Name: 通过再生轴虫中通过显微外科拉米切口进行损伤的脊髓损伤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 了解在再生性墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）中通过椎板切除术建立标准化脊髓挫伤损伤模型的方法。该方案模拟临床创伤，为脊髓再生研究提供可重复的技术框架，并可推广至其他小型动物模型。

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感谢 Michael Pedersen、Aarhus University 在开发 MRI 方案和建立整个项目方面提供的专业知识和时间。感谢 Peter Agger、Aarhus University 在开发 MRI 方案方面提供的专业知识和时间。感谢 Steffen Ringgard、Aarhus University 在开发 MRI 方案方面提供的专业知识和时间。蝾螈脊髓损伤模型的开发得到了 A.P. Møller Maersk 基金会、Riisfort 基金会、Linex 基金会和 ELRO 基金会的大力支持。

本研究严格遵守所有适用的机构和政府关于动物伦理使用的法规。研究经丹麦动物实验监察局批准，批准编号为：2015-15-0201-0061。实验动物为墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum，平均体重 ± 标准差：12.12 g ± 1.25 g）。
1. 准备
<ol>
	<li>准备蝾螈的麻醉。
	<ol>
		<li>使用高质量的未经化学处理的自来水。如果无法获得，则使用40%霍尔特弗雷特溶液。</li>
		<li>将200 mg对氨基苯甲酸乙酯（苯佐卡因）溶解于3 mL丙酮中，再将该溶液溶于1 L自来水或40%霍尔特弗雷特溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一个标准培养皿（直径100 mm）置于体视显微镜下作为手术台，并在培养皿上放置一块手术用织物。 
	注意：使用培养皿作为手术区域可实现不直接接触动物而进行移动和旋转，从而确保手术期间脊柱的稳定性。</li>
	<li>准备好所有无菌显微外科器械（如剪刀和解剖镊）。</li>
</ol>
2. 麻醉
<ol>
	<li>将墨西哥钝口螈放入含有苯佐卡因溶液的容器中，持续约45分钟，以确保达到深度且稳定的麻醉状态。 
	注意：所述浓度的苯佐卡因可使所有体型大小的墨西哥钝口螈进入麻醉状态。</li>
	<li>在30至45分钟内检查全身麻醉的体征，包括完全无鳃部运动、翻正反射消失，以及对触觉或疼痛刺激（轻捏脚趾间蹼部）无反应。</li>
	<li>为维持麻醉状态，用浸有麻醉溶液的纸巾包裹动物。在手术过程中应定期用该溶液润湿纸巾，以确保皮肤和鳃部保持湿润。</li>
	<li>手术后将动物转移至盛有新鲜自来水的容器中进行复苏。观察其复苏迹象，例如鳃部运动恢复和翻正反射重现，通常在1小时内出现16。</li>
</ol>
3. 显微外科椎板切除术
注意：椎板切除术在体视显微镜下进行。
<ol>
	<li>将动物俯卧位放置于培养皿中，用纸巾包裹动物，仅暴露其尾部。 
	注意： 纸巾在操作过程中能有效固定动物，确保稳定性。</li>
	<li>确认后肢位置，在其后方稍远处做第一处切口。
	<ol>
		<li>使用显微剪刀，从龙骨处开始垂直切开，直至触及棘突的骨性隆起。 
		注意： 使用镊子夹持龙骨和皮肤时需格外小心，以免损伤脆弱的皮肤。</li>
		<li>将切口向两侧延伸，使其横贯尾部的整个宽度。</li>
		<li>用镊子夹住棘突，以确保达到合适的深度。</li>
		<li>在棘突两侧，将垂直切口向下延伸约 1 mm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将动物侧放，按以下说明进行腹侧和水平方向的切开。
	<ol>
		<li>使用显微剪刀，从垂直切口的腹侧端点开始，对体重为 10–20 g 的动物进行约 15 mm 的水平切口；体型较大的动物切口应更长，体型较小的则应更短。</li>
		<li>通过水平切口，用剪刀向中线方向进行内侧解剖，直至触及脊柱中线。</li>
		<li>在动物另一侧重复步骤 3.3、3.3.1 和 3.3.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从两侧完成深层中线解剖后，继续沿中线切开，使两侧水平切口相互连通。
	<ol>
		<li>将游离的尾部和龙骨组织推向一侧，暴露棘突（图 1）。</li>
		<li>使用湿润的纸巾固定尾部组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>再次将动物置于俯卧位，头部朝向术者的非优势手一侧。
	<ol>
		<li>用镊子夹住后肢后方稍远处的棘突，轻轻向上并朝动物头部方向提起。</li>
		<li>将显微剪刀的刀片水平置于棘突周围，轻轻剪断。提起棘突可确保其被完全移除，从而暴露脊髓。</li>
		<li>夹住刚刚移除棘突后方的下一个棘突，并重复步骤 3.5.1 和 3.5.2。 
		注意： 此操作应暴露相当于两个椎体节段的脊髓。在进行椎板切除时，常可见白色泡沫状分泌物。脊髓因其特有的光泽以及沿中线走行的血管而易于识别。</li>
		<li>根据动物体型的不同，暴露区域可能不够宽。此时可用两把镊子分别夹住脊髓两侧的椎板，轻轻向外侧扭转，以扩大暴露范围。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 造成挫伤型损伤（图2）
<ol>
	<li>将动物保持在俯卧位。</li>
	<li>使用培养皿将动物转移至损伤装置。</li>
	<li>让助手用手电筒照亮脊髓。</li>
	<li>利用装置上的微调器，将挫伤损伤装置的圆筒置于暴露的脊髓上方，并通过圆筒进行瞄准。</li>
	<li>降低圆筒，直至其与椎板平齐。</li>
	<li>将下落杆固定在电磁铁上。将所需下落高度的调节圆筒安装到损伤装置上。</li>
	<li>将下落杆放入圆筒中。 
	注意：在盲法实验中，此时手术操作者应在不知晓该动物将被分配至损伤组还是假手术组的情况下离开房间。</li>
	<li>关闭电磁铁，使杆自由下落至暴露的脊髓上。</li>
	<li>使用高度调节螺钉将杆从脊髓上抬起。</li>
	<li>通过显微镜观察脊髓以确认损伤。损伤部位会显得较暗，并可见中线血管出血。</li>
</ol>
5. 引入锐器损伤
注意：在完成 3.5.4 步骤后执行这些操作。
<ol>
	<li>使用一对显微剪刀对脊髓进行完全垂直的切割。</li>
	<li>在身体尾侧方向距离初次切口2 mm处重复切割。 
	注意： 切除的脊髓片段长度可根据研究需求调整。然而，2 mm的切口长度具有可再生性10。</li>
	<li>确保切口完全贯通。操作完成后，应能感觉到剪刀刀片沿椎管腹侧部分相互刮擦。</li>
	<li>从椎管中取出2 mm长的脊髓片段。</li>
</ol>
6. 关闭手术切口
<ol>
	<li>将动物放回手术台。在盲法实验中，调整龙骨位置，使外科医生无法看到脊髓。</li>
	<li>保持动物俯卧位。
	<ol>
		<li>从水平切口最尾端开始，使用10.0尼龙缝线进行缝合。单层闭合伤口。 
		注意：不要过度拉紧皮肤，以免造成组织坏死。</li>
		<li>向切口的垂直部分方向继续缝合。</li>
		<li>到达夹角处时，转动培养皿，缝合另一侧的水平切口。</li>
		<li>缝合垂直切口部分。</li>
		<li>不要在龙骨最上端部位缝合，因为此处皮肤无法牢固持线。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 将动物放回无麻醉剂溶液中
<ol>
	<li>拿起培养皿连同其中的动物，非常轻柔地将其完全浸入仅5 cm深的新鲜水中，让动物自行滑落。 
	注意：浅水深度可确保动物不会试图游向水面呼吸。</li>
	<li>第一周内不要换水。</li>
	<li>喂食时，确保将食物放置在动物头部附近。 
	注意：采取这些措施的目的是在第一周内尽可能减少动物的活动。</li>
</ol>
8. 术后超声检查
<ol>
	<li>在麻醉结束前，使用高频超声系统获取损伤部位的图像，用于构建脊髓损伤（SCI）部位的三维图像。</li>
	<li>将超声探头连接至显微操作器，最好使用由远程操纵杆控制的显微操作器。</li>
	<li>将麻醉后的动物以俯卧位浸入盛有麻醉溶液的小容器中。 
	注意：使用微型沙袋或其他设备固定动物，以避免扫描过程中发生移动。</li>
	<li>将超声探头尖端与动物体长轴对齐，并将其浸入苯佐卡因溶液中，直至探头位于动物后肢后方龙骨上方几毫米处。</li>
	<li>确定脊髓损伤（SCI）部位。 
	注意：由于脊髓损伤部位上方棘突缺失，损伤区域易于识别。</li>
	<li>通过调整超声参数优化图像，确保脊髓损伤（SCI）部位位于图像中心。调整视野范围（即图像深度、深度偏移和图像宽度），以覆盖脊髓损伤部位及其邻近的健康组织。调节二维增益以优化图像对比度。</li>
	<li>通过由电子控制的显微操作器在脊髓损伤（SCI）部位上移动超声探头，以50 µm的层间间隔，在多个矢状面切片位置获取覆盖该区域的B模式图像。采集包含500帧的动态图像，帧率约为50帧/秒，探头频率为40 MHz。 
	注意：此设置需要由远程操纵杆控制的电子显微操作器（步骤8.2）。</li>
	<li>完成扫描序列后，返回步骤7。</li>
</ol>

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<li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Progress+of+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Progress of Physiology.</a> The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于脊髓损伤的风险较高，本方案的关键步骤是去除棘突，并在需要时扩大骨性结构对脊髓腔的通路。如方案中所述，强烈建议首先去除最 cranial（头侧）的棘突，这样更 caudal（尾侧）的棘突可起到保护作用，防止剪刀意外损伤脊髓。建议确保有足够的手术暴露，即初始切口不宜过小。此外，使用镊子夹持组织时，必须始终注意牵拉的方向。应轻柔地向远离脊髓的方向牵拉，以便在夹持失败或器械滑脱时保护脊髓。
蝾螈的手术操作与其他动物并无不同，但仍存在某些重要差异，主要归因于其组织构成和动物体型。蝾螈的腹侧皮肤极为脆弱，且在切口造成的小面积损伤后反而愈合不良。操作时应格外谨慎，尤其是在进行初始切口时，因为组织损伤会显著增加缝合难度。幼年蝾螈的骨骼非常柔软，这意味着通常使用基本的解剖镊即可完成骨组织去除。这也提示需格外小心，因为夹持棘突可能造成严重损伤。由于其组织结构脆弱，皮下组织和肌肉筋膜层无法用于缝合。必须确保术后一周内环境安静。动物在术后可能无法充分休息，从而导致脊髓继发性损伤。其微小的解剖结构使得无论是内固定还是夹板固定均无法实现。
下落杆系统...

本研究的总体目标是建立一种可控且可重复的显微外科方法，用于对墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）造成钝性与锐性脊髓损伤，从而构建一种具有再生能力的脊髓损伤模型。
脊髓损伤（SCI）是一种严重疾病，根据损伤的水平和范围，会导致四肢神经功能障碍以及膀胱和肠道控制能力受损1,2,3。大多数脊髓损伤由高能量钝性创伤引起，例如交通事故和跌落4,5。锐器伤极为罕见。因此，最常见的宏观损伤类型为挫伤。
哺乳动物的中枢神经系统（CNS）是一种不可再生的组织，因此脊髓损伤（SCI）后无法恢复神经组织6,7,8。然而，某些动物具有令人关注的组织再生能力，包括中枢神经系统组织的再生。其中一种动物是墨西哥钝口螈（axolotl）。它在再生生物学研究中被广泛使用，因其作为脊椎动物，在脊髓再生研究中具有重要价值9,10,11,12。
在墨西哥钝口螈中，大多数脊髓损伤（SCI）研究通常采用完全截除尾部或大范围消融脊髓的方法9,10,11,12。最近，一项关于钝性损伤的新研究被发表，该模型更贴近临床实际情况13。在墨西哥钝口螈中，完全附肢截除能够实现完全再生，而某些非截除性再生现象则依赖于临界尺寸缺损（CSD）14,15，这意味着超过某一临界阈值的损伤将无法再生。为了建立具有更高临床转化价值的再生模型，本研究探讨了2 mm的钝性创伤是否超过CSD的极限。
该方法适用于在小型动物模型（尤其是蝾螈）中研究脊髓再生的研究人员。此外，该方法可能具有更广泛的适用性，因为它展示了一种利用常规实验室设备构建钝性损伤机制的方法，该机制总体上适用于小型动物。

<table><tbody><tr><td>25 克定制落杆</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 毫米 PVC 管</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>67-64-1</td><td>丙酮</td></tr><tr><td>墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）</td><td>Exoterra GmbH</td><td>不适用</td><td>体长 12–22 厘米，体重 10 克 – 80 克，所有品系（野生型、黑化型、白色型、白化型、带 GFP 的转基因白色型）</td></tr><tr><td>苯佐卡因</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>94-09-7</td><td>对氨基苯甲酸乙酯</td></tr><tr><td>电磁铁</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td>微软</td><td>不适用</td><td>Excel 2010 或更新版本</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>ImageJ 1.5e 或更新版本。Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016。</td></tr><tr><td>吸水纸巾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微外科器械</td><td>不适用</td><td>不适用</td><td>镊子和剪刀</td></tr><tr><td>MS550s</td><td>富士胶片，Visualsonics</td><td>MS550s</td><td>中心频率 40 MHz，换能器</td></tr><tr><td>MS700</td><td>富士胶片，Visualsonics</td><td>MS700</td><td>中心频率 50 MHz，换能器</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>任意厂家</td><td></td><td></td></tr><tr><td>软布</td><td>不适用</td><td>不适用</td><td>任意一块尺寸约为 70 × 55 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 的软布，例如厨房抹布</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100</td><td>富士胶片，Visualsonics</td><td>Vevo 2100</td><td>高频超声成像系统</td></tr></tbody></table>

通过显微外科椎板切除术在再生型墨西哥钝口螈中建立挫伤性脊髓损伤模型

Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl

本研究旨在建立一种标准化且可重复的墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）脊髓钝性损伤再生模型。大多数临床脊髓损伤是由高能量钝性创伤引起的挫伤。然而，目前针对墨西哥钝口螈脊髓的研究大多采用锐性创伤模型。因此，本研究旨在构建一种更具临床相关性的再生模型。由于墨西哥钝口螈具有惊人的几乎任何组织再生能力，它们被广泛用作再生研究的模型，并已在脊髓损伤（SCI）研究中得到广泛应用。在本实验方案中，通过将墨西哥钝口螈浸入苯佐卡因溶液中进行麻醉。在显微镜下，在后肢稍尾侧水平两侧做斜行切口。由此切口可分离并暴露棘突。使用镊子和剪刀进行双节段椎板切除术，以暴露脊髓。自制一种由圆筒内下落杆组成的创伤装置，利用该装置对脊髓造成挫伤。随后缝合切口，动物从麻醉中恢复。该手术入路成功实现了脊髓的暴露。创伤机制可导致脊髓挫伤，组织学、磁共振成像（MRI）及神经学检查结果均证实了这一点。最终，脊髓从损伤中实现再生。该实验方案的关键步骤是在不损伤脊髓的前提下去除棘突。此步骤需要经过训练以确保操作安全。此外，伤口闭合的成功与否高度依赖于在切口过程中避免对皮肤造成不必要的损伤。本方案已在12只动物的随机研究中实施。

该实验方案的目的是制造一种脊髓损伤（SCI），以使损伤部位尾侧的运动和感觉功能瘫痪。由于蝾螈具有再生能力，其功能可在数周内恢复，从而使研究人员能够在较短时间内研究中枢神经系统（CNS）的再生过程。
所有动物均接受了45分钟的麻醉，期间未出现早于预期的苏醒情况。所有动物均在1小时内恢复，且在随后的数周内未表现出任何麻醉相关的损伤迹象13,16。
所有动物的椎板切除术均取得成功。然而，由于个体间脊髓腔宽度存在解剖学差异，部分动物需使用镊子并施加扭转力以扩大椎管。此外，部分个体中残留的椎板会阻碍下落杆到达目标位置，因此外科医生必须彻底清除残留骨质及突出结构，以确保手术区域的清洁。
缝合切口时遇到了一些困难，尤其是在研究的初步阶段。龙骨上部的缝线无法牢固固定，导致闭合不充分。研究中有一只动物的切口缝合未能成功，导致龙骨撕裂，继发感染并死亡。这强调了沿整个切口进行仔...

本文介绍了在具有再生能力的墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）上实施可控钝性与锐性脊髓损伤的手术方案。

本研究的目的是在墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）中建立一种标准化且可重复的再生性钝性脊髓损伤模型。

本方案首次在墨西哥钝口螈脊髓再生研究中引入了一种标准化的挫伤型损伤模型。该技术的主要优势在于能够模拟临床中常见的创伤，从而提高未来研究成果向临床应用转化的可能性。这种挫伤损伤装置也可用于其他任何小型动物的脊髓损伤模型。手术技术难度较高，尤其是椎板切除术。因此，在开展活体手术之前，建议先在大量动物标本上进行体外操作训练。开始时，将标准的培养皿置于手术布上，并放置在体视显微镜下，以搭建手术操作台。将麻醉后的墨西哥钝口螈腹侧朝下放置在培养皿中，并用纸巾包裹，使尾部暴露。确定后肢位置，使用一对显微剪在后肢稍后方进行第一道切口。从龙骨处开始做垂直切口，直至触及棘突的骨性隆起。将切口向两侧延伸，使切口横贯尾部的整个宽度，并用镊子夹住棘突以确保适当的深度。然后在棘突下方两侧各延伸垂直切口1毫米。将动物侧放，从垂直切口的腹侧端点开始，对体重为10至20克的动物做一条长约15毫米的水平切口。使用剪刀从横向切口处立即进行解剖，直至在中线位置触及脊柱。然后将动物翻转至另一侧，重复上述操作。从两侧完成深层内侧平面的解剖后，沿中线继续解剖，使两侧横向切口相连。然后，将游离的尾部和尾鳍部分移向一侧，以暴露棘突。将动物置于俯卧位，头部朝向术者非优势手一侧，用镊子夹住后肢稍尾侧的棘突，轻轻向上并朝向动物头部方向提起。将显微剪刀的刀片水平放置于棘突周围，轻轻剪切以暴露脊髓。抓住刚被移除棘突尾侧的下一个棘突，重复此操作。在移除过程中，必须持续轻提棘突，以确保其不会对脊髓造成损伤。如果暴露的区域不够宽，可使用两把镊子分别夹住脊髓两侧的椎板，并轻轻向外侧扭转。在去除棘突时，可能需要分多个步骤进行操作。因此，暴露脊髓可能需要数分钟时间。为了造成挫伤型损伤，使用培养皿将动物转移到创伤装置上，并用手电筒照射脊髓。然后，利用微调装置将挫伤创伤装置的圆筒置于暴露的脊髓上方，并降低圆筒直至其与椎板水平对齐。将下落杆固定在电磁铁上，并在创伤装置上安装所需下落高度的调节圆筒。接下来，将下落杆放置在圆柱体上，关闭电磁铁使杆下落至暴露的脊髓上，然后使用高度调节螺丝将杆重新抬高。若需造成锐性损伤，则在脊髓上做完全垂直的切割，随后在身体尾侧方向两毫米处重复切割。感受剪刀刀刃沿椎管腹侧刮擦，以确保切割完全，然后将脊髓组织块从椎管中取出。关闭手术切口时，从横向切口最尾端开始，使用10-0尼龙缝线单层缝合切口，并向切口的垂直部分推进。到达角度处时，旋转培养皿，缝合另一侧的横向切口，然后在垂直切口处缝合。在终止麻醉前，使用高频超声获取损伤部位的影像。将换能器的尖端与动物的体轴对齐，并浸入苯佐卡因溶液中，直至其位于动物后肢后方龙骨上方仅几毫米处。根据手稿中的指示确定损伤部位并采集图像。操作完成后，通过将培养皿浸入5厘米深的无麻醉剂淡水中，使动物自行滑落，从而将墨西哥钝口螈返回至无麻醉剂溶液中。使用该方案建立的脊髓损伤通过苏木精和伊红染色对受损及假手术组墨西哥钝口螈进行验证。为确认再生情况，在损伤后九周制备了组织学切片。图像显示，受损动物的脊髓连接已重新建立。通过检测神经功能来观察损伤与再生情况。根据动物对尾部刺激的反应进行评分，评分越高，表明触觉和伤害性感觉功能越强。在受损动物中，损伤后三周神经功能丧失，九周内逐渐恢复。还使用超声成像对脊髓损伤进行了可视化观察，该方法可显示背侧动脉，作为血管完整性的标志物。在损伤后立即以及伤后3周、6周和9周时进行了高场强MRI扫描。这些扫描能够观察到水肿以及脊髓完整性的恢复情况。损伤后立即进行的扫描容易受到噪声干扰。细致且精准的手术操作将为椎板切除术后获得成功结果奠定基础，同时避免对脊髓造成过早损伤。在此手术之后，可应用多种体内方法，例如成像技术和电生理技术。

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