在符合标准的基质上对人类胚胎干细胞菌落的几何结构进行模式化，以控制组织级力学
2019年9月28日
细胞外基质配体可以图案化在聚丙烯酰胺水凝胶上，使人类胚胎干细胞在符合要求的基质上的封闭菌落中培养。该方法可与牵引力显微镜和生化测定相结合，以检查组织几何、细胞生成力和命运规格之间的相互作用。
该协议允许研究人员在水凝胶上培养干细胞菌落，完全控制水凝胶的刚度和菌落的几何形状。这项技术的主要优点是，它允许研究人员在比组织培养塑料更好的模拟生理环境的条件下培养干细胞菌落。首次执行此协议时，请确保生成一些额外的每种材料，并使用荧光配体，以便您在每个步骤中进行故障排除和优化。
此技术涉及多个步骤，涉及各种材料的精确定位。一旦看到此协议执行后，就更容易理解该协议的书面说明。要开始此过程，请将 PDMS 基座与 PDMS 固化剂混合，按重量以 10 比 1 的比例混合，然后彻底混合。
在干燥器中解气 30 至 60 分钟，或直到清除所有气泡。缓慢且均匀地将 PDMS 混合物倒在准备好的晶圆表面。点击工作表面上的盘，从晶圆表面释放任何气泡。
PDMS 在 70 摄氏度下烘烤两小时，并允许其冷却至室温。然后将 PDMS 切成大约 10 到 10 毫米的正方形，每个都包含单个实验条件的特征。这些将被称为协议其余部分的标记。
在此之后，将 PDMS 基座与 PDMS 固化剂混合，按重量按 8 比 1 的比例混合，然后彻底混合。将混合物在干燥器中解气 30 至 60 分钟，或直到清除所有气泡。接下来，缓慢而均匀地将 PDMS 倒入干净的 100 毫米盘中。
点击工作表面上的盘子以释放任何气泡。PDMS 在 70 摄氏度下烘烤两小时，并允许其冷却至室温。对于以前生成的每个图章，切割 15 微 15 毫米的 PDMS。
对于协议的其余部分，这些板将称为平板。将每个生成的图章倒置到 PDMS 的平板上，使支架上的特征与 PDMS 的平板接触。用钳子轻轻压在邮票顶部，以确保均匀接触。
接下来，在每个邮票和板对的顶部界面放置一小滴紫外线固化聚合物。聚合物在重力辅助下的表面张力作用下，在两者之间会很邪恶。在冲压和板界面的边缘周围放置一小滴紫外线固化聚合物。
这将创建一个边框，该边框将保存配体解决方案。然后小心地将邮票和拍打对放入紫外线灭菌盒中。使用无菌 STR 电源设置并曝光 10 分钟。
在此之后，从紫外线灭菌箱中去除对，并使用两对钳子轻轻取出邮票，同时按住从 UV 固化聚合物形成的平板和模具。使用钳子，小心地拆下模具并将其反转，使与 PDMS 平板接触的表面朝上。将倒置的模具放回紫外线灭菌盒中。
使用无菌 STR 电源设置并曝光三分钟。使用钳子，小心地将每个模具平放在酸洗盖玻片上，确保特征以盖滑为中心。在每个模具上放置一小块实验室薄膜。
牢固且均匀地按下模具，在模具和盖玻片之间形成牢固的接触。将带模具的盖板放在盘子中。将这盘放在等离子清洁剂中，并应用高功率等离子 30 秒。
然后，将配体溶液移液到每个模具的表面。对于由 10 张 10 毫米方形邮票制作的模具，每个模具应用 100 微升。之后，将含有盖板的盘子包裹在实验室膜中，并在四摄氏度下孵育过夜。
首先，用模具清洗盖玻片，用钳子将盖玻片短暂地淹没在含有无菌 PBS 的盘中。将带模具的盖玻片淹没到 PBS 的第二阶段，再次清洗。从盖玻片表面取下模具，小心不要打破盖玻片。
接下来，将盖玻片短暂地淹没在含有超纯水的盘中，以去除 PBS 洗涤中的盐。触摸盖玻片的边缘，以一个微妙的任务擦拭，以吸走多余的水。在惰性气体（如氮气）下干燥盖滑。
然后，准备聚丙烯酰胺溶液，以获得所需的水凝胶弹性。对于每个图案盖玻片，准备一个谷胱甘肽激活的下盖唇，上面放置一个空格。75 至 150 微升多聚丙烯酰胺溶液之间的移液器，以每个谷胱甘肽激活盖玻片的中心。
使用钳子，将图案覆盖滑到每个谷胱甘肽激活盖上，用聚丙烯酰胺和分流器滑动，使图案配体面对聚丙烯酰胺溶液。小心地将每个聚丙烯酰胺三明治放入一个盖架中，其螺纹与 15 毫升锥形底部管兼容。将 15 毫升锥形底部管拧入每个盖座，将聚丙烯酰胺三明治固定到位。
在室温下以200倍G的200倍G离心至挥流桶管中的聚丙烯酰胺三明治，10分钟。从离心机中拆下管子，并将其放在管架中，以保持方向 50 分钟，以确保完全聚合。然后，从管子中取出三明治，将其淹没在 PBS 中。
将菜用实验室膜包裹，在室温下孵育三小时或四摄氏度过夜。在此之后，使用手术刀和钳子小心地去除图案，以覆盖从聚丙烯酰胺三明治的滑移和空间，而它仍然淹没在PBS。将每个带图案聚丙烯酰胺的盖玻片放入盖座。
垫片放在盖滑的顶部和垫片位于聚丙烯酰胺周围。将锯掉的 15 毫米锥形底部管拧入盖架，形成底部有图案的聚丙烯酰胺的井。这些组件可放入标准 12 孔板的孔中，便于操作。
执行此技术时，使用荧光配体确保在玻璃盖滑表面创建所需的图案，并在聚合过程中成功转移到聚丙烯酰胺水凝胶表面。此方法最终的成功衡量标准是能够在图案水凝胶上所需的几何形状中培养 hESC。如文本协议中所述，当进行培养时，一旦 Y27632 从介质上完全删除，hESC 通常会激增，以完成图案几何，48 到 72 小时。
在聚丙烯酰胺水凝胶上的密闭几何中培养hESC菌落，允许使用牵引力显微镜测量细胞产生的牵引力。这些测量通过在水凝胶中嵌入荧光微球，并在播种HESC之前和之后成像这些珠子的位置。珠子位置的图像可用于生成珠位移图，随后可用于计算基础牵引应力。
在 HESC 的圆形菌落中，最大的牵引应力位于菌落的外围边缘附近，而菌落的中心显示均匀的低牵引力应力。尽管观察到牵引应力的不均匀分布，但海塞在维护条件下培养成图案圆，10 月 3 日至 4 日显示多能标记和细胞粘附分子 E-cadherin 的均匀表达。这项技术将使研究人员能够利用人类胚胎干细胞更好地模拟人类胚胎，最终对人类如何发育产生重要的见解。
此过程可适用于研究人员旨在培养软水凝胶上定义几何体中的细胞的任何应用。该程序与大多数生化酸兼容，使研究人员能够回答有关组织几何和细胞生成力如何影响蛋白质表达和细胞信号的问题。许多研究人员现在利用人类胚胎干细胞来模拟早期人类发育。
这项技术将使研究人员在更好地模拟生理环境的条件下回答这些重要问题。
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概述
该协议允许研究人员在聚丙烯酰胺水凝胶上培养人类胚胎干细胞集落，提供对水凝胶刚度和集落几何形状的控制。这种方法比传统的组织培养塑料更好地模拟生理环境。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 生物材料
- 组织工程
背景
- 细胞外基质配体可以在水凝胶上进行定型。
- 水凝胶为细胞培养提供了一个合适的基质。
- 理解细胞产生的力对于组织工程至关重要。
- 这种方法可以与牵引力显微镜结合使用。
研究目的
- 使干细胞集落在受控环境中培养成为可能。
- 调查组织几何形状和细胞行为之间的关系。
- 优化干细胞命运分化的条件。
使用的方法
- 以10:1比例混合PDMS基料和固化剂。
- 在水凝胶上定型细胞外基质配体。
- 利用牵引力显微镜进行分析。
- 进行生化分析以评估细胞行为。
主要结果
- 在合适的基质上成功培养干细胞集落。
- 加深了对细胞产生的力与几何形状关系的理解。
- 改进了干细胞培养条件的优化。
- 证明了水凝胶相对于传统培养方法的优势。
结论
- 该协议为干细胞研究提供了一种稳健的方法。
- 它允许更好地模拟生理条件。
- 未来的研究可以在这种技术的基础上进行高级组织工程。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables precise control over stem cell colony geometry and substrate mechanics, providing a physiologically relevant system to study early human development. By decoupling biochemical and mechanical cues, it supports mechanistic de-risking in target validation and phenotypic screening workflows. The approach enhances predictive confidence in stem cell-based models used for drug discovery and developmental toxicology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how tissue-level mechanics influence stem cell fate specification and germ layer formation.
- Operational Value: Provides a tunable system to isolate mechanical variables in pathway interrogation assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, geometry-controlled colonies for reproducible compound screening in developmental pathways.
- Operational Value: Supports assay standardization through defined extracellular matrix patterning and hydrogel stiffness control.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of mechanotransduction in human development, informing disease-relevant models of morphogenesis.
- Operational Value: Enables traction force microscopy readouts as quantitative biomarkers of cellular mechanical state.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where geometric and mechanical control is needed to de-risk stem cell models prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how physical constraints regulate pluripotency and differentiation signaling.
- Screening: Delivers geometry-defined, mechanically characterized colonies for consistent compound response assessment.
- Analytics: Provides traction force mapping and fluorescence-based readouts to correlate mechanics with gene expression.
- Translational Research: Connects in vitro mechanical phenotypes to in vivo embryogenesis for improved model validity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying mechanosensitive targets across multiple developmental pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in stem cell models by controlling confounding mechanical variables.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized ligand patterning and hydrogel fabrication.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing physiological relevance of early-stage assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on mechanical sensitivity in human-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in soft lithography, hydrogel preparation, and stem cell culture techniques.
- Depends on access to UV sterilization, plasma cleaning, and traction force microscopy equipment.
- Necessitates standardization across teams for consistent stencil fabrication and ligand patterning.
- Involves optimization steps for different extracellular matrix ligands and hydrogel stiffness ranges.
- Limited by the need for careful handling during polyacrylamide sandwich assembly to avoid delamination.
