Name: 分散（Ex Vivo）的毛骨球模型，去除了除位肌肉，用于在膀胱填充期间直接进入苏布罗氦 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 了解去除逼尿肌的离体小鼠膀胱模型，用于研究膀胱充盈期间尿路上皮介质在固有层和膀胱腔中的释放机制。该方法有助于揭示膀胱兴奋性的局部调控信号。

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本工作由美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所资助项目 DK41315 支持。

本文所述所有涉及动物的实验程序均按照美国国立卫生研究院 实验动物护理和使用的指南 内华达大学机构动物使用与护理委员会
注意：本研究所呈现的模型是在保留尿路上皮及黏膜下层/固有层（SubU/LP）完整的前提下，去除逼尿肌，以使研究者能够在膀胱充盈过程中直接接触黏膜下层/固有层（图1B）。
1. 无逼尿肌膀胱制备的解剖
<ol>
	<li>将分离的膀胱置于一个培养皿中，皿内盛有冷（10 °C）且用5% CO2/95% O2气体饱和的 Krebs 碳酸氢盐溶液（KBS），其成分为（mM）：118.5 NaCl、4.2 KCl、1.2 MgCl2、23.8 NaHCO3、1.2 KH2PO4、11.0 葡萄糖、1.8 CaCl2（pH 7.4）13。</li>
	<li>将分离膀胱顶部的一小部分用针固定在铺有 Sylgard 的解剖皿中，皿内充满 KBS 溶液。确保针穿过浆膜层或逼尿肌最外缘组织，远离面对黏膜下层/固有层（SubU/LP）的逼尿肌内侧边缘。</li>
	<li>在显微镜下辨认尿道和输尿管，并将它们分别固定在解剖皿底部。</li>
	<li>去除多余的脂肪组织和结缔组织，使膀胱主体、尿道以及双侧输尿管完全暴露。</li>
	<li>用6-0尼龙缝线结扎输尿管，然后将输尿管的开放端向下固定在解剖皿底部，以稳定标本。</li>
	<li>使用尖头镊子，轻轻牵拉输尿管与膀胱体交界处的一小片浆膜。</li>
	<li>调节显微镜光源以增强组织透明度，从而清晰分辨逼尿肌层下方黏膜下层的边界。</li>
	<li>使用尖头剪刀，沿逼尿肌层内表面开始剪切（不是剥离！），同时轻轻将已剪开的部分从标本上拉开。操作过程中始终确保可见黏膜的侧缘，并避免接触该区域。</li>
	<li>通过旋转解剖皿调整标本位置，以便更舒适地继续分离，直至完全去除逼尿肌。</li>
	<li>在膀胱顶部穹窿处保留一小块逼尿肌，以确保在后续操作步骤中能够固定和稳定标本。</li>
	<li>制作一个6-0尼龙线双环结，将其环绕膀胱标本的颈部，并保持环状结构松弛。</li>
	<li>再制作第二个6-0丝线双环结，同样环绕膀胱标本颈部，并保持环状松弛。使用两根缝线可防止缝合处出现渗漏。</li>
	<li>截取约2 cm长的20号PE导管（导管），将管尖缓慢靠近火焰加热，使其略微扩张。</li>
	<li>用温热（37 °C）且经氧气饱和的KBS溶液充满导管。</li>
	<li>将导管插入膀胱尿道开口，轻柔推进导管，直至其尖端到达膀胱中部位置。</li>
	<li>收紧缝线，将导管与膀胱颈部周围组织牢固结扎。</li>
	<li>缓慢向膀胱内注入约50–100 μL温热（37 °C）且经氧气饱和的KBS溶液，短暂提起标本（&#60;10 s）使其离开KBS液面，观察缝合处及膀胱壁是否有渗漏。</li>
	<li>若未观察到渗漏，则标本已准备好用于实验。若发现缝合周围有渗漏，应拆除缝线并重新结扎；若发现膀胱壁有破孔导致渗漏，则弃用该标本。</li>
</ol>
2. 去神经膀胱制备的灌注
<ol>
	<li>将预热至37 °C的KBS缓冲液灌注到一个底部为Sylgard材质、外层由37 °C水浴保温的3 mL器官槽中。</li>
	<li>调节供氧和吸引管道。</li>
	<li>将去黏膜的膀胱组织标本放入槽室内。</li>
	<li>将导管固定在槽室侧壁，防止标本漂浮至灌流液表面之上。</li>
	<li>将膀胱导管连接至一段更长的PE20导管（灌注管路），并通过相同规格的接头连接至三通旋塞阀。</li>
	<li>确保灌注泵、压力传感器与膀胱之间的管路处于开放状态。</li>
	<li>用新鲜、温热（37 °C）且充分氧合的KBS缓冲液填充灌注注射器。</li>
	<li>设置注射泵参数：注射器类型/容积（例如1 mL）、运行模式（例如“灌注”）、流速模式（例如“恒定”）以及流速（例如15 μL/min）。</li>
	<li>按下注射泵上的启动按钮开始向膀胱内灌注。</li>
	<li>在膀胱灌注过程中持续监测灌注体积和膀胱内压力。</li>
</ol>
3. 去除上皮膀胱制备物的逼尿肌/固有层区域中递质的检测
<ol>
	<li>将灌流液分装至预冷的微量离心管或高效液相色谱（HPLC）进样小瓶中，并置于冰上。</li>
	<li>根据相应的检测方法准备并处理样品。若需检测嘌呤类物质的含量，可采用高效液相色谱结合荧光检测法进行分析13,18。</li>
</ol>

<ol><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uroepithelial-associated+sensory+web%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).</li>
<li>Fry, C. H., Vahabi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Mucosa+in+Normal+and+Abnormal+Bladder+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+and+Clinical+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).</li>
<li>Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors%2C+channels%2C+and+signalling+in+the+urothelial+sensory+system+in+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviewes+Urology%22%5BJournal%5D)">Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder.</a> Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).</li>
<li>Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+is+released+from+rabbit+urinary+bladder+epithelial+cells+by+hydrostatic+pressure+changes--a+possible+sensory+mechanism%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism?</a> Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).</li>
<li>Wang, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+and+purinergic+receptor-dependent+membrane+traffic+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+for+Piezo1+in+stretch-evoked+Ca%282%29%28%2B%29+influx+and+ATP+release+in+urothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).</li>
<li>Mochizuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRPV4+cation+channel+mediates+stretch-evoked+Ca2%2B+influx+and+ATP+release+in+primary+urothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).</li>
<li>McLatchie, L. M., Fry, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+release+from+freshly+isolated+guinea-pig+bladder+urothelial+cells%3A+a+quantification+and+study+of+the+mechanisms+involved%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved.</a> BJU International. 115, 987-993 (2015).</li>
<li>Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic-+and+capsaicin-evoked+nitric+oxide+release+from+urothelium+and+afferent+nerves+in+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).</li>
<li>Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO%3A+effect+on+bladder+afferent+neurons+and+nitric+oxide+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release.</a> Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).</li>
<li>Birder, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanilloid+receptor+expression+suggests+a+sensory+role+for+urinary+bladder+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).</li>
<li>Birder, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-adrenoceptor+agonists+stimulate+endothelial+nitric+oxide+synthase+in+rat+urinary+bladder+urothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells.</a> Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).</li>
<li>Durnin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+bladder+model+with+detrusor+smooth+muscle+removed+to+analyse+biologically+active+mediators+released+from+the+suburothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium.</a> Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).</li>
<li>Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neuronal+cholinergic+system+in+human+bladder+urothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium.</a> Urology. 67, 425-430 (2006).</li>
<li>Beckel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pannexin+1+channels+mediate+the+release+of+ATP+into+the+lumen+of+the+rat+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder.</a> Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).</li>
<li>Collins, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OnabotulinumtoxinA+significantly+attenuates+bladder+afferent+nerve+firing+and+inhibits+ATP+release+from+the+urothelium%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium.</a> BJU International. 112, 1018-1026 (2013).</li>
<li>Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+afferent+pathways+and+urothelial+function+in+the+male+mouse+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder.</a> Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).</li>
<li>Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+purine+release+during+filling+of+murine+and+primate+bladders%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).</li>
<li>Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+signalling+underlies+transforming+growth+factor-beta-mediated+bladder+afferent+nerve+hyperexcitability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability.</a> Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).</li>
</ol>

本工作的部分内容此前已发表于《生理学杂志》（PMCID: PMC6418748；DOI:10.1113/JP27692413）。Wiley and Sons, Inc. 已授权使用该出版物中的材料。作者无任何财务或其他利益冲突需要披露。

膀胱具有两个功能：储存尿液和排空尿液。这些功能的正常运作需要对腔内体积和压力进行适当的机械感知，并通过膀胱壁内的细胞传导信号，以调节逼尿肌的兴奋性。人们认为，膀胱黏膜（尿路上皮）可通过释放多种信号分子进入固有层/黏膜下层（SubU/LP），影响膀胱壁内多种细胞类型，从而调控膀胱的兴奋性。目前，大多数对尿路上皮来源介质的表征研究依赖于使用无法模拟生理性膀胱充盈状态的膀胱组织制备物（例如，扁平的膀胱壁片、膀胱壁条或培养细胞）。在膀胱充盈末期检测膀胱腔内释放的介质含量，常被用作推断这些介质从尿路上皮对侧释放的依据。然而，近期研究表明，膀胱腔内的介质含量并不能代表膀胱壁深层区域的实际可用浓度13。为了进一步理解膀胱尿路上皮、固有层/黏膜下层（SubU/LP）与逼尿肌（DSM）之间局部信号传导机制，亟需发展可在膀胱充盈过程中直接获取SubU/LP区域样本的新实验方法。
在此，我们展示了一种新型的动物膀胱模型，该模型通过去除逼尿肌，从而在膀胱充盈期间直接获取来自尿路上皮在固有层/黏膜下层（SubU/LP）释放的介质<sup class="xref...

该模型的目的是在膀胱充盈的不同阶段，实现对膀胱黏膜黏膜下层的直接接触。
膀胱在充盈过程中必须避免过早收缩，并在达到临界容积和压力时排空。在膀胱充盈过程中，尿液的异常潴留或排泄通常与膀胱逼尿肌平滑肌（DSM）的兴奋性异常有关。DSM的兴奋性由平滑肌细胞内在的因素以及膀胱壁内不同类型细胞产生的影响共同决定。尿膀胱壁由尿路上皮（黏膜）、尿路上皮下层（SubU）/固有层（LP）、逼尿肌平滑肌（DSM）和浆膜组成（图1A）。尿路上皮由伞状细胞（即尿路上皮的最外层）、中间细胞和基底细胞（即尿路上皮的最内层）构成。多种类型的细胞存在于SubU/LP中，包括间质细胞、成纤维细胞、传入神经末梢、小血管和免疫细胞。目前普遍认为，膀胱尿路上皮是一种感觉器官，可通过向黏膜下层释放介质来启动排尿反射和控尿机制，这些介质可影响SubU/LP和DSM中的细胞1,2,3。这些假设主要基于以下研究：已证实当黏膜组织暴露于静水压变化时会释放介质4,5；当培养的尿路上皮细胞受到牵张6,7、低渗诱导的细胞肿胀7或拖曳力8刺激时会释放介质；当离体膀胱壁条通过受体或神经激活时会释放介质9,10,11,12,13,14；以及在膀胱充盈末期于膀胱腔内检测到介质释放15,16,17,18,19。尽管这些研究对于证明膀胱壁节段或培养的尿路上皮细胞在机械刺激下释放介质具有重要作用，但仍需提供直接证据，以证实生理刺激（模拟膀胱充盈过程）可诱导黏膜下层中介质的释放。由于SubU/LP位于膀胱壁深层，在膀胱充盈期间难以直接接近其周围区域，因此这一任务极具挑战性。
本文介绍了一种去除了逼尿肌的去中心化（离体）小鼠膀胱模型13，该模型旨在促进对参与膀胱尿路上皮、逼尿肌平滑肌（DSM）及其他膀胱壁细胞类型之间信号传导的局部机械转导机制的研究。该方法优于使用扁平膀胱壁片、膀胱壁条带或培养的尿路上皮细胞，因为它能够在生理性的膀胱压力和容积条件下，直接测量尿路上皮来源的介质在尿路上皮下层/固有层（SubU/LP）附近的释放或生成情况，同时避免了细胞培养中可能出现的表型改变。该模型可用于在膀胱充盈的不同阶段测量介质在SubU/LP中的可利用性、释放、代谢及跨尿路上皮转运（图1B）。此外，该制备方法也可用于研究膀胱过度活动症和膀胱活动不足综合征模型中的尿路上皮信号传导与机械转导过程。

<table><tbody><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>费舍尔</td><td>C79</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>费舍尔</td><td>D16</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>解剖针</td><td>精细科学工具</td><td>26002-20</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>输液泵</td><td>肯特科学</td><td>GenieTouch</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>KCl</td><td>费舍尔</td><td>P217</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>费舍尔</td><td>P284</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>光源</td><td>SCHOTT ACEI</td><td></td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>奥林巴斯 SZX7</td><td></td><td>可灵活使用任意显微镜</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>费舍尔</td><td>M33</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>费舍尔</td><td>S671</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>费舍尔</td><td>S233</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>25G针头</td><td>贝克顿·迪金森</td><td>305122</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>器官浴槽</td><td>定制</td><td></td><td>来源灵活；我们由Radnoti解剖皿制成</td></tr><tr><td>PE-20导管</td><td>Intramedic</td><td>427405</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>AD仪器</td><td></td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>S&amp;T镊子</td><td>精细科学工具</td><td>00632-11</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>压力-容积分析软件</td><td>AD Instruments</td><td>Power lab</td><td></td></tr><tr><td>尼龙缝线，6-0</td><td>AD外科</td><td>S-N618R13</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>丝线缝线，6-0</td><td>通过布雷因特里科学公司采购的Deknatel</td><td>07J1500190</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>1 mL注射器</td><td>贝克顿·迪金森</td><td>309602</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>Vannas弹簧剪</td><td>精细科学工具</td><td>15000-08</td><td>来源灵活</td></tr><tr><td>水循环器</td><td>百特</td><td>K-MOD 100</td><td>来源灵活</td></tr></tbody></table>

一种去除了逼尿肌的离体小鼠膀胱模型，用于在膀胱充盈过程中直接接触尿路上皮下层

A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling

既往研究已证实，固定在尤斯灌流室中并暴露于静水压变化或机械牵张的扁平膀胱黏膜片、在静水压变化、牵张、细胞肿胀或流体剪切力作用下的培养尿路上皮细胞，以及在膀胱充盈末期的膀胱腔内，均可释放化学物质。这些发现促使人们推测，在膀胱充盈过程中，这些介质同样会在尿路上皮下层（SubU）/固有层（LP）中释放，并作用于膀胱壁深层的细胞，从而最终调控膀胱的兴奋性。然而，此类研究至少存在两个明显局限性：1）上述方法均无法直接提供关于介质在SubU/LP中实际存在的信息；2）所使用的刺激并非生理性刺激，不能真实模拟膀胱的自然充盈过程。本文中，我们介绍一种可在膀胱充盈过程中直接获取膀胱黏膜尿路上皮下表面的实验方法。我们建立的小鼠去逼尿肌膀胱制备模型，能够高度模拟完整膀胱的充盈过程，并可在排除脊髓反射和逼尿肌平滑肌干扰信号的情况下，进行膀胱的压力-容积研究。利用这一新型的去逼尿肌膀胱模型，我们近期证明了膀胱腔内测得的介质浓度不能作为SubU/LP在膀胱充盈期间释放或存在介质的可靠替代指标。该模型可用于研究在膀胱充盈过程中由尿路上皮释放、经代谢生成和/或转运至SubU/LP的信号分子，这些分子可向膀胱的神经元和平滑肌传递信息，从而在控尿和排尿过程中调节膀胱的兴奋性。

小鼠去逼尿肌膀胱制备物的壁保持完整，包含除逼尿肌层（DSM）和浆膜以外的所有层次。原理性研究证明，去逼尿肌的膀胱壁包括尿路上皮和固有层/黏膜下层（SubU/LP），而tunica muscularis及浆膜则不存在（图2）13。
无逼尿肌膀胱的充盈过程近似于正常膀胱的充盈。图3展示了在不同灌注速率、容积和腔内压力下，离体膀胱标本灌注实验装置的示意图。小鼠离体完整膀胱和去上皮膀胱标本需要较宽范围的灌注容积才能达到排尿压力13。完整与去上皮标本的压力-容积关系极为相似（视频1、视频2以及图4）。因此，无逼尿肌膀胱标本适用于研究尿路上皮...

去逼尿肌的膀胱模型可直接进入尿路上皮下层，用于研究在储尿和排尿过程中，尿路上皮下层/固有层中生物活性介质可利用性的局部调控机制。该制备方法 closely 模拟完整膀胱的充盈状态，并允许在无系统性影响的情况下进行压力-容积研究。

先前的研究已证实，将扁平膀胱黏膜片固定在尤斯灌流室（Ussing chamber）中并暴露于各种刺激时，会释放化学物质……

我们采用去除逼尿肌的膀胱模型，是一种可同时研究膀胱充盈过程中尿路上皮介质在固有层及膀胱腔内释放情况的新型实验方法。该模型有助于深入理解尿路上皮、尿路上皮下层与逼尿肌之间调控膀胱兴奋性的信号传导机制。首先，将完整的小鼠膀胱标本置于解剖皿中，在解剖显微镜下用含氧的 10°C KBS 缓冲液清洗膀胱周围结缔组织和脂肪组织。将分离出的膀胱顶部的一小部分，从逼尿肌最外侧边缘（远离面对黏膜下层固有层的逼尿肌内侧边缘）处完全固定到盛有KBS溶液的硅胶包被的解剖皿中，并将输尿管和膀胱颈固定，以展示完整的膀胱制备标本。使用尖头镊子，轻轻牵拉输尿管与膀胱体交界处的一小片浆膜，并调节显微镜光源以增强组织透明度，从而清晰辨识逼尿肌下方黏膜下层的边界。为避免穿破制备标本的壁层，务必仅在膀胱黏膜的侧缘清晰可见时，才切除逼尿肌组织。使用尖头剪刀，从逼尿肌层内表面开始剪开膀胱壁，同时轻轻将剪下的组织段从标本上拉开，注意观察黏膜侧缘，避免触碰组织边缘。在膀胱顶部保留一小块逼尿肌，以便在后续实验步骤中固定标本，并用一段2厘米长的20号聚乙烯导管装满37摄氏度的含氧KBS溶液。将导管插入膀胱尿道开口后，轻柔推进导管，直至导管尖端到达膀胱的大致中段位置。然后使用双环6.0尼龙缝线将导管固定于膀胱颈周围的组织中。检查组织有无渗漏后，将去上皮的膀胱标本置于底部为Sylgard的3毫升水浴器官槽中，槽内水温维持在37°C，并将导管固定在槽壁上，防止标本漂浮至灌注液表面之上。将膀胱导管连接至一段聚乙烯20导管，该导管连接三通旋塞和一个装有37°C氧合KBS溶液的灌注注射器，启动输液泵以KBS溶液灌注膀胱，注意在灌注过程中监测膀胱内压及灌注体积。为了检测制备样本中黏膜下层固有层内的介质，应在各个适当的实验时间点收集浴液等分试样，并根据计划的下游分析方法处理样本。去除了肌层的膀胱制备物管壁包含尿路上皮和黏膜下层，但不含逼尿肌平滑肌。完整与去肌层制备物的压力-容积关系极为相似。可通过测量去上皮组织标本的黏膜下层固有层侧释放到灌流液中的嘌呤类介质，来验证该模型在检测膀胱充盈期间由尿路上皮释放至黏膜下层固有层的介质方面的适用性。如实验所示，在保留完整逼尿肌的离体膀胱标本灌流液中，检测到的嘌呤类物质含量极低；而在去上皮膀胱标本的灌流液中，这些嘌呤类物质的含量则显著升高。值得注意的是，在充盈末期分别从管腔侧和黏膜下层固有层收集的样本中，嘌呤及其代谢产物的分布存在显著差异。向去除逼尿肌的黏膜下层侧加入高荧光性的ATP类似物atheno ATP后，atheno ATP含量减少，同时其产物atheno ADP、atheno AMP和atheno ADO含量增加。同样，向管腔制备物中加入atheno ATP后，管腔内的atheno ATP减少，而atheno ADP、atheno AMP和atheno ADO增加。此外，向去上皮的黏膜下层固有层侧加入atheno ATP后，管腔内出现atheno AMP和atheno ADO。同样，向腔内添加atheno ATP会导致在尿路上皮下层固有层中出现atheno AMP和atheno ADO。通过此操作，可在膀胱充盈的不同阶段，测定固有层及膀胱腔内兴奋性和抑制性介质的可利用性。此外，还可利用该模型研究介质的双侧经尿道转运及其代谢过程。利用这一新型膀胱模型，将有助于深入理解尿路上皮与逼尿肌平滑肌之间调控膀胱兴奋性的内在局部机械敏感性信号传导机制，无论是在生理状态还是疾病状态下。

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了解去除逼尿肌的离体小鼠膀胱模型，用于研究膀胱充盈期间尿路上皮介质在固有层和膀胱腔中的释放机制。该方法有助于揭示膀胱兴奋性的局部调控信号。

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