胞层。 
	注意：HUVEC不可生长至完全融合状态，因为紧密的细胞间连接会影响后续在流动条件下形成稳定细胞层的能力。</li>
</ol>
2. 预培养 肺炎链球菌
注意：Streptococcus pneumoniae 属生物安全二级病原体，仅允许在生物安全二级实验室中进行培养。所有细菌操作均须在符合生物安全二级标准的洁净台中进行，严格避免气溶胶的产生，并使用带有气溶胶防护装置的离心机沉淀细菌。
<ol>
	<li>从始终保存在 -80 °C 的甘油储备液中取出肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）临床分离株 ATCC11733，接种于哥伦比亚血琼脂平板上，并在 37 °C、5% CO2 条件下培养过夜。</li>
	<li>准备 40 mL 添加了 1% 酵母提取物的 Todd Hewitt 液体培养基（THY），以及 15 mL pH 7.4 的无菌磷酸盐缓冲液（PBS），用于细菌培养和洗涤步骤。</li>
	<li>使用无菌试管进行细菌培养，并将菌体接种至液体培养基中。以未接种的液体培养基作为空白对照，通过分光光度法在 600 nm 处测定 1 mL 等分试样的吸光度，控制接种量。向液体培养基中加入菌体，直至其在 600 nm 处的光密度（OD600）达到 0.15。</li>
	<li>将接种后的液体培养基在 37 °C、5% CO2 条件下静置培养，并每隔 30 分钟使用塑料比色皿测定 1 mL 等分试样在 600 nm 处的 OD600 值。</li>
	<li>一旦细菌培养物的 OD600 达到 0.4（对应于对数生长期），立即在室温（RT）下以 1,000 × g 离心 10 分钟，收集菌体。 
	注意：切勿使肺炎链球菌培养物的 OD600 超过 1.0，因为高密度培养已知会触发细菌自溶，可能影响细菌的整体活力。</li>
	<li>用 10 mL PBS 轻柔重悬细菌沉淀，并在室温下以 1,000 × g 再次离心 10 分钟。</li>
	<li>将洗涤后的细菌沉淀用 1 mL PBS 轻柔重悬，并使用 PBS 作为空白对照，测定 10 µL 细菌悬液在 1 mL PBS 中的 OD600 值。</li>
	<li>将 PBS 中的细菌浓度调整至 OD600 为 2.0。根据先前测定的细菌计数，OD600 为 2.0 时相当于 2 × 109 菌落形成单位（CFU）。应立即进行感染实验，以防止细菌发生自溶。</li>
</ol>
3. 微流控条件下 HUVEC 内皮细胞的培养
<ol>
	<li>通过可控的蛋白水解作用将原代内皮细胞从细胞培养瓶中分离。在洁净台的无菌环境中进行以下步骤。准备15 mL无菌PBS用于洗涤步骤。
	<ol>
		<li>移除生长至亚融合状态的HUVEC细胞层中的ECGM培养基，并使用移液管加入10 mL PBS洗涤细胞层，以去除残留的细胞培养基。</li>
		<li>将洗涤后的HUVEC细胞与3 mL 37 °C预热的细胞解离液在37 °C下孵育5分钟，以实现细胞脱离。每分钟通过显微镜观察蛋白水解介导的细胞脱离情况。</li>
		<li>将脱离的细胞悬液用移液管转移至含有7 mL添加了2%胎牛血清（FCS）的ECGM培养基的离心管中，以终止蛋白水解反应，并在室温下以220 × g离心3分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，将HUVEC细胞重悬于250 µL添加了5% FCS和1 mM MgSO4的ECGM培养基中。取10 µL细胞悬液，使用Neubauer细胞计数板进行细胞计数，并将细胞浓度调整为4 × 106 个细胞/mL，所用培养基为添加了5% FCS和1 mM MgSO4的ECGM。 
		注意： 每次流式实验需准备30 mL添加了5% FCS和1 mM MgSO4的ECGM培养基。此后，该培养基组成统称为ECGMS培养基。将培养基中FCS浓度从2%提高至5%有助于HUVEC细胞在通道载玻片中的贴壁和维持细胞活力。培养基中的FCS和MgSO4成分在剪切应力条件下显著增强HUVEC细胞的贴壁稳定性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在通道载玻片中接种并培养HUVEC细胞。在洁净台的无菌环境中操作。细胞将在剪切应力条件下培养2天，随后进行细菌感染，并继续进行2小时的显微观察。
	<ol>
		<li>将通道载玻片、直径1.6 mm、长度50 cm的灌注系统、一份ECGMS培养基以及高度为0.4 µm的Luer接口通道载玻片置于37 °C、5% CO2的培养箱中平衡24小时，以减少气泡产生。 
		注意： 建议通过此步骤对塑料器材进行脱气，并对培养基、灌注管路和储液槽进行预热。若材料或液体曾存放于室温或冰箱中，加热时溶解于塑料和液体中的气体会释放出来，从而产生气泡。实验前对所有塑料组件进行脱气可消除此现象。每次将系统从培养箱中取出后，气体重新溶解的过程即重新开始。因此，在室温下操作应迅速，切勿将流体单元长时间置于培养箱外。</li>
		<li>使用移液器&#160;将100 µL用PBS配制的2%无菌过滤猪明胶溶液注入已温度平衡的通道载玻片的一个储液槽中。在37 °C下孵育1小时，然后在无菌条件下使用1 mL Luer注射器加入1 mL PBS冲洗通道。</li>
		<li>将包被明胶的通道载玻片置于薄的聚苯乙烯或泡沫塑料板上，以防止载玻片温度下降。使用1 mL Luer注射器向载玻片中加入100 µL浓度为4 × 106/mL的HUVEC细胞悬液。 
		注意： 将通道载玻片放置在洁净台的冷金属表面可能导致载玻片底部温度降低，从而对内皮细胞造成冷应激。在移液过程中，可将载玻片略微倾斜，使气泡上升并从内部排出。</li>
		<li>将含有HUVEC细胞的通道载玻片在37 °C、5% CO2条件下孵育60分钟，并在通道载玻片两端的储液槽中各加入60 µL ECGMS培养基。继续在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调整微流控泵及软件设置。
	<ol>
		<li>将已平衡的灌注系统连接至泵单元，注入13.6 mL ECGMS培养基，并启动泵控制软件。在流体单元设置菜单中，通过下拉窗口选择合适的灌注系统和通道载玻片类型。在软件中将培养基粘度设置为0.007 (dyn∙s/cm2)。（参见补充图1中以红色箭头标注的压力泵软件设置）。</li>
		<li>在培养箱外，将装有干燥硅胶珠的玻璃瓶连接至压力泵的空气管路（参见图1，插图3）。压力泵的空气在灌注储液槽与泵之间循环，进入泵设备前必须保持干燥。在软件菜单中选择流体参数，将压力设为40 mbar，并通过启动连续培养基流动冲洗泵管路。（这些设置在补充图1中也以红色箭头标出）。</li>
		<li>在软件中设定所需的剪切应力循环培养程序。初始剪切应力设为5 dyn/cm2，控制储液槽的平衡泵送，并确保泵系统中无气泡循环。 
		注意： 通道载玻片中的壁面剪切应力取决于流速和灌注培养基的粘度。若使用其他泵系统，请参考引言中描述的公式，设定可产生目标剪切应力的流速。此处描述的设置对应流速为5.42 mL/min。（补充图2展示了压力泵软件中适当的流体参数设置示例截图）。</li>
		<li>在泵控制软件中停止流体循环，并通过夹紧Luer连接处附近的管路来保持灌注管路中的培养基静止。连接通道载玻片，避免引入气泡，并将连接好的流体单元放入37 °C、5% CO2的CO2培养箱中。以5 dyn/cm2的剪切应力启动培养，持续30分钟，使细胞平稳适应剪切应力产生的作用力，之后再逐步提高剪切应力水平（参见补充图3）。 
		注意： 连接管路系统后，需确保管路系统或载玻片内无残留气泡，因为气泡在流动中的移动可能导致细胞脱落。</li>
		<li>将剪切应力逐步提高至10&#160;dyn/cm2&#160;（在此流体设置下对应流速为10.86 mL/min），并在37 °C、5% CO2的小型CO2培养箱中持续施加剪切应力48小时，以促进细胞分化（相应的软件设置在补充图4中以红色箭头&#160;标出）。 
		注意： 若直接以10 dyn/cm2的剪切应力启动灌注培养，HUVEC细胞容易从通道表面脱落。若先以5 dyn/cm2的较低剪切应力培养至少30分钟，再缓慢提升至目标值10 dyn/cm2，则细胞可稳定贴附于腔室表面。在此灌注设置中，10 dyn/cm2是形成VWF串状结构所需的最小剪切应力值。</li>
		<li>在微流控细胞培养24小时后，当两侧储液槽中的培养基液面达到平衡时，立即通过泵控制软件停止培养基流动。将流体单元移至洁净台，使用10 mL移液管从灌注储液槽中移除10 mL循环培养基。向储液槽中补充10 mL ECGMS培养基以更新培养基，将流体单元放回37 °C、5% CO2的CO2培养箱中，并通过泵控制软件重新启动流体培养。 
		注意： 实验过程中，实验室设备（如大型离心机）可能产生强磁场干扰，导致压力泵功能突然中断，进而引起细胞脱落。请确保此类设备在实验期间不靠近压力泵运行。</li>
		<li>在显微成像前24小时，启动覆盖荧光显微镜载物台的温控培养室，预热至37 °C以实现温度平衡。显微镜预热完成后，启动显微镜控制软件，并通过选择适当的滤光片设置（540 nm/590 nm用于检测表达RFP的细菌，470 nm/515 nm用于检测FITC标记的VWF特异性抗体的荧光发射）调整荧光显微观察的主要参数。同时，额外预热一个用于孵育流体单元的加热腔至37 °C。&#160; 
		注意： 在感染分析和显微观察期间，通道载玻片及循环培养基的温度不应显著下降，否则将对细胞造成冷应激。通常，覆盖显微镜载物台的温控腔尺寸不足以容纳整个流体单元，因此建议使用额外预热至37 °C的加热腔。</li>
		<li>进行显微观察时，将流体单元放入已预热至37 °C的加热腔中，并将通道载玻片置于已预热至37 °C的显微镜载物台上。&#160; 
		注意： 显微观察时，由于灌注管路长度有限，需将流体单元和通道载玻片从CO2培养箱中取出。若感染和显微观察时间超过180分钟且无法维持5% CO2环境以进行pH缓冲，则应使用pH缓冲培养基进行微流控培养。</li>
		<li>在注入组胺和细菌之前及整个流式实验期间，以及实验结束后，均需使用显微镜的明场模式观察细胞形态及HUVEC细胞层的完整性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 诱导 VWF 释放及多聚体化 VWF 串的可视化
<ol>
	<li>保持流速设置，因为需要10 dyn/cm2的剪切应力以触发VWF多聚化形成长达200 MDa的长串结构。通过注射口将136 µL的100 mM组胺储备液注入灌注管路中循环的ECGMS培养基，以诱导内皮细胞Weibel-Palade小体（WPB）释放VWF。流路培养基中组胺的终浓度为1 mM。若无注射口，也可通过移液方式将组胺加入泵储液罐的培养基中。</li>
	<li>为进行多聚化VWF串的免疫荧光检测，当储液罐中的培养基液面达到平衡时停止流动，通过注射口向13.6 mL循环的ECGMS培养基中注入200 µL PBS（pH 7.4）溶液，其中含20 µg VWF特异性FITC标记抗体。若无注射口，也可通过移液将抗体加入泵储液罐的培养基中。最终抗体浓度为1.3 µg/mL。</li>
	<li>为在短时间内快速扫描多个视野，使用配备30%功率氙灯荧光装置和落射荧光相机的显微镜荧光单元。利用明场模式观察HUVEC细胞层的形态与结构，选择具有代表性的细胞用于VWF串的可视化分析。</li>
	<li>为观察绿色荧光标记的VWF串，选择显微镜软件（LasX）荧光单元菜单中的63倍/1.40数值孔径油镜物镜及470 nm检测滤光片。对至少50个代表性视野进行Z轴层扫成像，每个视野包含约10个形态完整的HUVEC细胞。为在不同时间点定量分析绿色荧光VWF串，需扫描多个视野。</li>
</ol>
5. 实时流动条件下细菌与VWF-串状结构结合的显微镜观察
<ol>
	<li>通过免疫荧光检测定量肺炎链球菌在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）表面形成的VWF串上的黏附情况。
	<ol>
		<li>暂停流动，通过注射口将最大体积为1 mL、浓度为1.35 × 108 CFU/mL的表达RFP的肺炎链球菌加入ECGMS培养基中。或者，也可将细菌用移液器加入泵储液罐中的培养基内。随后重新启动流动，设置剪切应力为10 dyn/cm2，使细菌在泵循环系统中流动。</li>
		<li>选择63倍油镜作为显微镜物镜，并在显微镜软件中调整荧光滤光片设置至RFP通道（540 nm检测滤光片），以检测表达RFP的肺炎链球菌。</li>
		<li>为定量细菌在VWF串上的黏附，停止流动，对至少30个具有代表性的视野进行Z轴层扫成像，每个视野包含约10个形态完整的HUVEC细胞，并统计其中肺炎链球菌的数量。</li>
		<li>采用单因素方差分析（ANOVA）算法对数据进行评估，随后进行事后双尾非配对样本检验以实现详细的统计比较。P值&#60;0.05被认为具有统计学显著性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 样品固定后细菌与VWF-串状结构结合的显微镜评估
<ol>
	<li>在进行免疫荧光染色前进行固定处理。
	<ol>
		<li>停止流动，从泵储液槽中移除10 mL ECGMS培养基，并加入10 mL含5%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）。使PFA溶液在10 dyn/cm2的剪切应力下循环10分钟。</li>
		<li>将通道载玻片从泵单元上断开。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭细胞表面的非特异性结合位点，并对VWF串状结构及附着的细菌进行免疫检测。
	<ol>
		<li>为所有洗涤步骤配制4 mL洗涤液，其中含100 mM Na2CO3（pH 9.2）并添加4%蔗糖。另配制1 mL封闭液，其中含100 mM Na2CO3（pH 9.2）、4%蔗糖和2%牛血清白蛋白（BSA），用于封闭非特异性结合位点。</li>
		<li>使用1 mL鲁尔注射器向PFA孵育后的通道载玻片中注入200 µL洗涤液，洗涤3次；随后在室温下用200 µL封闭液孵育载玻片120分钟。</li>
		<li>另配制4 mL封闭液，其中含100 mM Na2CO3（pH 9.2）、4%蔗糖和0.5% BSA，用于抗体稀释。取200 µL该封闭液将肺炎链球菌特异性兔抗血清按1:100稀释。另取200 µL该封闭液将VWF特异性小鼠抗体按1:50稀释，得到终浓度为4 µg/mL的VWF特异性抗体。将AlexaFluor488标记的二抗从2 mg/mL的原液中按1:100稀释于200 µL PBS（pH 7.4）中，获得终浓度为20 µg/mL的溶液。 
		注意：在所述免疫荧光条件下，将抗体稀释于上述碱性碳酸盐缓冲液中可获得最佳检测效果。根据以往实验结果，推荐的封闭液配方及抗体用量适用于多种实验场景。然而，不同实验可能需要对抗体组合、抗体浓度、孵育时间及封闭缓冲液组成进行个体化优化。作为替代方案，中性pH范围的磷酸盐缓冲体系也可用作或更适合作为孵育缓冲液。若荧光信号较弱，应提高二抗浓度；若非特异性背景荧光过高，则应增加封闭剂的用量。</li>
		<li>进行VWF免疫荧光染色时，使用1 mL鲁尔注射器向通道载玻片中注入200 µL洗涤液，洗涤3次；随后在室温下用1:50稀释的VWF特异性抗体孵育30分钟。之后再次用200 µL洗涤液洗涤3次，并在室温下用1:100稀释的AlexaFluor488标记的小鼠特异性二抗孵育30分钟。最后再用200 µL洗涤液洗涤3次。 
		注意：AlexaFluor荧光染料易发生光漂白，因此在使用荧光染料标记抗体孵育过程中，应将载玻片置于避光环境中以避免光照。</li>
		<li>为检测肺炎链球菌，将载玻片与1:100稀释的肺炎链球菌特异性兔抗体在室温下孵育30分钟。随后用200 µL洗涤液洗涤3次，并在室温下用1:100稀释的AlexaFluor568标记的兔特异性二抗孵育30分钟。再次用200 µL洗涤液洗涤3次。</li>
		<li>为使用荧光鬼笔环肽染色细胞骨架肌动蛋白，先在室温下用120 µL含0.1% Triton X-100的溶液孵育HUVEC细胞5分钟以实现细胞通透化。用200 µL洗涤液洗涤3次后，加入120 µL按1:1,000稀释的AlexaFluor350标记鬼笔环肽进行孵育。该步骤可显示聚合态肌动蛋白细胞骨架，便于观察细胞形态及可能由应力诱导的形态学变化。</li>
		<li>用200 µL洗涤液洗涤通道载玻片3次。最后用200 µL去离子水（ddH2O）洗涤4次，并在荧光显微镜下使用适当的滤光片设置观察绿色荧光标记的VWF串状结构、红色荧光标记的细菌以及蓝色荧光标记的肌动蛋白细胞骨架。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

模拟细菌与机械敏感性宿主蛋白（如VWF）的相互作用，需要一种可灌注的细胞培养系统，以实现液体的明确定向、持续流动，从而产生可靠的剪切应力。已有多种微流控泵系统被报道。Bergmann 等人的一篇综述全面总结了不同二维和三维细胞培养模型的关键特征17。
微流控技术是一项始于20世纪90年代初的新兴技术，其特点是在微米甚至纳米尺度上构建可控、可重复且可灌注的微环境18。本文介绍的微流控方法也可用于研究广泛的细菌黏附机制及其相关蛋白。该技术尤其适用于涉及力学响应型黏附组分（如VWF）的相互作用研究，而这类过程通常无法通过标准的细胞培养技术进行探究。例如，已知多种细胞外基质蛋白的构象会因其所在位置的不同而发生变化。在血液循环系统中，纤维连接蛋白等糖蛋白以球状构象存在，而在细胞外基质中，这些蛋白则呈现为多连接的二聚体及多聚体支架结构19,20。此外，多家微流控设备供应商提供已预包被...

肺炎链球菌感染的发病机制表现为与多种细胞外基质化合物以及人血栓稳态组分（如纤溶酶原和血管性血友病因子VWF）之间复杂的相互作用1,2,3,4,5,6,7,8。多结构域糖蛋白VWF通过介导血小板募集以及在血管血栓形成部位促进纤维蛋白整合，在维持平衡的血栓稳态中发挥关键调控作用9。血管性血友病（一种常见的遗传性出血性疾病）表明了功能活性VWF在止血控制和伤口愈合中的重要性10。
球形血管性血友病因子（VWF）在人体血液循环系统中浓度可达14.0 µg/mL11,10。当发生血管损伤时，内皮细胞中的魏贝尔-帕拉德小体（Weibel Palade Bodies, WBP）会显著增加VWF的局部释放11,12。既往研究表明，肺炎链球菌对人内皮细胞的黏附及其产生的成孔毒素肺炎溶素可显著促进管腔侧VWF的分泌13。血流的流体动力学作用力可诱导机械响应性VWF结构域发生构象展开。在血流剪切力达到10 dyn/cm2时，VWF会多聚化形成长达数百微米的蛋白质纤维，这些纤维仍附着于内皮下层10,12。
为了研究在剪切应力作用下形成的多聚体血管性血友病因子（VWF）串状结构在肺炎链球菌与内皮表面相互作用中的功能，建立了一种基于微流控细胞培养的感染方法。使用一种配备软件控制气压泵系统的微流控装置，实现细胞培养基以定义流速进行持续、单向的循环流动。由此，该系统可在内皮细胞表面施加定义的剪切应力，而内皮细胞则附着于特制的通道载玻片内。该方法可模拟人体血管系统血流中的剪切力环境，在此条件下，分化的内皮细胞在确定的恒定流动环境中生成VWF串状结构。为此，内皮细胞在特定通道载玻片中培养（见材料表），这些载玻片适用于流动条件下的显微观察。微流控泵系统提供了高度定义且可控的剪切应力环境，这对于在融合的内皮细胞层上形成延伸的VWF串状结构至关重要。在通过组胺补充刺激融合生长的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分泌VWF后，施加10 dyn/cm2的剪切应力（ԏ）以诱导串状结构的形成。剪切应力定义为作用于细胞层上的力，其值可依据Cornish等14提出的方法，按公式1近似计算： 
<img alt="扭转公式 τ=(6η/h²w)Φ；剪切应力分析公式。" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1">
其中，ԏ 表示剪切应力，单位为 dyn/cm2；η 表示黏度，单位为 (dyn∙s)/cm2；h 为通道高度的一半；w 为通道宽度的一半；Φ 表示流量，单位为 mL/min。
公式 1 的结果取决于所用不同载玻片的高度和宽度（见材料表）。本研究中使用了通道高度为 0.4 µm 的鲁尔通道载玻片，得到的腔室载玻片系数为 131.6（见公式 2）。 
<img alt="静态平衡，扭矩分析公式 τ=131.6×η×Φ。" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2">
在 37 °C 时，介质的黏度为 0.0072 dyn∙s/cm²，所用剪切应力为 10 dyn/cm²。由此得到的流速为 10.5 mL/min（见公式 3）。 
<img alt="光通量计算公式 Φ=10/(0.0072×131.6)=10.5，展示光学公式。" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 3">
本文详细描述了一种利用单向层流系统进行微流控细胞培养的改进方法，用于研究和可视化细菌感染在宿主血管系统中的机制。也可使用其他能够施加持续且稳定剪切应力的泵系统来刺激内皮层上VWF串状结构的形成15。
在流动条件下培养原代内皮细胞至汇合，并刺激血管性血友病因子（VWF）串状结构形成后，在持续显微镜监控下将表达红色荧光蛋白（RFP）16的肺炎链球菌加入内皮细胞层。通过使用VWF特异性的荧光标记抗体，可在长达三小时内实时显微观察并监测细菌在内皮细胞表面VWF串上的黏附过程。利用该方法，可确定VWF作为促进细菌黏附至血管内皮的黏附辅助因子的作用8。
除了能够对蛋白质分泌和构象变化进行显微观察外，该方法还可用于实时监测细菌感染过程中的各个单一步骤，并量化在感染不同时间点附着的细菌数量。特异的软件控制泵系统还可在定义的恒定流体条件下培养内皮细胞长达数天，并实现设定的脉冲式培养基流动孵育。此外，该方法可适用于不同类型的细胞。通过调整染色方案，还可实现对内化进入真核细胞的细菌进行检测与可视化。
本文描述了一种先进的实验方案，该方案可作为定义明确、可靠且可重复的方法，用于对病理生理过程进行高效而多用途的表征。

<table><tbody><tr><td>1 mL 鲁尔注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>10303002</td><td>用于通过载片的鲁尔接头注入明胶，容量为 1 mL</td></tr><tr><td>2 mL 鲁尔注射器</td><td>Sarstedt</td><td>9077136</td><td>用于向通道载片的鲁尔连接处移液或注入液体</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>eBioscience 现属 Thermo Fisher</td><td>00-4555-56</td><td>用于轻柔解离内皮细胞的蛋白酶混合物</td></tr><tr><td>AlexaFluor350 标记的鬼笔环肽</td><td>Abcam</td><td>ab176751</td><td>厂家未提供浓度，原液可满足 300 次检测，公司建议使用 1:1,000 稀释液 100 &amp;micro;L，蓝色荧光（DAPI 滤光片设置）</td></tr><tr><td>AlexaFluor488 标记的山羊抗小鼠抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td>原液浓度：2 mg/mL，用于微流控载片中人 VWF 经 PFA 固定后的免疫染色，绿色荧光</td></tr><tr><td>AlexaFluor568 标记的山羊抗兔抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>原液浓度：2 mg/mL，用于微流控载片中肺炎链球菌经 PFA 固定后的免疫染色，红色荧光</td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤（Bacto Todd-Hewitt-Broth）</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>BD 249210</td><td>复杂的细菌培养基</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-25G</td><td>溶解后用于配制封闭缓冲液</td></tr><tr><td>带滤器的细胞培养瓶</td><td>TPP</td><td>90026</td><td>用于在 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 表面积的未包被细胞培养瓶中继代培养 HUVEC</td></tr><tr><td>Allegra X-12R 离心机</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>392304</td><td>用于离心沉淀细菌（体积大于 &gt;2 mL）</td></tr><tr><td>Allegra X-30 离心机</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B06314</td><td>用于离心沉淀真核细胞</td></tr><tr><td>Z 216 MK 离心机</td><td>Hermle</td><td>305.00 V05 - Z 216 M</td><td>用于离心沉淀细菌（体积小于 2 mL）</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>3886.2</td><td>以 0.2 mg/mL 浓度用于培养携带红色荧光蛋白和氯霉素抗性盒的遗传构建体转化的肺炎链球菌</td></tr><tr><td>灌注管路夹具</td><td>ibidi</td><td>10821</td><td>在将载片连接至泵系统前，用于夹住管路中的液体</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>MIDI 40</td><td>培养箱尺寸与连接通道载片的流体单元完全匹配，用于在 37 &amp;deg;C 和 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 条件下进行流动培养</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18 AIC</td><td>用于在 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 37 &amp;deg;C 条件下，在特定气氛中培养细菌和细胞</td></tr><tr><td>哥伦比亚血琼脂平板</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>PA-254005.06</td><td>含 7% 羊血的琼脂基复杂培养基，用于&lt;em&gt;S. pneumoniae&lt;/em&gt;培养</td></tr><tr><td>计算机</td><td>Dell</td><td>Latitude 3440</td><td>配备压力泵软件的计算机</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td>倒置显微镜，配备可加热培养室的载物台，以及带有荧光滤光片、氙光源（SP8, DMi8）和 DFC 365 FX 相机（1392 x 1040，140 万像素）的荧光单元</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾（KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>3904.1</td><td>用于配制 PBS 缓冲液</td></tr><tr><td>干燥材料</td><td>Merck</td><td>101969</td><td>橙色硅胶珠，用于带管路接头的玻璃瓶中干燥</td></tr><tr><td>ECGM 补充剂混合液</td><td>Promocell</td><td>C-39215</td><td>ECGM 培养基补充剂混合液，用于内皮细胞的预培养：0.02 mL/mL 胎牛血清，0.004 mL/mL 内皮细胞生长补充剂，0.1 ng/mL 表皮生长因子，1 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子，90 &amp;micro;g/mL 肝素，1 &amp;micro;g/mL 氢化可的松</td></tr><tr><td>ECGMS</td><td>Promocell</td><td>C-22010</td><td>ECGM 培养基中添加 5% [w/w] FCS 和 1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 以增强细胞黏附</td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基（ECGM，即用型）</td><td>Promocell</td><td>C-22010</td><td>HUVEC 培养基，已添加所有补充剂组分</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>biochrome 现属 Merck</td><td>S 0415</td><td>细胞培养补充剂，用于感染分析</td></tr><tr><td>FITC 标记的山羊抗人 VWF 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8822</td><td>原液浓度：10 mg/mL，用于流动条件下球状及多聚体 VWF 的免疫检测</td></tr><tr><td>流体单元</td><td>ibidi</td><td>10903</td><td>用于流动培养的流体单元</td></tr><tr><td>明胶（猪源）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G-1890-100g</td><td>用于微载片通道表面的预包被</td></tr><tr><td>盐酸组胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H-7250-10MG</td><td>用于诱导内皮细胞 Weibel-Palade 小体分泌 VWF</td></tr><tr><td>人脐静脉内皮细胞（HUVEC）</td><td>Promocell</td><td>C-12203 批号 396Z042</td><td>来自混合供体的原代内皮细胞，液氮中冷冻保存</td></tr><tr><td>小鼠来源的人 VWF 特异性抗体（单克隆）</td><td>Santa Cruz</td><td>sc73268</td><td>原液浓度：200 &amp;micro;g/mL，用于 PFA 固定后微流控载片中 VWF 的免疫染色</td></tr><tr><td>注射口</td><td>ibidi</td><td>10820</td><td>用于在流动循环过程中向储液管路中注入组胺或细菌</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 35M</td><td>倒置光学显微镜，配备 40 倍水镜，可实现 400 倍放大，用于检测真核细胞的脱落和细胞计数</td></tr><tr><td>Luer 载片 I&lt;sub&gt;0.4&lt;/sub&gt;（ibiTreat472microslides）</td><td>ibidi</td><td>80176</td><td>经物理改性的载片，用于流体培养（&amp;mu;&amp;ndash;Slide I&lt;sup&gt;0.4&lt;/sup&gt;Luer，通道高度 0.4 mm，通道体积 100 &amp;mu;l，生长面积 2.5 cm，包被面积 25.4 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;），适用于各类流动实验，物理处理可产生亲水且具黏附性的表面</td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，无水）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>用于配制 ECGMS 培养基</td></tr><tr><td>微流控泵</td><td>ibidi</td><td>10905</td><td>气压泵</td></tr><tr><td>Neubauer 细胞计数板</td><td>Karl Hecht GmbH&amp;Co KG</td><td>40442002</td><td>用于 HUVEC 的显微镜下细胞计数</td></tr><tr><td>16% 戊二醛（PFA）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-S</td><td>用于样品交联</td></tr><tr><td>灌注套装</td><td>ibidi</td><td>10964</td><td>黄色/绿色灌注套装，管路内径 1.6 mm，管长 50 cm，总工作体积 13.6 mL，死体积 2.8 mL，储液器容量 10 mL。与 &amp;micro;-slide L0.4Luer 配合使用，在 37 &amp;deg;C、黏度为 0.0072 dyn x s/cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 的条件下，可实现 3.8 mL/min 至 33.9 mL/min 的流速范围，剪切应力范围为 3.5 dyn/cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 至 31.2 dyn/cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;。适用于微流控，管长 50 cm</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td></td><td></td><td>使用以下试剂配制：0.2 g/L KCl，1.44 g/L Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，0.24 g/L KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，pH 7.4</td></tr><tr><td>塑料比色皿</td><td>Sarstedt</td><td>67,741</td><td>（双光路），用于 600 nm 处光密度（OD）测定</td></tr><tr><td>肺炎链球菌特异性抗血清</td><td>Pineda</td><td></td><td>以热灭活的&lt;i&gt;Streptococcus pneumoniae&lt;/i&gt; NCTC10319 和 D39 免疫兔制备，经蛋白 A-Sepharose 柱纯化 IgG</td></tr><tr><td>聚苯乙烯或泡沫塑料板</td><td></td><td></td><td>此为预防措施，避免通道载片中接种的细胞受到冷应激。任何类型的泡沫塑料（如包装箱材料）均可使用。板厚约 0.5 cm，尺寸应为 20 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;。</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>6781.1</td><td>用于 PBS 缓冲液</td></tr><tr><td>泵控制软件（PumpControl v1.5.4）</td><td>ibidi</td><td>v1.5.4</td><td>用于控制压力泵、设定流动条件并启动/停止流动的计算机软件</td></tr><tr><td>1.5/2.0 mL 反应管</td><td>Sarstedt</td><td>72.706/ 72.695.500</td><td>用于抗体稀释</td></tr><tr><td>50 mL 反应管</td><td>Sarstedt</td><td>6,25,48,004</td><td></td></tr><tr><td>表达 RFP 的肺炎链球菌</td><td>英国国家典型培养物保藏中心（Public Health England）</td><td>10,319</td><td>47 型肺炎链球菌，基因组中整合了与组蛋白样蛋白融合的 RFP</td></tr><tr><td>5 mL、10 mL 移液管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025/ 86.1254.025</td><td>用于移取较大体积液体</td></tr><tr><td>碳酸钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，无水）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451614-25G</td><td>用于配制 100 mM 碳酸钠缓冲液</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠（NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>P030.2</td><td>用于 PBS 缓冲液</td></tr><tr><td>光谱光度计 Libra S22</td><td>Biochrom</td><td>80-2115-20</td><td>用于测定细菌悬液在 600 nm 处的光密度（OD）</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td>用于配制封闭缓冲液</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td>使用 0.1% 终浓度，溶于 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0，用于 PFA 固定后真核细胞的通透处理</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>oxoid</td><td>LP0021</td><td>在含 1% [w/w] 酵母提取物的 THB 培养基中培养细菌 = 完整细菌培养基 THY</td></tr></tbody></table>

肺炎链球菌在持续流动条件下感染原代人内皮细胞

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

肺炎链球菌与内皮细胞表面的相互作用在血流中通过机械敏感性蛋白（如血管性血友病因子（VWF））介导。这种糖蛋白会响应剪切应力而改变其分子构象，从而暴露出多种宿主配体相互作用的结合位点。通常，在确定的剪切流条件下培养原代内皮细胞，可促进特定的细胞分化，并形成稳定且紧密连接的内皮层，类似于血管内壁的生理状态。因此，对涉及机械敏感性蛋白的细菌病原体与宿主血管系统之间相互作用的功能分析，需要建立能够模拟影响血管细胞表面的生理流体剪切力的泵系统。
本研究中使用的微流控装置能够以定义的流速实现流体的连续、无脉冲循环。计算机控制的气压泵系统通过产生连续、单向且可控的培养基流动，在内皮细胞表面施加定义的剪切应力。利用专为显微观察设计的通道载玻片，可在流动条件下对细胞的形态变化及细菌黏附进行显微监测与定量分析。与通常需要在免疫标记和显微分析前对样品进行固定的静态细胞培养感染相比，微流控载玻片既可在样品固定后实现基于荧光的蛋白质、细菌和细胞组分检测、连续免疫荧光染色，也可进行实时的荧光直接检测。结合荧光标记的细菌和特异性荧光标记抗体，该感染方法为涉及血管过程的广泛科学研究应用提供了一种高效的多组分可视化系统。

在持续单向流动条件下培养原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC），可形成融合且紧密排列的细胞层，促进细胞内生成富含对机械力敏感的血管性血友病因子（VWF）的魏贝尔-帕拉德小体（WPBs）13,14。本方案描述了一种基于气压泵的无脉冲循环系统，用于感染分析，该系统可模拟人体血流中的剪切应力环境。
该系统能够设定明确且由软件控制的流动条件。流动方案如下 图1 展示了主要的工作流程，从原代内皮细胞的预培养开始（图1，插图1）以及肺炎链球菌的预培养（图1，插图2）。所应用的微流控系统（图1, 插图3）由一种特殊的通道载玻片组成，该载玻片通过鲁尔接头连接至带有两个培养基储液罐的灌流管路。灌流管路组件置于一个流体控...

本研究描述了在定义的流动条件下，通过剪切应力作用于分化的人原代内皮细胞表面产生的血管性血友病因子串，对肺炎球菌黏附进行显微监测的方法。通过应用差异免疫染色程序，该方案可进一步扩展至对特定细胞结构的详细可视化及细菌的定量分析。

肺炎链球菌与内皮细胞表面的相互作用在血流中通过机械敏感蛋白（如Von ...）介导

该内皮细胞培养系统的应用能够模拟血流环境中的真实情况。在此条件下，我们可分析细菌感染过程，包括参与该过程的细菌载体以及细胞载体的鉴定。该技术为探索细菌感染对血管完整性的影​​响开辟了道路，同时也可用于研究其对形态发生机制、炎症反应及免疫调控的影响。该技术需要对内皮细胞进行一些特殊处理，因此视觉化的描述优于单纯的口头解释。该方法为多个与灌注血管系统相关的研究领域提供了深入见解，例如内皮细胞分化、伤口愈合、肿瘤发生以及血管生成。其中关键步骤之一是标准化的细胞培养以及对原代内皮细胞的精确操作。该技术需要一些特殊的细胞培养操作，仅通过口头解释可能难以理解。首先，在无菌环境中使用超净工作台进行操作。用移液器将 100 µL 经过无菌过滤的 2% 猪明胶 PBS 溶液注入已预温平衡的通道载玻片的单个储液池中。将明胶包被的通道载玻片置于薄的聚苯乙烯或泡沫聚苯乙烯板上，以防止载玻片温度下降；使用1毫升鲁尔注射器向载玻片中加入100微升浓度为4×10⁵个细胞/毫升的HUVEC悬液，用于接种和培养HUVEC。将接种了HUVEC的通道载玻片在37°C、5%二氧化碳条件下孵育60分钟。随后，在通道载玻片两端的每个培养基储液池中各加入60微升ECGMS培养基。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下继续孵育一小时。接下来，为了调节微流控泵，首先将已平衡的灌注装置连接至泵单元，加入13.6毫升ECGMS培养基，并启动泵控制软件。在流体单元设置菜单中，通过下拉窗口选择合适的灌注装置和腔室载玻片类型。在软件中将培养基黏度设置为 0.007 达因·秒/平方厘米。从培养箱外将装有干燥硅胶珠的玻璃瓶连接到气压管路。在软件菜单中选择流速参数，将压力设为 40 毫巴，并通过启动连续培养基流动冲洗泵管。我们通过使用亚融合生长的 HUVECs 来确保细胞牢固贴壁，同时特别注意排除系统中的气泡，并为泵系统使用独立的电源。轻敲管路连接处以去除气泡，并确保泵系统中无气泡循环。在连接通道载玻片时，需在泵控制软件中停止循环流动，并通过在靠近鲁尔接头处夹紧管路来阻断培养基流动和灌注管路。连接通道载玻片，避免产生气泡。在泵控制软件的高级选项卡中，使用软件工具“循环创建器”来编程设定流动培养所需的剪切应力循环。设定流动循环的剪切应力水平，并启动长期灌注。首先以5达因/平方厘米的剪切应力进行灌注，对应流速为5.44毫升/分钟，持续30分钟，随后以10达因/平方厘米的剪切应力持续灌注，对应流速为10.85毫升/分钟。控制平衡储液器的泵送。将连接好通道载片的流体单元置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。启动显微镜软件控制程序，并通过选择适当的滤光片设置来调整荧光显微监测的主要参数。进行显微观察时，将流体单元放入37摄氏度的加热腔中，将通道载玻片置于预热显微镜的载物台上。在向灌注循环系统中注入组胺和细菌之前，控制细胞形态以及 HUVEC 层的完整性。保持流动设置不变。通过注射口将 136 微升 100 毫摩尔组胺储备液注入灌注管路中循环的 ECGMS 培养基，以诱导血管性血友病因子（VWF）从内皮细胞存活的 Weibel-Palade 小体中释放。为了免疫荧光检测多聚体VWF串，将20微克VWF特异性FITC标记抗体溶于200微升PBS中，注入循环的13.6毫升ECGMS培养基内。为定量分析肺炎链球菌与HUVEC细胞表面生成的VWF串的结合情况，通过注射口将最大体积为1毫升、浓度为1.35 × 10⁸ CFU/毫升、表达RFP的肺炎链球菌注入ECGMS培养基中。选择63倍油浸物镜进行显微镜放大，并在显微镜软件中将荧光滤光片设置调整至RFP通道，使用540纳米检测滤光片以检测表达RFP的肺炎链球菌。为定量细菌在 VWF 串上的黏附情况，需对至少 30 个代表性视野进行 Z 轴层扫成像，每个视野包含约 10 个形态完整的 HUVEC，并计数黏附的肺炎链球菌数量。若需在免疫荧光染色前固定样本以评估细菌黏附情况，则停止灌流，从泵储液器中移除 10 毫升 ECGMS 培养基，并加入 10 毫升含 5% 多聚甲醛的 PBS，随后按照文稿所述步骤进行操作。本方案的主要实验步骤始于在细胞培养瓶中将原代内皮细胞预培养至亚汇合状态。随后将细胞接种至经明胶包被的通道载玻片中。细菌在琼脂平板上培养，随后在复杂的液体培养基中培养至对数生长中期。进行微流控细胞培养时，将含有内皮细胞的通道载玻片连接至泵系统流体单元的灌注管路，并施加持续流动以诱导细胞分化。通过组胺注射在10 dyne·s/cm²的剪切应力下诱导产生VWF串，并利用FITC标记的VWF特异性抗体通过免疫荧光检测在显微镜下进行监测。将表达红色荧光蛋白的细菌注入循环体系后，肺炎链球菌与VWF串的结合可通过在450纳米处的荧光发射在显微镜下实时观察。使用PFA固定细胞后，通过差异免疫荧光染色可实现对特定感染时间点细菌黏附情况的可视化。该实验步骤中最关键的环节是通过调节生理剪切应力水平并避免泵压剧烈波动，确保细胞在载玻片表面牢固贴附。除了显微观察外，该技术还可用于研究新型抗感染药物的药理学效应，以及分析血管感染过程的长期后果。该泵系统通过气压驱动细菌病原体，以防止任何气溶胶途径的传播。建议遵循生物安全防护措施。

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科研

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免疫学与感染

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