Name: NEMO IKK绑定域的生产、结晶和结构确定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: 学习NEMO IKK结合域的蛋白质表达、纯化与结晶方法，利用卷曲螺旋适配器稳定天然构象以进行X射线晶体学结构解析。该技术为炎症性疾病和自身免疫性疾病药物研发提供重要结构基础。

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我们感谢 D. Madden 教授在本项目期间进行的许多有益讨论。感谢 D. Bolon 教授惠赠含有优化 GCN4 卷曲螺旋的质粒。感谢 B. Guo 博士提供 NEMO 质粒。感谢 Christina R. Arnoldy、Tamar Basiashvili 和 Amy E. Kennedy 演示实验操作流程。感谢 BioMT 晶体学核心设施以及化学系和生物化学系 &amp;感谢达特茅斯学院细胞生物学系提供晶体学设备的使用，以及BioMT工作人员给予的支持。本研究使用了布鲁克海文国家实验室在合同号DE-SC0012704下为美国能源部（DOE）科学办公室运营的国家同步辐射光源II（NSLS II）的AMX光束线，NSLS II是美国能源部科学办公室下属的用户设施。我们感谢NSLS II工作人员提供的支持。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为R03AR066130、R01GM133844、R35GM128663和P20GM113132，以及Munck-Pfefferkorn创新与交互研究基金资助。

1. 用于晶体学的构建体设计
<ol>
	<li>按照先前发表的方法12，将NEMO-EEAA序列克隆至用于在E. coli中通过T7启动子表达的载体中，载体包含N端六组氨酸标签及蛋白酶切割位点。 
	注：在本方案中，我们使用了一种经过改造的载体，其包含N端六组氨酸标签和烟草蚀刻病毒（TEV）切割位点10。该载体便于在蛋白质结晶前切除His标签，并仅在目标蛋白序列起始前保留GSW残基的短序列延伸。该载体的来源及其他可选载体列于材料表中。在本方案中，对原始NEMO(44-111)序列的后续修饰是逐步引入的，如前所述10，采用定点诱变方法完成。我们最初尝试通过在N端或C端或两端添加理想的卷曲螺旋接头（长度至少为三个七肽重复单元）来稳定NEMO卷曲螺旋二聚体。在前期结晶试验中，双卷曲螺旋结构表现最为理想，随后进一步引入突变以改善结晶性能，具体方法见先前报道12。</li>
</ol>
2. 大规模表达带 His6 标签的 NEMO-EEAA
<ol>
	<li>将质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，并以甘油菌形式储存于-80 °C。</li>
	<li>第1天——准备种子培养物。在125 mL锥形瓶中加入20 mL terrific broth培养基和20 µL浓度为100 mg/mL的氨苄青霉素储备液，再加入数微升来自-80 °C保存的、已转化载体的BL21(DE3)感受态细胞甘油菌液。</li>
	<li>将10 mL种子培养物在37 °C、220 rpm条件下振荡培养过夜（约15小时）。</li>
	<li>第2天——取种子培养物按OD600 = 0.1的比例接种至250 mL terrific broth培养基中，加入氨苄青霉素至终浓度为100 µg/mL，培养至OD600 = 0.8–1.0。
	<ol>
		<li>加入终浓度为500 µM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在37 °C继续培养4小时。</li>
		<li>诱导4小时后测定培养物的OD600值，此时OD600应达到6–10。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. His6标签NEMO-EEAA的纯化
<ol>
	<li>3,800 x g 离心细胞培养物 g 4℃下持续20分钟 &#176;C.</li>
	<li>保存细胞沉淀，弃去培养基。 
	注意：细胞沉淀可保存并在 -20 ℃ 下储存 &#176;此时可将样品置于 C，以备后续纯化。</li>
	<li>用含有 20 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM 咪唑、2 mM MgCl₂ 的 40 mL 裂解缓冲液重悬细胞2，0.5 mM 苯甲基磺酰氟，2 mM 二硫苏糖醇（DTT），以及 3 &#181;苯甲酸酶核酸酶 L 
	注意：所使用的镍固定化金属离子亲和层析（IMAC）柱与2 mM DTT兼容。 alternatively，可使用0.2 mM三（2-羧乙基）膦（TCEP）。</li>
	<li>将重悬的细胞分装为两份，每份20-25 mL。</li>
	<li>使用法国压榨机（约25,000 psi压力）裂解细胞，在冷室中对每份样品重复操作2-3次。 
	注意：也可通过超声处理裂解细胞（本方案中未测试）。</li>
	<li>向细胞裂解液中加入尿素，使其终浓度为8 M，置于摇床上孵育至少2小时，或可长达过夜。除透析步骤外，此步骤及后续所有纯化步骤均可在室温下进行。</li>
	<li>第3天——将裂解液转移至超速离心管中，平衡重量，确保裂解液至少充满管子的 &#190; 全速离心裂解液，125,000 x g 25℃下持续45分钟 &#176;C. 将上清液倒入100 mL烧杯中，用于上柱。 
	注意：在 4 ℃ 下离心 &#176;C 会导致尿素析出。</li>
	<li>在快速液相色谱系统上，用25 mL超纯水冲洗IMAC 5 mL柱以去除乙醇2以5 mL/min流速用25 mL洗脱缓冲液（含20 mM Tris、150 mM NaCl、500 mM 咪唑、2 mM DTT，pH 8.0）洗脱，随后用25 mL结合缓冲液（含20 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM 咪唑、2 mM DTT、8 M 尿素，pH 8.0）洗脱。</li>
	<li>以3 mL/min的流速将含尿素的孵育上清液上样至IMAC柱，收集穿流液。用结合缓冲液以3 mL/min的流速洗涤柱体10个柱体积。</li>
	<li>以每分钟3 mL流速，用20倍柱体积的复性缓冲液（含20 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM 咪唑、2 mM DTT，pH 8.0）洗涤层析柱，使NEMO-EEAA蛋白在柱上复性。</li>
	<li>以12倍柱体积的梯度，对NEMO-EEAA进行10至500 mM咪唑的梯度洗脱，收集所有洗脱液至组分收集板中（每管1 mL）。</li>
	<li>用500 mM咪唑继续洗脱两个柱体积，持续收集。</li>
	<li>对各组分进行十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），以确定洗脱组分中是否存在NEMO-EEAA。 
	注：我们使用了10%丙烯酰胺和MES缓冲液。</li>
	<li>合并含有纯化目标蛋白的组分。</li>
	<li>通过 Bradford 法测定蛋白质浓度17. 
	注意：这是为了估算用于标签切割的蛋白酶用量。</li>
</ol>
4. His6标签的切割与纯化
<ol>
	<li>按 TEV:NEMO-EEAA 蛋白质量比 1:10 加入 TEV，以切割 His6 标签。TEV 蛋白酶为实验室自制。 
	注意：需单独优化完成切割所需的 TEV 用量、时间和温度。
	<ol>
		<li>在 BL21(DE3)-RIL 细胞中表达 TEV 蛋白酶 S219V 突变体18，并按照先前描述的方法进行纯化19。简要步骤如下：按步骤 2 所述培养细胞，使用高压匀浆器裂解细胞，并通过 IMAC 柱纯化。将最终蛋白储存于含 25 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.8）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、2 mM DTT 和 20% v/v 甘油的溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品在 4 L 的 20 mM Tris、150 mM NaCl、2 mM DTT、pH 8.0 缓冲液中透析过夜（约 15 小时），以促进切割反应完成，并去除样品中残留的过量咪唑，为后续纯化做准备。</li>
	<li>第 4 天——从透析袋中取出样品。对 TEV 切割后的样品进行 SDS-PAGE 电泳分析，确认切割是否完全。</li>
	<li>在快速液相色谱系统上，以 5 mL/min 流速用 25 mL 超纯 H2O 清洗 IMAC 5 mL 柱以去除乙醇，随后依次用 25 mL 洗脱缓冲液（含 20 mM Tris、150 mM NaCl、500 mM 咪唑、2 mM DTT，pH 8.0）和结合缓冲液（含 20 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM 咪唑、2 mM DTT，pH 8.0）平衡色谱柱。</li>
	<li>以 1 mL/min 流速上样经 TEV 切割的 NEMO-EEAA 样品。切割后的 NEMO-EEAA 将流穿出柱，收集至 96 孔馏分收集板中（每管 1 mL）。继续以 1 mL/min 流速用五倍柱体积的 20 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM 咪唑缓冲液洗涤色谱柱，并持续收集至馏分收集板中。</li>
	<li>用三倍柱体积的 20 mM Tris、150 mM NaCl、500 mM 咪唑、2 mM DTT、pH 8.0 缓冲液洗脱 TEV 蛋白及未切割的 His6-NEMO-EEAA，收集洗脱液至 50 mL 锥形瓶中。</li>
	<li>对流穿组分进行 SDS-PAGE 电泳分析，检测其中是否含有已切割的 NEMO-EEAA。</li>
	<li>合并含有切割后 NEMO-EEAA 构建体的流穿组分，使用搅拌式超滤浓缩器浓缩至 5 mL。所用膜的分子量截留值（MWCO）为 3 kDa。</li>
	<li>使用 MWCO 为 3 kDa 的超滤膜，将浓缩后的样品在 2 L 的 20 mM Tris、100 mM NaCl、2 mM DTT、pH 8.0 缓冲液中透析 2 小时。随后更换为 2 L 新鲜透析缓冲液，在 4 °C 下继续透析过夜（约 15 小时）。</li>
	<li>第 5 天——将 5 mL 透析后的样品以 1 mL/min 流速上样至尺寸排阻色谱（SEC）柱（16 mm × 60 cm，平均粒径 34 μm），流动相为 2 mM Tris、100 mM NaCl、2 mM DTT、pH 8.0。根据样品体积可重复使用额外色谱柱。</li>
	<li>收集对应于二聚体 NEMO-EEAA 的馏分。 
	注意：由于二聚体卷曲螺旋结构具有伸长构象，NEMO-EEAA 的洗脱体积在 60–65 mL 之间，对应表观分子量较大。</li>
	<li>使用搅拌式超滤浓缩器及 MWCO = 3 kDa 的超滤膜将样品浓缩至终浓度 113 µM（1.65 mg/mL）。</li>
	<li>将蛋白分装后于 4 °C 保存（可稳定保存超过 1 个月）。</li>
</ol>
5. 稀疏矩阵筛选
注意：本实验方案使用市售的结晶筛选试剂盒，并通过结晶机器人设置悬滴结晶实验。晶体图像由成像仪自动采集。
<ol>
	<li>使用市售的稀疏矩阵筛选试剂盒（见材料表），将60 µL稀疏矩阵溶液加入96孔坐滴蒸气扩散结晶板的每个孔中作为储液（reservoir溶液）。</li>
	<li>使用机器人液滴点样仪，将浓度为1.65 mg/mL的蛋白溶液以1:1比例与储液混合，向第一滴中加入100 nL蛋白溶液，最终体积为200 nL；然后向第二滴中加入66 nL蛋白溶液和134 nL储液，最终体积也为200 nL（1:2比例）。</li>
	<li>点样后立即使用3英寸宽的封板膜密封结晶板。 
	注意：若液滴暴露在空气中超过2–3分钟，将会干燥。</li>
	<li>将结晶板置于结晶成像仪的储存室中，在20 °C下保存，并从两天后开始自动采集图像，定期检查是否有晶体形成。 
	注意：结晶筛选与蛋白构建体的优化并行进行。初始晶体形成的条件如下（所用商业筛选试剂盒见材料表）：a) 0.1 M Tris，pH 8.0，30 % v/v 聚乙二醇（PEG）MME 550，5% 聚-γ-谷氨酸，200–400 kDa低分子量聚合物（PGA-LM）；b) 0.1 M Tris，pH 7.8，20% w/v PEG MME 2k，5% PGA-LM；c) 0.1 M Tris，pH 7.8，20% w/v PEG 3350，5% PGA-LM。稀疏矩阵筛选获得的晶体晶格均匀性较差，因此在交叉偏振成像下形态不佳；应使用紫外成像确认晶体中含有蛋白质。为获得最终可用于衍射的高质量晶体，必须进行后续的晶种制备步骤。</li>
</ol>
6. 种子库的制备
注意：我们可在 0.1 M Tris pH 8.0、5% PGA-LM、3.6% w/v PEG 20k 条件下稳定获得用于引晶的晶体。然而，此阶段的晶体马赛克性较高，不适合进行数据收集。
<ol>
	<li>使用成核试剂盒制备晶种储备液：用移液器吸取含有晶体的全部液滴，转移至所提供的样品瓶中50 µL的结晶条件溶液中。</li>
	<li>将晶种储备液涡旋振荡3分钟，工作模式为脉冲式，开启20秒，关闭10秒。</li>
	<li>将晶种储备液按1:10梯度依次稀释至1:10,000。所有稀释液储存于4 °C，以备后续使用。</li>
</ol>
7. 细筛
<ol>
	<li>设计精细筛选实验，调整 Tris、PGA-LM 和 PEG 的条件。对每个板分别改变 PEG 的长度。 
	注意：用于 NEMO-EEAA 结构测定的晶体所采用的精细筛选条件如下：0.1 M Tris，pH 8；PGA-LM 在第1至第12列中从8%变化至0%；A至H行筛选不同的 PEG，其浓度在第1至第12列中的变化如下：A：PEG 200（0–40% v/v）；B：PEG 400（0–40% v/v）；C：PEG MME 500（0–40% v/v）；D：PEG 1000（0–30% w/v）；E：PEG 3350（0–30% w/v）；F：PEG 6k（0–30% w/v）；G：PEG 10k（0–20% w/v）；H：PEG 20k（0–20% w/v）。晶体出现在 H4 孔（5.45% w/v PEG 20k，5.8% w/v PGA-LM）。在本方案中，使用蛋白质晶体学筛选构建液处理系统来制备筛选板。</li>
	<li>以 1:1,000 的种子稀释液按 1:25 的体积比接种蛋白储备液。 
	注意：NEMO-EEAA 的浓度会略有下降，但仍可形成晶体。</li>
	<li>重复步骤 2，使用 1:10,000 的种子稀释液，保持 1:25 的体积比。</li>
	<li>使用液滴分配仪，将 1.65 mg/mL 的蛋白溶液 100 nL 与 1:1,000 稀释的种子储备液按 1:1 体积比与储液混合，加入液滴 1，最终体积为 200 nL。对液滴 2 重复此操作，但使用 1:10,000 稀释的种子储备液。</li>
	<li>分配后立即使用宽 3 英寸的封板膜密封板。 
	注意：若暴露在空气中超过 2–3 分钟，液滴将干燥。</li>
	<li>将板置于成像仪储存区，20 °C 下保存，并在两天后检查采集的图像以确认晶体是否存在。</li>
	<li>使用交叉偏振成像仪检查晶体的晶格均匀性，以选择单一条件用于后续板的设置。</li>
</ol>
8. 用于数据收集的晶体生成
<ol>
	<li>围绕经交叉偏振图像分析后产生均匀晶体且晶体尺寸最大的 Tris、PGA-LM 和 PEG 条件，设计单一条件筛选实验。 
	注意：这些条件下生长的晶体形状不规则，多为矩形薄片。关键是要选择晶体边缘清晰、厚度尽可能大的条件。</li>
	<li>手动配制 20 mL 结晶条件溶液。</li>
	<li>使用多通道移液器，在用于坐滴气相扩散法的 2 滴室、96 孔结晶板中，每孔加入 60 µL 溶液。</li>
	<li>按照步骤 6.2 所述方法制备晶种储备液。</li>
	<li>按照步骤 6.3 所述方法加入蛋白溶液。</li>
	<li>加样后立即使用宽度为 3 英寸的封板膜密封整块板。 
	注意：若暴露在空气中超过 2–3 分钟，液滴将发生干燥。</li>
	<li>将板置于 20 °C 的成像仪中，并每日检查图像以确认晶体生长情况。</li>
	<li>通过检查晶体的交叉偏振图像评估晶格均匀性，以筛选适合进行数据收集的晶体。</li>
</ol>
9. 冷冻保护剂的确定
<ol>
	<li>为了测试冷冻保护剂，制备与结晶条件相对应的储备溶液，但每种组分的浓度分别提高30%、20%、10%和5%。加入冷冻保护剂体积后，各组分的最终浓度应与结晶条件相同。 
	注：对于在0.1 M Tris结晶条件下按体积比30%测试冷冻保护剂的情况，应在添加冷冻保护剂前使用0.143 M Tris的储备溶液。</li>
	<li>从冷冻试剂试剂盒中，通过将体积比30%的冷冻条件溶液与70%的结晶条件储备溶液混合，制备10 µL用于冷冻保护剂测试的样品，使冷冻保护剂在原始结晶条件中的终浓度为30%。充分混匀。
	<ol>
		<li>使用10 µL移液器吸取5 µL测试用冷冻保护溶液，将移液器吸头浸入液氮中。若观察到结冰现象，则弃去该样品。</li>
		<li>在30%浓度下测试所有冷冻保护剂。对获得成功保护效果的溶液，依次在20%、10%和5%的冷冻保护剂浓度下重复测试过程。</li>
		<li>选用成功保护效果中冷冻保护剂百分比最小的溶液，向含有晶体的测试液滴中加入0.5 µL该溶液。在显微镜下观察，并记录晶体在此条件下可维持的时间（若非无限稳定）。 
		注：这些晶体仅用于测试，随后将被弃去。对于NEMO-EEAA，12% 1,2-丙二醇为最优冷冻保护剂溶液。此处12%已考虑了当冷冻保护剂溶液加入约100 nL晶体液滴时发生的稀释效应，因此1,2-丙二醇的近似终浓度约为10%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 晶体环化
<ol>
	<li>在将样品送往同步辐射光源前1-2天进行悬滴结晶。 
	注意：晶体大小约为60-100 &#181;直径为0.05–0.10 mm的环状结构最适合用于环化。</li>
	<li>从孔板顶部剪断胶带。</li>
	<li>加入0.5 &#181;直接向孔中加入含有12% 1,2-丙二醇冷冻保护剂的L量结晶溶液。 
	注意：由于蒸气扩散导致液滴体积从初始的200 nL减少，加入100 nL的液滴溶液后发生稀释，1,2-丙二醇的最终浓度约为10%。</li>
	<li>从孔中捞取晶体。 
	注意：晶体常在孔底生长，但用环轻轻触碰即可使其脱落。一旦脱落，用环捞取。</li>
	<li>将含有晶体的冷冻环储存于浸没在液氮中的样品托内2.</li>
	<li>将这些样品环存放在液氮中2 在杜瓦瓶中保存，直至准备运往同步辐射光源进行X射线衍射实验。</li>
</ol>
11. 数据收集
<ol>
	<li>收集X射线衍射数据。在本方案中，使用国家同步辐射光源II的AMX光束线（ID: 17-ID-1）。 
	注意：数据可在现场收集，也可远程收集。在交叉偏振图像中显示晶格均匀性的晶体区域进行数据收集。将晶体置于环状支撑环中，确保在晶体于测角仪上旋转时，数据收集不涉及晶体的“劣质”区域。最佳分辨率的数据来自晶体延伸部分边缘约5 × 5 μm大小区域的采集。使用光栅扫描方法识别晶体上最适合数据收集的区域20。</li>
</ol>
12. X射线数据处理
<ol>
	<li>使用 XDS IDXREF 程序将数据集处理至最高分辨率（1.8 Å），以确定空间群、晶胞参数和溶剂含量。</li>
	<li>使用 XDS INTEGRATE 程序对数据进行积分。</li>
	<li>使用 STARANISO 服务器处理来自 XDS XSCALE 程序的缩放强度数据，采用 I/σI 截断均值为 1.2 作为数据衍射极限面的阈值。 
	注意：数据不会被截断为真正的椭球形。保留所有高于 I/σI 1.2 截断阈值的数据。由于非球形截断，按球形完整性计算的数据统计值会较差。椭圆完整性为 88%，沿 a*、b* 和 c 轴的最高分辨率分别为：1.88 Å、2.10 Å 和 2.55 Å。</li>
</ol>
13. 结构解析
<ol>
	<li>利用 GCN4 的 X 射线结构（PDB: 4DMD）15 作为分子置换的搜索模型，在 PHENIX22 中使用 MRage21 进行搜索。在 MRage 中将 4DMD 结构定义为“集合体”，MRage 的解成功构建了 NEMO-EEAA 的 N 端卷曲螺旋衔接结构域部分（与搜索模型同源）的结构，该结果包含二聚体中的两条链。 
	注意：在 PHASER 中关闭各向异性校正，否则数据会被进一步缩放。</li>
	<li>在 PHENIX 中使用多轮 Autobuild23，并结合手动建模（在 Coot24 中使用 2Fo-Fc 和 Fo-Fc 电子密度图），以构建结构的其余部分。</li>
	<li>基于 2Fo-Fc 和 Fo-Fc 电子密度图，在 Coot24 中手动将仍缺失的残基构建到模型中。 
	注意：最后阶段包括为每个单体构建前 4 个 N 端残基和后 4 个 C 端残基。侧链位置也根据需要进行手动调整。</li>
	<li>使用 PHENIX 计算复合缺失图，结构缺失比例设为 10%。</li>
</ol>
14. 结构精修
<ol>
	<li>使用 PHENIX Refine 精修结构。首先针对整体溶剂和立体化学权重进行初始精修，将键长和键角的均方根偏差（RMSbond 和 RMSangle）约束分别放宽至 0.01 和 1.0。随后继续对个体 B 值、TLS 参数和占据率进行精修。</li>
</ol>

<ol><li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+NF-kappaB%3A+players%2C+pathways%2C+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li>
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</ol>

作者声明无竞争利益。

NEMO在未结合状态下的结晶尝试均未成功，包括使用全长蛋白以及包含IKK结合域的多个截短构建体。我们通过圆二色光谱、核磁共振（NMR）波谱和荧光各向异性对NEMO的IKK结合域（残基44-111）进行的生物物理表征表明，该构建体尽管能够结合IKKβ，但处于构象交换状态，不适合结晶9,10。我们的策略是设计一种具有更稳定、折叠良好且类似天然构象的NEMO IKK结合域构建体，以消除阻碍结晶的柔性。将理想的卷曲螺旋结构域适配子融合至NEMO(44-111)序列的N端和C端，有助于稳定天然NEMO的二聚体卷曲螺旋结构并促进结晶14。如前所述10,12，通过SDS-PAGE、尺寸排阻色谱、圆二色光谱、荧光各向异性和核磁共振波谱对一系列蛋白构建体在每一步的行为进行了监测。尽管各项参数逐步改善，但在引入E56A和E57A突变之前，没有任何构建体获得可用于衍射的晶体。这些...

NF-κB 信号通路可响应多种刺激（包括细胞因子、微生物产物和应激）而被激活，进而调控靶基因的表达，这些靶基因参与炎症与免疫反应、细胞死亡或存活以及增殖过程1。研究表明，NF-κB 通路的过度激活与多种病理状态相关，包括炎症性疾病、自身免疫性疾病和癌症2,3,4,5，因此调控 NF-κB 活性已成为开发新型治疗策略的重要靶点6,7。
经典NF-κB通路与非经典通路的区别在于前者依赖支架蛋白NEMO（NF-κB必需调节因子8）来组装包含激酶IKKα和IKKβ的IKK复合物，而非经典通路则负责淋巴器官形成和B细胞活化。IKK复合物可介导IκBα（κB抑制蛋白）的磷酸化，从而使其靶向降解，释放NF-κB二聚体进入细胞核以启动基因转录1，因此IKK复合物是开发调节NF-κB活性抑制剂的理想靶点。
我们的研究聚焦于NEMO与IKKβ之间蛋白质-蛋白质相互作用的表征，旨在以NEMO为靶点，开发抑制IKK复合物形成的 小分子抑制剂。NEMO中结合IKKβ所需的最小结合结构域包含第44至111位氨基酸残基，其与对应于IKKβ第701至745位氨基酸序列的肽段结合状态下的结构已被解析9。NEMO与IKKβ形成一个四螺旋束结构，其中NEMO二聚体通过一个细长的开放沟槽容纳IKKβ(701-745)的两个螺旋，形成广泛的相互作用界面。IKKβ(734-742)也被称为NEMO结合域（NBD），是结合过程中最关键的热点区域，其中两个关键的色氨酸残基（739和741）深埋于NEMO的疏水口袋内。该复合物结构的详细信息有助于基于结构设计和优化靶向NEMO的小分子抑制剂。然而，小分子或肽类配体较难在NEMO上完全重现长链IKKβ(701-745)结合所引起的全部构象变化（即NEMO卷曲螺旋二聚体的显著打开），正如晶体结构中所观察到的那样；因此，游离状态的NEMO或与小分子抑制剂结合状态下的NEMO结构，可能是更理想的基于结构的药物设计与抑制剂优化的靶标。
全长NEMO及包含IKK结合域的较小截短片段在游离状态下，通过X射线晶体学和核磁共振（NMR）方法进行结构测定已被证明难以实现10，这促使我们设计了一种改进版本的NEMO IKK结合域。事实上，游离状态下的NEMO（44-111）仅部分折叠，并发生构象交换，因此我们致力于稳定其二聚体结构、卷曲螺旋折叠及稳定性，同时保留对IKKβ的结合亲和力。通过在蛋白的N端和C端分别添加三段理想的二聚体卷曲螺旋七肽重复序列11，并引入一系列四个点突变，我们构建了NEMO-EEAA。该构建体完全以稳定的卷曲螺旋二聚体形式存在，且其对IKK的结合亲和力恢复至纳摩尔级别，与全长NEMO相当12。此外，我们期望所引入的卷曲螺旋衔接序列（基于GCN4序列）有助于结晶，并最终通过分子置换法辅助X射线结构解析。类似地，卷曲螺旋衔接序列已被用于提高三聚体卷曲螺旋和抗体片段的稳定性、改善溶液行为并促进结晶13,14。NEMO-EEAA可在大肠杆菌（Escherichia. coli）中高效表达，并通过可切割的组氨酸标签进行纯化，具有良好的溶解性，形成稳定的二聚体卷曲螺旋结构，易于结晶，衍射分辨率可达1.9 Å。GCN4中有序的卷曲螺旋区域还有助于利用已知的GCN4结构，通过分子置换法对NEMO-EEAA晶体数据进行相位解析15。
鉴于在apo-NEMO-EEAA中获得的结果，我们认为本文所述的实验方案也可应用于NEMO-EEAA在小肽（如NBD肽）或小分子抑制剂存在条件下的结晶，旨在阐明NEMO抑制所需的关键条件，并基于结构对初始先导抑制剂进行高亲和力优化。鉴于许多卷曲螺旋结构域具有可塑性和动态特性16，使用卷曲螺旋适配器可能在促进其他类似蛋白的结构解析方面具有更广泛的应用前景。

<table><tbody><tr><td>20% w/v &amp;gamma;-PGA（钠盐形式，LM）</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD2-100-150</td><td>用于NEMO-EEAA的精细筛选结晶</td></tr><tr><td>3.5 kDa截留分子量透析膜</td><td>Spectra/Por</td><td>132724</td><td>用于透析去除咪唑</td></tr><tr><td>Amicon搅拌式超滤池</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFSC 05001</td><td>用于蛋白质浓缩</td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270</td><td>用于最小培养基标记</td></tr><tr><td>Benzonase核酸酶</td><td>Millipore Sigma</td><td>9025-65-4</td><td>用于核酸消化</td></tr><tr><td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL感受态细胞</td><td>Agilent Technologies</td><td>型号：230245</td><td>TEV表达</td></tr><tr><td>CryoPro</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-073</td><td>冷冻保护剂试剂盒</td></tr><tr><td>D-葡萄糖（右旋糖）</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9434</td><td>用于最小培养基标记</td></tr><tr><td>Difco超级肉汤培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>DF043817</td><td>用于菌体培养</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇 &gt; 99%</td><td>Goldbio</td><td>DTT25</td><td>用于还原二硫键</td></tr><tr><td>大肠杆菌：Rosetta 2 (DE3)</td><td>Novagen</td><td>71400-3</td><td>用于表达未标记的NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>FORMULATOR</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>液体处理仪/筛选板构建系统</td></tr><tr><td>HCl &amp;ndash; 1.0 M溶液</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-581</td><td>用于NEMO-EEAA的精细筛选结晶</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td>用于尺寸排阻纯化</td></tr><tr><td>HisTrap HP 5 mL柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17524802</td><td>用于纯化带His标签的NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>HT 96 MIDAS</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-59</td><td>用于NEMO-EEAA的稀疏矩阵筛选</td></tr><tr><td>HT 96 Morpheous</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-46</td><td>用于NEMO-EEAA的稀疏矩阵筛选</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>ThermoFisher</td><td>288-32-4</td><td>用于从His捕获柱中洗脱</td></tr><tr><td>异丙基-β-D-硫代半乳糖苷</td><td>Goldbio</td><td>I2481C5</td><td>用于诱导菌体表达</td></tr><tr><td>MRC2结晶板</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-083</td><td>结晶板</td></tr><tr><td>NT8 - 液滴点样仪</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>结晶</td></tr><tr><td>pET-16b</td><td>Millipore Sigma</td><td>69662</td><td>用于NEMO-EEAA的克隆</td></tr><tr><td>pET-45b</td><td>Millipore Sigma</td><td>71327</td><td>用于NEMO-EEAA的克隆</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟</td><td>ThermoFisher</td><td>36978</td><td>用于蛋白酶抑制</td></tr><tr><td>适用于45 Ti型超速离心转子的聚碳酸酯瓶</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td>超速离心瓶</td></tr><tr><td>聚乙二醇20,000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-609</td><td>用于NEMO-EEAA的精细筛选结晶</td></tr><tr><td>pRK793 (TEV)</td><td>Addgene</td><td>质粒8827</td><td>用于TEV蛋白酶生产</td></tr><tr><td>QuikChange XL II</td><td>Agilent Technologies</td><td>200522</td><td>定点突变</td></tr><tr><td>所需瓶盖组件：</td><td>Beckman Coulter</td><td>355623</td><td>超速离心瓶瓶盖</td></tr><tr><td>ROCK IMAGER</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>结晶成像系统</td></tr><tr><td>晶种珠试剂盒</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td>晶种制备</td></tr><tr><td>氯化钠 &amp;ge; 99%</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>用于纯化溶液的缓冲</td></tr><tr><td>TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）</td><td>Goldbio</td><td>TCEP1</td><td>还原剂</td></tr><tr><td>The Berkeley Screen</td><td>Rigaku</td><td>MD15-Berekely</td><td>用于NEMO-EEAA的稀疏矩阵筛选</td></tr><tr><td>The PGA Screen</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-50</td><td>用于NEMO-EEAA的精细筛选结晶</td></tr><tr><td>Tris &amp;ndash; 1.0 M溶液</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-589</td><td>用于NEMO-EEAA的精细筛选结晶</td></tr><tr><td>超纯Tris缓冲液（粉末形式）</td><td>ThermoFisher</td><td>15504020</td><td>用于纯化溶液的缓冲</td></tr><tr><td>尿素</td><td>ThermoFisher</td><td>29700</td><td>用于NEMO-EEAA的变性</td></tr></tbody></table>

nemo 的 ikk 结合结构域的制备、结晶与结构测定

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMO 是一种支架蛋白，在 NF-κB 通路中发挥关键作用，它通过与激酶 IKKα 和 IKKβ 组装形成 IKK 复合物来实现其功能。激活后，IKK 复合物会磷酸化 IκB 分子，导致 NF-κB 转位至细胞核并激活靶基因。抑制 NEMO 与 IKK 的相互作用是调节 NF-κB 通路活性的一种有吸引力的治疗策略，因此 NEMO 成为抑制剂设计与发现的重要靶点。为了促进 NEMO 抑制剂的发现与优化过程，我们构建了一种改良的 NEMO IKK 结合结构域，使其能够用于解析该蛋白在无配体状态（apo 形式）以及与小分子量抑制剂结合状态下的结构。本文介绍了用于设计、表达及结构表征 NEMO IKK 结合结构域的策略。该蛋白在 E. coli 细胞中表达，在变性条件下溶解，并通过三步层析方法进行纯化。我们讨论了获得用于结构解析晶体的实验方案，并描述了数据采集与分析策略。这些方案将广泛适用于 NEMO 与小分子抑制剂复合物的结构解析研究。

NEMO的IKK结合域的克隆、表达与纯化 
本研究中用于获得NEMO-EEAA最终序列的实验方案（图1A），该方法获得了可用于衍射的晶体，涉及所有中间构建体的表达与表征，包括在N端和/或C端添加卷曲螺旋衔接子、C76A与C95S突变，以及E56A与E57A突变。 图1B 展示了按照方案中所述纯化过程各阶段所收集样品的SDS-PAGE凝胶图 图1C该蛋白在...中过表达 E. coli 在SDS-PAGE凝胶上呈现为一条分子量约为14 kDa的条带（第3泳道，细胞在收获时收集，并在添加了8 M尿素的Laemmli样品缓冲液中裂解）。经过第一次IMAC柱纯化后，蛋白已基本纯化，在SDS-PAGE凝胶上显示为14 kDa和28 kDa分子量标记处的单体与二聚体条带（第9泳道）。按照方案进行TEV酶切后，切割几...

我们描述了通过X射线晶体学测定NEMO蛋白IKK结合域结构的实验方案。该方法包括蛋白质的表达、纯化与表征，以及获得其无配体结合形式蛋白质高质量晶体并完成结构解析的策略。

NEMO 的 IKK 结合结构域的制备、结晶与结构测定

NEMO 是一种支架蛋白，在 NF-κB 通路中发挥关键作用，通过与激酶 IKKα 和 IKKβ 组装形成 IKK 复合物……

本方案有助于成功解析未结合状态下的NEMO蛋白IKK结合域的结构，并详细介绍了其制备与结晶过程。该方案利用卷曲螺旋适配器对NEMO蛋白IKK结合域片段天然构象的稳定作用，从而促进其结晶及结构解析。以NEMO的结构生物学作为靶点，为开发用于治疗炎症性疾病、自身免疫性疾病及癌症的NEMO抑制剂提供了重要优势。本实验方案可进一步拓展至NEMO与肽类或小分子抑制剂复合物的结构解析，用于药物发现或优化。在蛋白质制备阶段，蛋白质的复性和浓缩是获得高纯度NEMO二聚体的关键步骤。在结晶条件下限制聚集并确保溶解性。演示该实验步骤的是本实验室的研究生 Tamar 和 Amy。首先加入 20 毫升优质肉汤溶液。向一个125毫升的锥形瓶中加入20微升浓度为100毫克/毫升的氨苄青霉素储备液，然后加入几微升保存在-80摄氏度的BL21DE3感受态细胞的甘油菌种。用载体转化。将过夜培养的种子液在37摄氏度、220转/分钟振荡培养后，将细胞稀释至OD600为0.1，并加入250毫升优质培养基，再添加氨苄青霉素至终浓度为100微克/毫升。当菌液的OD600达到0.8至1时，向培养物中加入IPTG，使其终浓度为500微摩尔。然后在37摄氏度下继续培养细胞4小时，直至OD600达到6至10。培养结束后，通过离心沉淀细胞。将沉淀重悬于40毫升裂解缓冲液中。将重悬的细胞分装为两份，每份20至25毫升。在冷室中，使用French press对每份样品施加约25,000磅/平方英寸的压力，重复处理两到三次。接下来，向细胞裂解液中加入尿素，使其终浓度为 8 摩尔/升。然后将细胞溶液在室温下于摇床上孵育 2 至 16 小时。次日早晨，将裂解液转移至超速离心管中，每管至少装至四分之三满。将裂解液在超速离心机中离心45分钟。将上清液倾入50毫升锥形管中，并以每分钟3毫升的流速将含尿素的上清液上样至IMAC柱。当所有上清液流经层析柱后，用结合缓冲液以每分钟3毫升的流速洗涤层析柱，洗涤体积为10个柱体积。随后进行梯度洗脱，洗脱NEMO-EEAA蛋白，咪唑浓度从10毫摩尔/升线性增加至500毫摩尔/升，梯度范围为12个柱体积。将洗脱液按每管1毫升分部收集至组分收集板中。SDS-PAGE 分析后，收集含有纯化目标蛋白的组分，并根据标准方案通过 Bradford 法测定蛋白浓度。选择含有蛋白的洗脱组分。为切除 HIS6 标签并去除样品中过量的咪唑，按 TEV 蛋白酶与目标蛋白质量比 1:10 的比例，向目标蛋白样品中加入 TEV 蛋白酶。将样品在4升20毫摩尔Tris、150毫摩尔氯化钠和2毫摩尔DTT溶液中孵育过夜。次日早晨，以每分钟1毫升的流速，将TEV酶切后的NEMO-EEAA样品上样至第二根IMAC柱。以每份1毫升的体积，将穿流液收集至96孔馏分收集板中。用五倍柱体积的20毫摩尔Tris、150毫摩尔氯化钠和10毫摩尔咪唑溶液以每分钟1毫升的流速洗涤层析柱。最后一次洗涤后，用三倍柱体积的20毫摩尔Tris、150毫摩尔氯化钠、500毫摩尔咪唑和2毫摩尔DTT溶液将TEV及未切割的HIS6 NEMO-EEAA洗脱至50毫升烧瓶中。收集流穿组分，其中含有切割后的NEMO-EEAA构建体，并使用搅拌式浓缩装置将样品浓缩至5 mL。按照所示方法过夜透析后，将5 mL样品上样至16 mm × 60 cm的凝胶过滤层析柱中。根据样品体积，必要时重复此步骤。在每分钟一毫升的流速下，使用含有2毫摩尔Tris、100毫摩尔氯化钠和2毫摩尔DDT的溶液。收集对应于二聚体NEMO-EEAA的组分后，将样品在搅拌式浓缩器中浓缩，使用截留分子量为3千道尔顿的超滤膜，浓缩至最终浓度为113微摩尔。随后，将蛋白分装，于4摄氏度保存，可稳定存放长达一个月。进行稀疏矩阵筛选时，向96孔双滴式结晶板的每个孔中加入60微升稀疏矩阵溶液。采用坐滴蒸气扩散法，并将蛋白质溶液加入机器人液滴点样仪中。接下来，使用机器人点样仪，将浓度为每毫升1.65毫克的蛋白溶液以1:1的比例与储液槽溶液混合，向第一滴中加入100纳升，最终体积为200纳升。向第二滴中加入66纳升蛋白溶液和134纳升储液槽溶液，最终体积也为200纳升。然后立即使用宽度为三英寸的封板膜将板密封。然后，将 trays 置于结晶成像仪储存装置中，在 20 摄氏度下保存。从储存载板后的两天开始，定期检查自动采集的图像，观察是否有晶体形成。对于晶种储备液的制备，将含有目标晶体的整个液滴转移至随晶种制备试剂盒提供的小瓶中，加入 50 µL 结晶条件溶液。将种子储备液涡旋振荡，脉冲20秒，休息10秒，持续3分钟。然后将种子储备液按1:10梯度逐级稀释至1:10,000。将稀释液于4摄氏度保存，以备后续使用。在向同步辐射光源运送前一至两天，从含有目标晶体的孔的顶部切开胶带，向孔中直接加入0.5微升含有12%一、二丙二醇（one, two propane DiO）的冷冻保护剂的结晶溶液。用冷冻环轻轻松动晶体。从液滴中捞取晶体，并将含有晶体的冷冻环置于浸没在液氮中的样品托上，直至运送进行X射线衍射实验。收到X射线衍射数据后，在STAR和ISO服务器中处理缩放后的衍射强度数据。采用X射线晶体学指标化截断均值1.2作为数据衍射极限面的判定标准。然后加载到 Phoenix 中。为了确定结构，使用 GCN4 的 X 射线结构作为搜索模型，在 Phoenix 中通过 MRage 进行分子置换。4DMD 结构将被定义为一个集合体。MRage 溶液将成功构建至结构区域，该区域对应于 NEMO-EEAA 的末端卷曲螺旋接头部分，作为二聚体中两条链的搜索模型。在首次 IMAC 柱纯化前，过表达的蛋白出现在约 14 千道尔顿分子量标记处的条带位置。第一次洗脱后，分别显示出 14 和 28 千道尔顿的单体条带和二聚体条带。经过第二次 IMAC 柱洗脱后，TEV 切割几乎完全，产物几乎全部为预期分子量的二聚体形式。凝胶过滤层析显示一个单一峰，洗脱体积在60至65毫升之间，对应于二聚体。精细筛选获得的晶体可用于制备种子液，以促进NEMO-EEAA晶体的生长，用于数据收集。此处展示了典型的NEMO-EEAA晶体衍射图谱。NEMO-EEAA 蛋白的结构分析显示，其形成一种长约 175 埃的同源二聚体、不规则的平行卷曲螺旋结构。规则的卷曲螺旋区域包含位于末端的理想的卷曲螺旋衔接序列，以及 NEMO 正常序列的前两个七肽重复单元。在C末端也存在一个规则的卷曲螺旋结构，从NEMO的第97位残基开始，包含C末端理想的卷曲螺旋衔接结构域。IKKβ结合后的结构呈现出更为开放的卷曲螺旋构象，以容纳配体。在此区域，螺旋间间距增大了1至2.2埃。NEMO中配体的结构为通过计算方法设计抑制剂提供了新的靶点，同时也可用于小分子化合物库对结合口袋的可视化筛选。我们现在已获得工程化NEMO构建体与小分子配体复合物的结晶路径，这将有助于开发和优化一类新型抑制剂。

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