NEMO 的 IKK 结合结构域的制备、结晶与结构测定

本方案有助于成功解析未结合状态下的NEMO蛋白IKK结合域的结构，并详细介绍了其制备与结晶过程。该方案利用卷曲螺旋适配器对NEMO蛋白IKK结合域片段天然构象的稳定作用，从而促进其结晶及结构解析。

以NEMO的结构生物学作为靶点，为开发用于治疗炎症性疾病、自身免疫性疾病及癌症的NEMO抑制剂提供了重要优势。本实验方案可进一步拓展至NEMO与肽类或小分子抑制剂复合物的结构解析，用于药物发现或优化。在蛋白质制备阶段，蛋白质的复性和浓缩是获得高纯度NEMO二聚体的关键步骤。

在结晶条件下限制聚集并确保溶解性。演示该实验步骤的是本实验室的研究生 Tamar 和 Amy。首先加入 20 毫升优质肉汤溶液。

向一个125毫升的锥形瓶中加入20微升浓度为100毫克/毫升的氨苄青霉素储备液，然后加入几微升保存在-80摄氏度的BL21DE3感受态细胞的甘油菌种。

用载体转化。将过夜培养的种子液在37摄氏度、220转/分钟振荡培养后，将细胞稀释至OD600为0.1，并加入250毫升优质培养基，再添加氨苄青霉素至终浓度为100微克/毫升。

当菌液的OD600达到0.8至1时，向培养物中加入IPTG，使其终浓度为500微摩尔。然后在37摄氏度下继续培养细胞4小时，直至OD600达到6至10。培养结束后，通过离心沉淀细胞。

将沉淀重悬于40毫升裂解缓冲液中。将重悬的细胞分装为两份，每份20至25毫升。在冷室中，使用French press对每份样品施加约25,000磅/平方英寸的压力，重复处理两到三次。

接下来，向细胞裂解液中加入尿素，使其终浓度为 8 摩尔/升。然后将细胞溶液在室温下于摇床上孵育 2 至 16 小时。次日早晨，将裂解液转移至超速离心管中，每管至少装至四分之三满。

将裂解液在超速离心机中离心45分钟。将上清液倾入50毫升锥形管中，并以每分钟3毫升的流速将含尿素的上清液上样至IMAC柱。

当所有上清液流经层析柱后，用结合缓冲液以每分钟3毫升的流速洗涤层析柱，洗涤体积为10个柱体积。随后进行梯度洗脱，洗脱NEMO-EEAA蛋白，咪唑浓度从10毫摩尔/升线性增加至500毫摩尔/升，梯度范围为12个柱体积。将洗脱液按每管1毫升分部收集至组分收集板中。

SDS-PAGE 分析后，收集含有纯化目标蛋白的组分，并根据标准方案通过 Bradford 法测定蛋白浓度。选择含有蛋白的洗脱组分。为切除 HIS6 标签并去除样品中过量的咪唑，按 TEV 蛋白酶与目标蛋白质量比 1:10 的比例，向目标蛋白样品中加入 TEV 蛋白酶。

将样品在4升20毫摩尔Tris、150毫摩尔氯化钠和2毫摩尔DTT溶液中孵育过夜。次日早晨，以每分钟1毫升的流速，将TEV酶切后的NEMO-EEAA样品上样至第二根IMAC柱。

以每份1毫升的体积，将穿流液收集至96孔馏分收集板中。用五倍柱体积的20毫摩尔Tris、150毫摩尔氯化钠和10毫摩尔咪唑溶液以每分钟1毫升的流速洗涤层析柱。最后一次洗涤后，用三倍柱体积的20毫摩尔Tris、150毫摩尔氯化钠、500毫摩尔咪唑和2毫摩尔DTT溶液将TEV及未切割的HIS6 NEMO-EEAA洗脱至50毫升烧瓶中。

收集流穿组分，其中含有切割后的NEMO-EEAA构建体，并使用搅拌式浓缩装置将样品浓缩至5 mL。按照所示方法过夜透析后，将5 mL样品上样至16 mm × 60 cm的凝胶过滤层析柱中。根据样品体积，必要时重复此步骤。

在每分钟一毫升的流速下，使用含有2毫摩尔Tris、100毫摩尔氯化钠和2毫摩尔DDT的溶液。收集对应于二聚体NEMO-EEAA的组分后，将样品在搅拌式浓缩器中浓缩，使用截留分子量为3千道尔顿的超滤膜，浓缩至最终浓度为113微摩尔。随后，将蛋白分装，于4摄氏度保存，可稳定存放长达一个月。

进行稀疏矩阵筛选时，向96孔双滴式结晶板的每个孔中加入60微升稀疏矩阵溶液。采用坐滴蒸气扩散法，并将蛋白质溶液加入机器人液滴点样仪中。

接下来，使用机器人点样仪，将浓度为每毫升1.65毫克的蛋白溶液以1:1的比例与储液槽溶液混合，向第一滴中加入100纳升，最终体积为200纳升。向第二滴中加入66纳升蛋白溶液和134纳升储液槽溶液，最终体积也为200纳升。然后立即使用宽度为三英寸的封板膜将板密封。

然后，将 trays 置于结晶成像仪储存装置中，在 20 摄氏度下保存。从储存载板后的两天开始，定期检查自动采集的图像，观察是否有晶体形成。对于晶种储备液的制备，将含有目标晶体的整个液滴转移至随晶种制备试剂盒提供的小瓶中，加入 50 µL 结晶条件溶液。

将种子储备液涡旋振荡，脉冲20秒，休息10秒，持续3分钟。然后将种子储备液按1:10梯度逐级稀释至1:10,000。将稀释液于4摄氏度保存，以备后续使用。

在向同步辐射光源运送前一至两天，从含有目标晶体的孔的顶部切开胶带，向孔中直接加入0.5微升含有12%一、二丙二醇（one, two propane DiO）的冷冻保护剂的结晶溶液。用冷冻环轻轻松动晶体。

从液滴中捞取晶体，并将含有晶体的冷冻环置于浸没在液氮中的样品托上，直至运送进行X射线衍射实验。收到X射线衍射数据后，在STAR和ISO服务器中处理缩放后的衍射强度数据。采用X射线晶体学指标化截断均值1.2作为数据衍射极限面的判定标准。

然后加载到 Phoenix 中。为了确定结构，使用 GCN4 的 X 射线结构作为搜索模型，在 Phoenix 中通过 MRage 进行分子置换。4DMD 结构将被定义为一个集合体。

MRage 溶液将成功构建至结构区域，该区域对应于 NEMO-EEAA 的末端卷曲螺旋接头部分，作为二聚体中两条链的搜索模型。在首次 IMAC 柱纯化前，过表达的蛋白出现在约 14 千道尔顿分子量标记处的条带位置。

第一次洗脱后，分别显示出 14 和 28 千道尔顿的单体条带和二聚体条带。经过第二次 IMAC 柱洗脱后，TEV 切割几乎完全，产物几乎全部为预期分子量的二聚体形式。

凝胶过滤层析显示一个单一峰，洗脱体积在60至65毫升之间，对应于二聚体。精细筛选获得的晶体可用于制备种子液，以促进NEMO-EEAA晶体的生长，用于数据收集。此处展示了典型的NEMO-EEAA晶体衍射图谱。

NEMO-EEAA 蛋白的结构分析显示，其形成一种长约 175 埃的同源二聚体、不规则的平行卷曲螺旋结构。规则的卷曲螺旋区域包含位于末端的理想的卷曲螺旋衔接序列，以及 NEMO 正常序列的前两个七肽重复单元。

在C末端也存在一个规则的卷曲螺旋结构，从NEMO的第97位残基开始，包含C末端理想的卷曲螺旋衔接结构域。IKKβ结合后的结构呈现出更为开放的卷曲螺旋构象，以容纳配体。

在此区域，螺旋间间距增大了1至2.2埃。NEMO中配体的结构为通过计算方法设计抑制剂提供了新的靶点，同时也可用于小分子化合物库对结合口袋的可视化筛选。

我们现在已获得工程化NEMO构建体与小分子配体复合物的结晶路径，这将有助于开发和优化一类新型抑制剂。