肺炎链球菌在持续流动条件下感染原代人内皮细胞

该内皮细胞培养系统的应用能够模拟血流环境中的真实情况。在此条件下，我们可分析细菌感染过程，包括参与该过程的细菌载体以及细胞载体的鉴定。该技术为探索细菌感染对血管完整性的影​​响开辟了道路，同时也可用于研究其对形态发生机制、炎症反应及免疫调控的影响。

该技术需要对内皮细胞进行一些特殊处理，因此视觉化的描述优于单纯的口头解释。该方法为多个与灌注血管系统相关的研究领域提供了深入见解，例如内皮细胞分化、伤口愈合、肿瘤发生以及血管生成。其中关键步骤之一是标准化的细胞培养以及对原代内皮细胞的精确操作。

该技术需要一些特殊的细胞培养操作，仅通过口头解释可能难以理解。首先，在无菌环境中使用超净工作台进行操作。用移液器将 100 µL 经过无菌过滤的 2% 猪明胶 PBS 溶液注入已预温平衡的通道载玻片的单个储液池中。

将明胶包被的通道载玻片置于薄的聚苯乙烯或泡沫聚苯乙烯板上，以防止载玻片温度下降；使用1毫升鲁尔注射器向载玻片中加入100微升浓度为4×10⁵个细胞/毫升的HUVEC悬液，用于接种和培养HUVEC。将接种了HUVEC的通道载玻片在37°C、5%二氧化碳条件下孵育60分钟。随后，在通道载玻片两端的每个培养基储液池中各加入60微升ECGMS培养基。

在37摄氏度和5%二氧化碳条件下继续孵育一小时。接下来，为了调节微流控泵，首先将已平衡的灌注装置连接至泵单元，加入13.6毫升ECGMS培养基，并启动泵控制软件。在流体单元设置菜单中，通过下拉窗口选择合适的灌注装置和腔室载玻片类型。

在软件中将培养基黏度设置为 0.007 达因·秒/平方厘米。从培养箱外将装有干燥硅胶珠的玻璃瓶连接到气压管路。在软件菜单中选择流速参数，将压力设为 40 毫巴，并通过启动连续培养基流动冲洗泵管。

我们通过使用亚融合生长的 HUVECs 来确保细胞牢固贴壁，同时特别注意排除系统中的气泡，并为泵系统使用独立的电源。轻敲管路连接处以去除气泡，并确保泵系统中无气泡循环。在连接通道载玻片时，需在泵控制软件中停止循环流动，并通过在靠近鲁尔接头处夹紧管路来阻断培养基流动和灌注管路。

连接通道载玻片，避免产生气泡。在泵控制软件的高级选项卡中，使用软件工具“循环创建器”来编程设定流动培养所需的剪切应力循环。设定流动循环的剪切应力水平，并启动长期灌注。

首先以5达因/平方厘米的剪切应力进行灌注，对应流速为5.44毫升/分钟，持续30分钟，随后以10达因/平方厘米的剪切应力持续灌注，对应流速为10.85毫升/分钟。控制平衡储液器的泵送。将连接好通道载片的流体单元置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。

启动显微镜软件控制程序，并通过选择适当的滤光片设置来调整荧光显微监测的主要参数。进行显微观察时，将流体单元放入37摄氏度的加热腔中，将通道载玻片置于预热显微镜的载物台上。

在向灌注循环系统中注入组胺和细菌之前，控制细胞形态以及 HUVEC 层的完整性。保持流动设置不变。通过注射口将 136 微升 100 毫摩尔组胺储备液注入灌注管路中循环的 ECGMS 培养基，以诱导血管性血友病因子（VWF）从内皮细胞存活的 Weibel-Palade 小体中释放。

为了免疫荧光检测多聚体VWF串，将20微克VWF特异性FITC标记抗体溶于200微升PBS中，注入循环的13.6毫升ECGMS培养基内。为定量分析肺炎链球菌与HUVEC细胞表面生成的VWF串的结合情况，通过注射口将最大体积为1毫升、浓度为1.35 × 10⁸ CFU/毫升、表达RFP的肺炎链球菌注入ECGMS培养基中。选择63倍油浸物镜进行显微镜放大，并在显微镜软件中将荧光滤光片设置调整至RFP通道，使用540纳米检测滤光片以检测表达RFP的肺炎链球菌。

为定量细菌在 VWF 串上的黏附情况，需对至少 30 个代表性视野进行 Z 轴层扫成像，每个视野包含约 10 个形态完整的 HUVEC，并计数黏附的肺炎链球菌数量。若需在免疫荧光染色前固定样本以评估细菌黏附情况，则停止灌流，从泵储液器中移除 10 毫升 ECGMS 培养基，并加入 10 毫升含 5% 多聚甲醛的 PBS，随后按照文稿所述步骤进行操作。本方案的主要实验步骤始于在细胞培养瓶中将原代内皮细胞预培养至亚汇合状态。

随后将细胞接种至经明胶包被的通道载玻片中。细菌在琼脂平板上培养，随后在复杂的液体培养基中培养至对数生长中期。进行微流控细胞培养时，将含有内皮细胞的通道载玻片连接至泵系统流体单元的灌注管路，并施加持续流动以诱导细胞分化。

通过组胺注射在10 dyne·s/cm²的剪切应力下诱导产生VWF串，并利用FITC标记的VWF特异性抗体通过免疫荧光检测在显微镜下进行监测。将表达红色荧光蛋白的细菌注入循环体系后，肺炎链球菌与VWF串的结合可通过在450纳米处的荧光发射在显微镜下实时观察。使用PFA固定细胞后，通过差异免疫荧光染色可实现对特定感染时间点细菌黏附情况的可视化。

该实验步骤中最关键的环节是通过调节生理剪切应力水平并避免泵压剧烈波动，确保细胞在载玻片表面牢固贴附。除了显微观察外，该技术还可用于研究新型抗感染药物的药理学效应，以及分析血管感染过程的长期后果。该泵系统通过气压驱动细菌病原体，以防止任何气溶胶途径的传播。

建议遵循生物安全防护措施。