Name: 慢性活体电成像的植入系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学习制造可植入系统用于长期活体肌电图记录，研究喉部肌肉神经再支配。该技术采用螺旋导线设计，适用于清醒活动动物，为神经肌肉干预研究提供稳定可靠的慢性电生理监测方法。

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作者感谢吴红梅博士在本研究期间对动物护理和数据收集所做出的贡献。我们感谢艾米·南纳利、杰米·艾德科克和菲尔·威廉姆斯在无菌手术方面的协助。范德堡大学动物护理设施工作人员的专业知识和敬业精神具有不可估量的价值。&#160;本研究由美国国立卫生研究院资助项目U01DC016033支持。

本研究已获得范德堡大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并依照美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，贝塞斯达，马里兰州）发布的《实验动物照护与使用指南》进行。该系统包含五个可植入组件和一条外部电缆。
1. 两个双极RLN刺激电极套管，每个均带有成对的盘绕导线和终端插针
<ol>
	<li>使用带特氟龙涂层的多丝型316不锈钢导线（绝缘外径为0.0078英寸或0.198 mm）作为每个套管引线。截取70 cm长的导线，使用绕线装置将其卷成12 cm长的弹簧，或直接采购预制的螺旋引线。如有需要，可拉伸弹簧以适应每个植入部位的长度要求。将螺旋引线两端分别保留3 mm和10 mm的直段，并剥除其绝缘层。</li>
	<li>将一个镀金铜质母针焊接到螺旋引线的3 mm端。</li>
	<li>准备神经套管时，从硅胶管卷材上截取一段5 mm长的硅胶管（外径 = 0.156英寸，内径 = 0.094英寸；或外径 = 3.96 mm，内径 = 2.39 mm）。</li>
	<li>为将引线插入管中，使用25 G注射针头在管壁末端1.5 mm处偏心穿刺，位置靠近内壁。将引线10 mm端从针尖插入针管内。抽出针头，使去绝缘部分留在管内。将裸露的导线末端弯折回管外，并在导线进入管壁处扭接固定。 
	注意：建议使用手术显微镜完成上述操作。可将探针插入管内，使导线紧贴内壁弯曲。目的是将导线裸露部分准确定位，以便在不损伤神经的前提下向神经传递刺激信号。</li>
	<li>采用相同方法，在管子另一端1.5 mm处插入第二根引线。使其进入点与第一根引线对齐。用针头穿刺管壁，使第二根引线的裸露部分位于与第一根引线相对的内壁附近。 
	注意：从管子一端观察，两个刺激电极应形成45°的“V”形结构，以便在植入后跨接神经，确保电流从阳极到阴极穿过神经组织。</li>
	<li>使用弯头剪刀在电极进入点对面的管壁上剪出一个S形切口。 
	注意：该螺旋状切口可在手术过程中打开，便于将神经置于电极之间的套管内部。</li>
	<li>使用弯头显微外科针将一段6-0单丝不可吸收缝合线分别穿入套管两端的管壁，用于最终将套管牢固固定在神经周围。</li>
	<li>在套管外部所有暴露的裸露导线部分涂覆医用A型硅胶凝胶，以重新进行绝缘处理。</li>
</ol>
2. 两个双极性SLN刺激电极套管，每个均带有一对盘绕的导线和终端针
<ol>
	<li>以与喉返神经刺激电极套管相同的方式组装喉上神经刺激电极套管。但由于神经直径较小，需使用较小直径的套管（外径 = 0.125英寸，内径 = 0.062英寸；或外径 = 3.18 mm，内径 = 1.57 mm）。</li>
</ol>
3. 两个PCA肌肉肌电图记录电极，每个均带卷曲导线和终端针
<ol>
	<li>按照步骤 1.1 的方法组装 PCA 肌肉电极的盘绕导线。</li>
	<li>按照步骤 1.2 的方法在导线上焊接一个雌性插针。</li>
	<li>使用与将导线插入套管相同的策略（步骤 1.4），将 PCA 肌肉导线的 10 mm 端插入深部脑刺激（DBS）电极的尖端。将导线末端弯成钩状并夹紧，以提供总共 5 mm 的记录长度。 
	注意： 在本应用中，PCA 肌肉及其再神经支配的神经末梢将接受电刺激调节。刺激信号由植入式脉冲发生器（IPG）产生，并通过 DBS 电极传递至喉部肌肉（图 1，插图）。该系统借鉴自治疗性脑刺激技术（例如用于帕金森病）。DBS 电极将被插入肌肉下 pockets 并固定到位。如果不需要对肌肉进行电刺激调节，则可将 PCA 肌电图电极直接插入肌肉，并通过其钩状结构固定。</li>
</ol>
4. 两个TA-LCA肌肉复合体EMG记录电极，每个均带卷曲导线和终端插针
<ol>
	<li>按照步骤1.1的方法，组装用于TA-LCA肌肉电极的盘绕导线。</li>
	<li>按照步骤1.2的方法，在导线上焊接一个雌性插针。</li>
	<li>剪取一块5 mm × 10 mm的针织聚酯移植物矩形片。使用20 G的皮下注射针在网片中央打一个孔。将导线的10 mm端插入孔中，使额外3 mm的线圈突出于孔外。使用6-0单丝不可吸收缝线将导线固定在网片上。 
	注意：该网片将用于将电极导线锚定在覆盖于肌肉复合体上方的甲状软骨上。</li>
	<li>弯曲导线末端形成一个钩状，并进行夹合，以提供总共5 mm的记录长度。</li>
</ol>
5. 用于电极与外部设备连接的皮肤受体
<ol>
	<li>使用单排母针条形连接器制作插座。从条形连接器上截取两段，每段长17.5 mm，每段包含八个针孔。首先用砂纸打磨每段的外表面，然后在通风橱中用苯酚将其粘合在一起，形成双排连接器。将连接器置于通风橱内的60–80 °C水中30分钟，使其胶水充分固化。 
	注意：这种双排组装结构将便于为左侧和右侧电极分配针孔。</li>
	<li>从条形连接器上截取一段25.6 mm长的部分作为连接器的面板（该部分将在植入部位外露，用于皮肤固定）。用手术刀在面板中央切割一个5.4 mm × 17.4 mm的矩形孔。</li>
	<li>将双排连接器插入面板的矩形孔中，使其与面板表面齐平，无突出部分。若连接器无法顺利插入面板的矩形孔，可用锉刀略微扩大孔径。由于连接器的孔径不对称，应将具有较大孔径的一侧边缘插入面板。 
	注意：如此操作后，将母针插入连接器另一侧较小孔径的边缘时，可实现卡扣锁定。</li>
	<li>使用苯酚将连接器与面板粘合固定。将组装件置于通风橱内的60–80 °C水中30分钟，使胶水充分固化。</li>
	<li>在面板的四个角以及面板两侧距端点一半位置处各钻一个直径1.3 mm的孔，共六个孔。 
	注意：这些孔将用于在植入部位缝合固定最终的皮肤插座。</li>
	<li>截取一段15 mm长的针织聚酯移植物管，包裹在面板下方的组装件周围，以提高组装件的生物相容性。为将管状物固定在组装件上，使用皮下注射针头在管壁长度方向上等距三点（每点间隔3.8 mm）穿入不锈钢丝。</li>
	<li>在连接器的每个角落制作等距的凹槽，用于将金属丝固定在组装件表面。使用钳子将每根金属丝的末端拧紧，使管状物紧贴组装件，形成裙边结构。</li>
	<li>在插座一端的聚酯补片上做一个永久性标记。 
	注意：在植入手术过程中，利用此标记进行定位，以识别插座的头端方向。从头端到尾端方向，两排（左侧和右侧）针孔电极的分配顺序应如下：PCA EMG、TA-LCA EMG、空孔、空孔、RLN阳极、RLN阴极、SLN阳极、SLN阴极。</li>
</ol>
6. 外部连接线至记录前置放大器和刺激器
注意：在神经刺激-肌电图记录实验（第8和第10节）期间，需使用一根电缆连接植入式皮肤接口与外部设备。该电缆由12根带绝缘层的导线组成，末端配有公针，可插入皮肤接口内的母针。此电缆分为两部分：肌电图记录插头和神经刺激导线。记录插头的作用是将低电压的肌电图信号与来自刺激针的高电压刺激伪影隔离开。出于同样原因，皮肤接口每行中的两个孔位保持空置，以分隔记录针与刺激针。
<ol>
	<li>制作肌电记录插头时，使用一个公头条形连接器（长度和宽度与母头相同，但高度为母头的一半）。将其切成两段，每段仅包含两个孔。采用与制作皮肤接收器中双排连接器相同的方法（步骤5.1），使用酚醛胶将两段固定在一起。取电缆中的四根肌电记录导线，将其末端的公头针插入四个孔中，直至锁定到位，针尖从条形边缘突出。</li>
	<li>使用骨水泥密封插头顶部，以绝缘导线与针脚的连接处。</li>
	<li>将电缆中剩余的八根以公头针结尾的导线分别与神经刺激套管上的母头针进行单独连接。</li>
</ol>
7. 第一次植入手术
<ol>
	<li>从有资质的养殖场获取一只年龄为1–2岁、体重20–25 kg的雌性或雄性犬。在无菌植入手术前对动物进行适应性饲养。手术前对所有器械进行高压灭菌。手术前禁食10–12小时。</li>
	<li>为动物进行术前准备。
	<ol>
		<li>剃除动物头部和颈部的毛发，并用酒精和聚维酮碘擦洗液清洁皮肤。通过静脉注射2–4&#8201;mg/kg的替来他明与唑拉西泮混合物进行麻醉，随后通过气管插管给予3%异氟烷与氧气混合气体维持麻醉。</li>
		<li>将动物仰卧位置于手术台上，使用加热垫，并对手术区域进行无菌铺巾。在整个手术过程中，至少每15分钟监测一次动物的心率、呼吸频率、体温和血氧饱和度，以确保在适度麻醉深度下维持生理稳定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从甲状软骨切迹至胸骨柄做正中颈部切口。游离气管与食管，暴露环状软骨下缘。</li>
	<li>将刺激套管分别放置于双侧喉上神经（SLN）和喉返神经（RLN）上。使用配套缝线闭合每个套管的开口。</li>
	<li>在两侧甲状软骨前表面使用直径为4 mm的活检打孔器制作软骨窗。暴露两侧甲杓肌-喉外侧肌复合体（TA-LCA）的外侧部分。使用23 G针头将肌电图（EMG）记录电极插入TA-LCA肌复合体内，将倒钩置于针尖内插入。将电极的聚酯补片缝合固定于软骨上。</li>
	<li>将深部脑刺激（DBS）电极及其配套的钩丝EMG记录电极置于双侧后环杓肌（PCA）下方。使用内窥镜确认每个通道的刺激均可引起声带外展。使用4-0不可吸收缝线将DBS电极锚定于环状软骨上。</li>
	<li>将所有神经刺激-EMG记录电极的导线引线通过其母端插针插入接口插座中。使用由止血钳改装而成的插入工具将插针压入孔内。使用骨水泥密封接口插座的下表面，以绝缘引线与插针的连接处。
	<ol>
		<li>待骨水泥硬化后，将接口插座经皮肤置于正中切口的头端，并通过其聚酯裙边将其缝合固定于皮下组织。通过面板上的孔缝合皮肤边缘至接口插座。 
		注意：止血钳的一个钳臂末端带有狭缝，通向一个沉孔。可将导线经狭缝置入沉孔中，并使沉孔贴合插针头部；另一个钳臂置于接口插座的对侧。挤压止血钳即可将插针压入对应的插座孔中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在左侧颈部做切口，暴露斜方肌。进行钝性分离，制作一个肌下口袋用于植入脉冲发生器（IPG）。将每根DBS导线经皮下隧道引至颈部切口，以便插入IPG中。</li>
	<li>使用缝线关闭所有手术切口。密切监测动物，直至其完全从手术中恢复。</li>
	<li>术后常规给予镇痛药物（例如：丁丙诺啡：0.01–0.02 mg/kg），持续最多48小时。口服抗生素（例如：头孢泊肟：10 mg/kg）至少3天。此后在整个研究期间单独饲养动物，并限制活动10天，以促进伤口正常愈合及植入设备的稳定。 
	注意：皮肤接口插座应每日使用组织相容性消毒液清洁。此外，除进行EMG记录时外，应常规将假的公插针插入皮肤接口插座的母插针中。此操作可防止异物在插座内积聚，确保与外部电缆的有效连接，并预防感染。</li>
</ol>
8. 基线神经刺激-肌电图记录会话
注意：在植入手术（第7节）之后、神经横断手术（第9节）之前，进行2至3次此类操作，以获取双侧喉返神经（RLN）完整时的基线肌电图（EMG）信号。在标准的神经刺激-肌电图记录会话期间（第8节和第10节），应用以下方案。
<ol>
	<li>在手术前 10–12 小时禁食。使用替来他明与唑拉西泮混合制剂对动物进行麻醉（初始静脉注射负荷剂量为 2–4&#8201;mg/kg，随后通过静脉通路以 0.4&#8201;mg/kg 每小时的速率维持麻醉）。将动物仰卧位置于加热垫上，并维持在适度的麻醉水平。在操作过程中按照步骤 7.2 所述监测动物的生命体征。</li>
	<li>通过喉镜插入带有连接的 CCD 视频摄像头的零度硬性内窥镜，以观察声门水平的声带运动。</li>
	<li>通过插头和针脚将连接至实验室刺激器和肌电图前置放大器的外部电缆与皮肤接口连接。将前置放大器的输出端连接至数据采集设备和/或示波器，以显示、记录和测量肌电图信号。</li>
	<li>分别对左侧和右侧喉返神经施加刺激（单个方波脉冲，持续时间 0.1–0.5 ms，幅度 0.5–2.0 mA），在每种条件下记录双侧甲杓肌-环杓侧肌复合体和环杓后肌的诱发肌电图反应。</li>
	<li>分别对左侧和右侧喉上神经施加刺激（单个方波脉冲，持续时间 0.1–0.5 ms，幅度 0.5–2.0 mA），在每种条件下记录双侧甲杓肌-环杓侧肌复合体和环杓后肌的诱发肌电图反应。</li>
	<li>通过动物口腔输送与室内空气混合的 CO2，以诱导高碳酸血症并增加动物的呼吸努力。暴露时间限制在 1 分钟内，在此期间吸气期运动单位募集将达到最大。在此高碳酸血症条件下记录甲杓肌-环杓侧肌复合体和环杓后肌的自发肌电活动。</li>
	<li>持续监测动物直至其完全从麻醉中恢复，并将动物送回饲养设施。</li>
</ol>
9. 神经横断与吻合的第二次手术
<ol>
	<li>在第一次手术后10–14天进行第二次手术。术前10–12小时禁食。</li>
	<li>对动物实施麻醉，采用第7.2步所述技术进行术中铺巾及生命体征监测。</li>
	<li>拆除缝线，尽可能通过钝性分离重新打开正中切口。分离过程中应避免损伤先前植入的装置。通过解剖暴露双侧喉返神经，分别予以游离、切断，并使用7-0单丝不可吸收缝线进行吻合，以诱导双侧喉麻痹。</li>
	<li>用无菌生理盐水和庆大霉素抗生素冲洗颈部切口。使用3-0可吸收缝线缝合肌肉层和皮下组织，皮肤则用3-0单丝不可吸收缝线缝合。</li>
	<li>密切监测动物，直至其从手术中完全恢复。</li>
	<li>术后常规给予镇痛药物（例如：丁丙诺啡：0.01–0.02 mg/kg），持续最多48小时。口服抗生素（例如：头孢泊肟：10 mg/kg）至少3天。限制动物活动10天，以促进伤口正常愈合。</li>
</ol>
10. 双侧喉返神经损伤后神经刺激-肌电图记录实验
<ol>
	<li>在前3个月期间每周进行一次这些操作，之后改为每两周一次。这些操作请遵循第8节中描述的方案。</li>
</ol>

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</ol>

David Zealear 博士正在将这种可植入的神经刺激-肌电图技术推广应用于多种神经肌肉系统及动物模型。

本文描述了制造一种新型、经济且可植入的系统的步骤，该系统可用于长期刺激喉部神经并记录喉部肌肉的肌电图（EMG）反应。该方案操作简便，可制备出足够紧凑的植入装置，适用于小至大鼠的动物。其中有若干关键步骤需特别强调。首先，引线应仔细且均匀地盘绕，以防止引线绝缘层破损、扭曲或断裂。若无现成的盘绕设备，可从商业渠道购买预制的盘绕引线。其次，将引线插入硅胶管内并形成跨越神经的“V”形结构，这一策略对于促进电流通过套管内的神经至关重要。若两条引线置于管子的同一侧，则可能发生电极间的电流分流。此外，引线应紧贴管壁放置，以避免对神经造成切割性损伤。
第三，在植入手术过程中，应仔细分离喉部神经，以防止损伤。在植入后期，当将插针插入插座时，应沿插针孔的方向施力，以避免插针头部突然弯曲。随后，应在插座底部充分涂抹骨水泥，以实现完全绝缘并防止通道间的串扰。最后，预防感染对于确保植入系统长期完整性至关重要。可通过多种措施相结合来实现：在插座上添加裙边结构、使用抗生素、每天用组织相容性消毒液清洁伤口和插座，以及在插座的雌性插孔中插入假的雄性插针，以保持插孔在各次使用间隔期间清洁无碎屑。
该方案在此犬喉模型中已被证实是成功的。然而，对于其他应用，可能需要考虑一些修改或替代策略。例如，PCA和TA-LCA EMG电极的去绝缘感应尖端通过外部方式（如聚酯移植物或DBS电极）固定于肌肉中。在无需或不进行外部固定的场景中，电极自带的倒刺即可作为固定结构。在此情况下，考虑到更高的抗拉强度，从而在组织中提供更稳定的倒刺，使用聚四氟乙烯涂层的不锈钢单丝导线可能优于多丝导线。但需注意，多丝导线可能更不易断裂。另一种替代皮肤接口制作与组装的方法是采用生物相容性聚合物进行3D打印（例如Stratasys公司的MED610材料），这可能会简化制造过程。
在动物完成植入手术并恢复后，需在喉返神经（RLN）保持完整的条件下进行生理学实验，以获取基线数据。在实验过程中，刺激喉返神经后可能未记录到喉肌的肌电图（EMG）信号。为了排查原因（表1），首先应确定声带是否存在运动。若声带运动存在，则说明神经已被套管电极有效激活，问题可能出在EMG记录电极上。此时，操作者应进一步观察EMG刺激伪迹。若EMG伪迹缺失，则可能是EMG信号输入至前置放大器的通路中存在断路，此时通常还会出现明显的大振幅60 Hz噪声。若伪迹幅度较大，则可能是刺激引脚信号分流至记录引脚，导致通道前置放大器饱和，从而掩盖了EMG反应。若伪迹正常，则可能是EMG记录电极从肌肉中脱位，无法检测肌肉活动。另一方面，若声带无运动，则说明神经未被激活。若此时刺激伪迹缺失，可能是刺激回路存在断路，导致神经无法被激活。若伪迹正常，则可能是植入手术过程中神经受损，或套管电极已从神经上移位。类似的方法也可用于排查在刺激喉上神经（SLN）时EMG信号缺失的原因。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>受刺激的神经</td>
			<td>目标肌肉</td>
			<td>同侧声带运动</td>
			<td>刺激伪迹</td>
			<td>可能原因</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">RLN</td>
			<td rowspan="5">PCA 和/或 TA-LCA</td>
			<td rowspan="3">有</td>
			<td>缺失（存在60周期噪声）</td>
			<td>肌电输入至前置放大器的通路中断（例如导线、插针、电缆）；</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>显著</td>
			<td>插座处刺激针与记录针之间的串扰</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>正常</td>
			<td>肌电电极移位</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">无</td>
			<td>缺失</td>
			<td>刺激电路中断</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>正常</td>
			<td>1. RLN 损伤；2. 套管移位</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">SLN</td>
			<td rowspan="5">TA-LCA</td>
			<td rowspan="3">有</td>
			<td>缺失（存在60周期噪声）</td>
			<td>肌电输入至前置放大器的通路中断（例如导线、插针、电缆）；</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>显著</td>
			<td>插座处刺激针与记录针之间的串扰</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>正常</td>
			<td>肌电电极移位</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">无</td>
			<td>缺失</td>
			<td>刺激电路中断</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>正常</td>
			<td>1. SLN 或 RLN 损伤；2. 套管移位</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：故障排除指南。
需要指出的是，该技术在当前应用中存在两个次要的局限性。首先，在将雌性插针插入插座的过程中，曾多次发生插针突然弯曲的情况。幸运的是，这些插针通常可以被矫正，并成功插入对应的孔中。如果插针损坏无法修复，则需要更换导联及其整个组件。因此，手术前应备有充足的备用组件。其次，完成手术植入所需的时间较长（约10小时）。这一较长的手术时间部分反映了本研究所需的刺激与记录组件数量较多：包括四根神经、四块肌肉、一个插座以及一个植入式脉冲发生器（IPG）。如果使用该技术时所需的组件减少，植入时间应可显著缩短（例如大鼠舌模型28）。
该技术方法相较于现有方法具有多项优势。导线的卷曲设计是本系统中最新颖且最重要的特征。尽管卷曲导线具有诸多优点，但在非商业性动物实验中却并不常见。在植入过程中，卷曲导线可拉伸至所需长度；此外，在清醒活动的动物体内，导线可随之伸展，从而防止电极尖端移位或导线断裂。这一特性确保了植入装置的长期稳定性，实现持久而稳定的神经刺激与肌肉记录。此外，在接口周围增加生物组织相容性裙边结构，可避免伤口暴露于这一异物，促进正常纤维化及无感染状态下的伤口愈合。既往未使用裙边的研究常出现早期感染，导致实验提前终止。最后，该植入系统结构紧凑且具备多通道功能，可在不同体型的动物模型中有效采集多个神经肌肉结构的数据。
该技术方法已被改进并成功应用于大鼠模型。本研究旨在探讨电刺激预处理在预防老年大鼠舌肌萎缩和功能障碍中的作用。将套管电极植入舌下神经用于刺激预处理，同时将肌电图记录电极植入舌肌中28。该技术还可应用于其他研究领域。作为当前犬喉部实验方案的延伸，目前正利用该技术在兔面部肌肉中研究电刺激预处理对促进选择性再神经支配的作用。该研究可能为贝尔麻痹患者预防面部联带运动提供理论基础，贝尔麻痹是一种常见且致残性的医学病症。该技术的另一潜在应用是实现对清醒、自由活动动物的刺激与记录。目前，已通过外部电缆在清醒、无束缚的大鼠中获取相关数据28。未来，这一经济型系统还可与远程记录-刺激技术（如遥测技术）结合，实现对神经肌肉系统的无线激活或探测。

肌电图（EMG）记录是一种用于测量骨骼肌在神经电刺激或运动单位自发放电时所产生的电活动的有效技术。监测EMG信号可用于评估神经肌肉传递功能及肌肉生物力学特性1。EMG记录在表征神经损伤后肌肉再支配的质量与程度方面也具有重要作用2,3,4,5。然而，传统的侵入性方法无法在整个再支配过程中实现多次EMG记录。因此，研究人员已设计并开发出可植入装置，用于在神经肌肉系统中进行重复、长期的刺激与记录6,7,8,9,10,11,12,13。本文旨在描述一种用于从喉部获取可靠时序EMG数据的稳定系统的制造与植入方案。
本系统在此应用于喉部肌肉再神经支配的研究。为便于理解，下文提供了喉部的简要概述（图1）。在呼吸、发声及气道保护过程中，感觉与运动成分之间必须实现精确协调，以确保肌肉运动正常。位于喉后部的环杓后肌（PCA）是唯一能使声带外展的肌肉。该肌肉在吸气时被自发激活，以增大声门面积，促进空气吸入。甲杓肌-环杓侧肌复合体（TA-LCA）是声带主要的内收肌。该肌群与另一内收肌（即杓间肌）共同激活，使声带内收，以实现声带振动和发声，并在吞咽过程中关闭声带，起到气道保护作用。
此外，运动神经纤维支配单侧喉返神经（RLN）中的外展肌和内收肌。可根据运动神经元单位的组成来区分外展肌与内收肌。14,15. 在高碳酸血症和/或低氧条件下，PCA 肌肉的放电活动增强16 由于存在吸气性运动神经元。相比之下，反射性声门关闭（RGC）运动神经元通过激活喉黏膜内的感觉感受器引起声门的反射性关闭，存在于甲杓侧肌-环杓后肌复合体（TA-LCA）中。喉上神经（SLN）的内支传导喉部感觉感受器的传入纤维。17尽管发声主要是一种内收功能，但在这种高度进化的喉部行为中，外展和内收运动单位均参与其中。
<img alt="喉部神经刺激示意图，显示在喉上神经、喉返神经及环甲后肌上放置电极，用于发声研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60345/60345fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：喉部解剖结构。图中还展示了该可植入系统的各个组成部分。SLN = 喉上神经；RLN = 喉返神经；PCA = 环甲后肌；TA-LCA = 甲杓肌–环杓外侧肌复合体；DBS = 深部脑刺激。本图已获 Wiley27 许可转载。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60345/60345fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
喉返神经（RLN）损伤可导致声带麻痹（VFP），由于喉部肌肉失神经支配，声带的外展和内收功能均受到影响14,18,19。随后，RLN神经纤维通常会再生并重新支配肌肉。然而，再神经支配是一个随机过程，在大多数情况下会导致错误的、不适当的肌肉重新连接。这种情况被称为联带运动（synkinesis），表现为外展肌和内收肌拮抗对的自发性激活异常，从而引起声带无效甚至矛盾性运动14,19,20,21。在联带运动发生时，声带外展这一关键功能丧失，导致通气不足。尽管目前已有尝试通过以下两种方式治疗喉部联带运动：1）使用肉毒杆菌毒素（Botox）阻断声门闭合22,23，或 2）通过植入式起搏器电刺激声门开放24,25，但尚无任何临床干预手段能够可靠地预防联带运动的发生26。然而，有证据表明，在再神经支配过程中以低频对后环杓侧肌（PCA）进行电刺激，可促进神经肌肉连接的正确重建，并最大限度减少联带运动的发生。目前相关研究正在开展，以阐明其潜在机制2。
本文旨在介绍一种简单且低成本的可植入系统，用于慢性神经刺激和肌电图（EMG）记录。该系统可用于研究对环甲肌（PCA）进行低频电刺激预处理对其后续再神经支配特异性的影响。通过该系统获取的肌电图信号能够反映喉肌再神经支配在时间进程中的质量和数量变化。

<table><tbody><tr><td>20 G × 1&quot; 规格皮下注射针头</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>23 G × 1&quot; 规格皮下注射针头</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>25 G × 1&quot; 规格皮下注射针头</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>3-0 可吸收缝线，COATED VICRYL</td><td>Ethicon</td><td>J219H</td><td></td></tr><tr><td>3-0 单丝不可吸收缝线，Prolene</td><td>Ethicon</td><td>8684G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 单丝不可吸收缝线，Prolene</td><td>Ethicon</td><td>8871H</td><td></td></tr><tr><td>6-0 单丝不可吸收锥形针缝线，Prolene</td><td>Ethicon</td><td>8805</td><td></td></tr><tr><td>7-0 单丝不可吸收缝线，Prolene</td><td>Ethicon</td><td>M8735</td><td></td></tr><tr><td>医用级硅胶粘合剂溶剂—六甲基二硅氧烷 98%</td><td>ACROS</td><td>编号 194790100</td><td>用于稀释医用硅胶粘合剂</td></tr><tr><td>骨水泥</td><td>Zimmer</td><td>1102-16</td><td>20 g 粉剂，10 mL 液体</td></tr><tr><td>丁丙诺啡（Buprenex，1 mL 安瓿）</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd</td><td>12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>连接内窥镜的 CCD 视频摄像机</td><td>Sony</td><td>MCC500MD</td><td></td></tr><tr><td>头孢泊肟（Simplicef 100 mg 片剂）</td><td>Zoetis</td><td>5228</td><td></td></tr><tr><td>数据采集设备，PowerLab 16/35</td><td>ADInstruments, Inc</td><td>5761-E</td><td></td></tr><tr><td>脑深部刺激（DBS）电极</td><td>Abbott</td><td>6172ANS</td><td></td></tr><tr><td>数字示波器</td><td>Tektronix</td><td>DPO71304SX</td><td></td></tr><tr><td>植入式脉冲发生器（IPG），Infinity</td><td>Abbott</td><td>6660ANS</td><td></td></tr><tr><td>针织聚酯移植物</td><td>Meadox Medical Inc</td><td>92220</td><td>直径 20 mm</td></tr><tr><td>医用级聚乙烯微管</td><td>Amazon.com</td><td>BB31695-PE/13-10</td><td>外径 0.156&quot;，内径 0.094&quot;</td></tr><tr><td>金属雌性插针</td><td>Allied Electronics &amp; Automation</td><td>220-S02-100</td><td></td></tr><tr><td>金属雄性插针</td><td>CDM electronics</td><td>220-p02-1</td><td></td></tr><tr><td>预制盘绕导线</td><td>Medical innovations Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅胶实验室管路</td><td>Cole-Parmer</td><td>2415569</td><td>外径 0.125&quot;，内径 0.062&quot;</td></tr><tr><td>医用硅胶粘合剂，Silastic</td><td>Dow corning</td><td>型号 A，2 盎司</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢单丝导线</td><td>The Harris Products Group</td><td>型号 316</td><td>0.008&quot;（带涂层），0.005&quot;（裸线）</td></tr><tr><td>无菌一次性活检穿孔器（4 mm）</td><td>Sklar Instruments</td><td>96-1146</td><td></td></tr><tr><td>条形连接器</td><td>CDM electronics</td><td>2.6 × 11.6 × 101.5 mm</td><td>单排，圆形，通孔</td></tr><tr><td>特氟龙涂层多丝不锈钢导线</td><td>Medwire</td><td>部件号 316，ss7/44T</td><td></td></tr><tr><td>替来他明与唑拉西泮混合制剂，Telazol - 5 mL</td><td>Zoetis</td><td>004866</td><td></td></tr><tr><td>组织相容性消毒液，Nolvasan - 1 加仑</td><td>Zoetis</td><td>540561</td><td></td></tr><tr><td>零度硬质内窥镜</td><td>Karl Storz</td><td>8712AA</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于慢性活体肌电图记录的可植入系统

An Implantable System For Chronic In Vivo Electromyography

肌电图（EMG）用于测量肌肉对电刺激的反应或运动单位的自发活动，在评估神经肌肉功能中具有重要作用。由于传统肌电图记录技术具有侵入性，长期以来对反映神经损伤后肌肉再神经支配状态的肌电活动进行慢性记录受到限制。为此，设计了一种植入式系统，用于长期、在体的肌电图记录和神经刺激。该系统已在喉部肌肉再神经支配的研究中得到应用和测试。该系统包括：1）两个双极电极神经套管及导线，用于刺激两条神经：喉返神经（RLN）和喉上神经内支（SLN）；2）两个肌电记录电极及导线，分别对应两条喉部肌肉：环杓后肌（PCA）和甲杓肌-环甲侧肌（TA-LCA）复合体；3）一个皮肤接口，通过连接电缆将所有植入的导线终端与外部记录前置放大器和刺激器相连接。导线采用聚四氟乙烯涂层、多丝结构的316型不锈钢材料，呈螺旋状缠绕，可在清醒动物活动时伸展，以防止导线断裂和电极移位。该系统通过无菌手术植入。随后，在第二次手术切断喉返神经以研究肌肉再神经支配之前，先进行基线肌电图记录。在整个研究过程中，于麻醉动物中多次开展生理学记录，获取反映喉部肌肉再神经支配状态的诱发性和自发性肌电活动。该系统结构紧凑，在研究期间无感染发生，且具有高度耐用性。这种可植入系统可为需要在麻醉或自由活动动物中进行长期记录或神经刺激的研究提供可靠的平台。&#160;

各组件的示例如图2所示。图2A从左至右分别为神经刺激套管、TA-LCA记录电极、PCA记录电极和皮肤接口插座。可由此了解这些组件的相对尺寸。皮肤插座（图2B）具有两排孔，用于插入每根盘绕导线末端的雌性插针（图2D）。在植入手术过程中，这些插针需与面板相对插入（箭头所示）。插座的连接器侧壁附有一圈聚酯裙边（图2C），该裙边可通过结缔组织长入实现固定，从而将插座锚定在原位。每根特氟龙包被的不锈钢EMG导线（图2E）在尖端去绝缘层5 mm，形成钩状电极，用于肌肉信号记录。刺激套管内壁上穿有两枚电极，二者相距2 mm（图2F），并呈“V”形排列（图2G），以确保电流能够穿过神经。 
<img alt="带比例尺的医疗器械原型、导管组件、植入物示意图、组装细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60345/60345fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：植入系统的组件。（A）从左到右依次为神经刺激套管、TA-LCA记录电极、PCA记录电极和皮肤接口接收器。（B）显示两排孔的皮肤接收器。（C）接收器显示其连接器侧壁上附有一圈聚酯裙边。（D）包含雌性插针的卷曲导线，用于插入B图中的孔内。（E）聚四氟乙烯包被的不锈钢EMG导联在尖端去绝缘层（5 mm），形成钩状电极用于肌肉记录。（F）刺激套管有两个电极沿套管内壁穿入，两者相距2 mm。（G）电极呈“V”形排列，以确保电流穿过神经。本图经许可修改自文献27。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60345/60345fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
图3展示了植入的皮肤接口以及外部设备的电缆如何与接口连接。需要注意的是，在记录间隔期间，应将假的公针（未显示）插入接口的母针中，以防止异物进入。
<img alt="动物神经接口植入物；神经科学实验装置；电极连接。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60345/60345fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3： 皮下插座与接口电缆。（A）显示的是植入于前颈部、无假阳插针的皮下插座。（B）图像展示了在神经刺激-肌电图记录实验过程中，来自外部设备的电缆上的刺激针和肌电记录插头（箭头）如何与插座连接。本图经许可修改自文献27。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60345/60345fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
图4 显示了一次基线期喉返神经完整时的肌电图记录。
<img alt="电生理信号图；电压随时间变化；神经元研究中的动作电位；数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60345/60345fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：来自正常神经支配喉部肌肉的肌电图记录。（A）来自环甲后肌（PCA）的示例记录，其中喉返神经（RLN）刺激产生刺激伪迹（箭头），随后出现一个较大的诱发性肌电位。（B）甲杓肌-环甲侧肌（TA-LCA）复合体的示例记录，其中喉上神经（SLN）刺激产生刺激伪迹（箭头）。图中显示的是（a）短潜伏期的单突触肌肉反应和（b）长潜伏期的多突触喉内反应（RGC）。（C）在正常吸气过程中从PCA肌肉记录到的自发性肌电活动爆发（箭头）。（D）在给予CO2过程中吸气期肌电活动的增强。本图经许可修改自文献27。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60345/60345fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在来自环甲后肌（PCA）的记录中（图4A），喉返神经（RLN）刺激会产生一个刺激伪迹（箭头），随后出现一个较大的诱发电位（EMG）。最大RLN诱发电反应可作为正常神经支配总体程度的良好指标，也可用于评估后续神经吻合术后再神经支配的水平，且不受运动单位类型的影响。其原因是RLN包含支配吸气性和反射性声门闭合（RGC）运动单位的神经纤维，RLN刺激可同时募集这两类运动单位。诱发电位的运动单位活动经整流并在20 ms时间窗内积分，以获得对肌肉神经支配程度的定量评估。
在来自TA-LCA肌群的记录中（图4B），SLN刺激产生刺激伪迹（箭头）。该伪迹之后出现一个短潜伏期的单突触肌肉反应（a）和一个长潜伏期的多突触RGC反应（b）。电位（a）源自环甲肌的直接反应，因为该肌肉由SLN邻近的外支所支配。在使用神经套管刺激SLN内支以激活RGC反应时，常会意外激活该外支。TA-LCA电极可记录到环甲肌电位，因为该肌肉位于TA-LCA复合体附近。既往研究表明，通过切断SLN的外支可选择性消除由内支刺激诱发的环甲肌电位（Zealear，未发表观察结果）。SLN诱发的最大肌电图反应反映了通过RGC感觉-运动通路对TA-LCA复合体的自然神经支配程度。在RLN神经吻合术之前，PCA肌肉无RGC神经支配，因此不应从此肌肉检测到SLN电位。在神经切断并修复后，SLN诱发的电位反映了TA-LCA复合体获得正确RGC再支配的程度以及PCA肌肉发生错误RGC再支配的程度。RGC活动通过整流并在20 ms时间窗内进行积分来量化，以完整捕获整个RGC波形。
在（图4C）中，于正常吸气过程中记录到来自环甲后肌（PCA肌）的自发性肌电活动爆发（箭头所示）。随着CO2的递送，该吸气性肌电活动逐渐增强，如（图4D）中较慢扫描速度下的记录所示。自发性PCA肌肌电活动可良好反映该肌肉原有吸气运动神经元对其正常支配的程度。声带外展肌复合体（TA-LCA复合体）无吸气性神经支配，因此不应从此类肌肉中检测到吸气性电位。这是因为，在麻醉动物中，仅吸气性运动单位参与最大吸气努力时声带的外展动作。在神经离断并修复后，自发性吸气电位反映了PCA肌正确再支配的程度以及TA-LCA复合体错误再支配的程度。吸气性肌电活动的记录信号经过放大、整流，并在8秒时间范围内进行积分处理。

本文介绍了一种用于体内连续记录诱发性和自发性肌电位的可植入系统的制造方案。该系统应用于喉部肌肉在神经损伤后重新神经支配过程的研究。

肌电图（EMG）用于测量肌肉对电刺激的反应或运动单位的自发活动，在……中具有重要作用。

该系统可用于制造一种简单、经济且可植入的装置，用于长期记录诱发电位或自发性肌电图信号。与传统的慢性肌电图记录系统相比，该系统的主要优势在于其导线呈螺旋状，能够抵抗在清醒活动动物中导线断裂或连接中断的问题。该技术的主要应用是研究在电刺激疗法存在的情况下喉肌再支配的特异性，以避免联带运动的发生。该技术还可应用于其他需要在清醒活动动物中进行慢性神经刺激和/或肌电图记录的神经肌肉系统。本操作步骤将由我实验室耳鼻喉科研究助理教授 Shan Huang 介绍。在制备喉返神经刺激电极套管之前，为每个套管剪取 170 厘米长的特氟龙涂层多丝 316 不锈钢导线，并使用绕线装置将导线绕成 12 厘米长的弹簧状。如有必要，拉伸弹簧以增加每个植入位点的长度。将每个盘绕导联的一端预留3毫米，另一端预留10毫米，保持直线状态，并剥离两端的绝缘层。然后将一个镀金铜制母针焊接至每个盘绕导联的3毫米端。 制备神经套管时，从硅胶管卷中截取一段五毫米长的硅胶管。在手术显微镜下，使用25号皮下注射针头，在距离管端1.5毫米且靠近内壁的偏心位置刺穿管壁。将一根导线裸露的10毫米端插入针头尖端，然后回撤针头，使去绝缘部分留在管内。将管外的裸露导线末端弯折，并在导线进入管内的入口处将其缠绕固定在引线上，以将引线锚定在管上。为在管子另一端相反方向1.5毫米处插入第二根引线，需使第二引线的进入点与第一引线对齐。使用针头刺穿管壁，并将其针杆沿内壁滑动至第一引线的对侧位置。用去绝缘层的10毫米端反向填充针头，然后取出针头。两个刺激电极应呈45度V形，跨接在神经两侧，以确保电流从阳极到阴极穿过神经。使用一对弯头剪刀，在电极插入位置相对的导管壁上剪出一个S形切口，并使用弯头显微外科针头，在套管壁的每一端各插入一段6-0单丝不可吸收缝线。在离心管中将一滴医用级A型硅胶与其溶剂混合，并在涡旋振荡器上混匀。使用30单位胰岛素注射器将胶体预混液涂覆于套管外部所有裸露导线处，以重新进行绝缘。为制备浅表淋巴结（SLN）刺激电极套管，请按照上述方法，采用直径更小的套管组装电极套管。为制备环甲膜肌（PCA）肌电图记录电极，首先组装环甲膜肌电极的盘绕导线，并如图所示将一个母针焊接到导线的3毫米端。使用25号针头将导线的10毫米端插入深部脑刺激电极的尖端，然后弯曲导线末端形成钩状。随后剪切导线，使其总记录长度为5毫米。为了制备用于连接电极与外部设备的皮肤接口装置，从单排针座连接器上截取两段各长17.5毫米的部分，每段包含八个穿孔，并使用砂纸打磨每段的外表面。在通风橱中用苯酚将打磨过的两段粘合在一起，并将形成的双排连接器置于通风橱内的60–80摄氏度水中浸泡30分钟。在胶水固化的同时，从连接器条上截取一段25.6毫米的面板。在面板中央钻一个孔。使用台钻和手术刀将孔扩大，加工成一个位于面板中央、尺寸为5.4 × 17.4 毫米的矩形孔。用锉刀修整并使孔的角部成直角。胶水干燥后，将双排连接器带有较大直径孔的一端插入前面板的矩形孔内，直至与前面板表面齐平。使用酚醛树脂将连接器粘接到前面板上，并将组件置于60–90°C的水中。待酚醛树脂硬化后，在前面板的每个角以及两端中点的两侧各钻一个1.3毫米的孔。截取一段长度为15毫米的针织聚酯移植物管，使用皮下注射针头在移植物管壁上沿长度方向每隔3.8毫米的位置穿入不锈钢丝，共穿三处，以将管子固定到组件上。在连接器的每个角落切出等距的凹口，用于将金属丝固定在组件表面，并使用钳子拧紧每根金属丝的末端，使管子紧固在组件上。然后在接收器一端的聚酯补片上做一个永久性标记。从环状软骨下缘至胸骨柄做一正中颈部切口。在麻醉的犬类中暴露环状软骨下缘后，将刺激套管分别置于双侧喉上神经（SLN）和喉返神经（RLN）上，并使用附带的缝线闭合每个套管的开口。使用活检打孔器在甲状软骨前表面两侧各制作一个4毫米的软骨窗，暴露双侧甲杓肌-环杓侧肌复合体的外侧部分。使用23号针头将每个肌电图记录电极的针头插入TA-LCA复合体，并将聚酯补片在四个角处缝合固定于环状软骨上。将深部脑刺激电极及其配套的钩丝肌电图记录电极置于两侧PCA肌肉下方，并使用内窥镜确认每条通道的刺激均可引起声带外展。使用4-0不可吸收缝线，通过固定在导线上的锚钉将深部脑刺激电极锚定于环状软骨上。使用止血钳改制的插入工具，通过记录电极的母针将神经刺激EMG记录电极的所有导线插入插座中。使用骨水泥密封插座的下表面，以绝缘导线针连接处。待水泥硬化后，将插座置于中线切口的头端，并通过聚酯裙边将插座缝合固定于皮下组织。然后将缝线穿过面罩孔，以将皮肤边缘固定到接收器上。此处显示的是喉返神经完整时某次基线期会话的代表性肌电图记录。在后环杓侧肌的记录中，刺激喉返神经会产生刺激伪迹，随后出现较大的诱发电位。在来自甲杓肌-侧环杓后肌复合体的记录中，刺激喉上神经（SLN）会产生刺激伪迹，随后出现短潜伏期的单突触肌肉反应以及长潜伏期的多突触反射性声门闭合反应。在此记录中，可在正常吸气过程中从环杓后肌（PCA）记录到自发性肌电活动的爆发。随着二氧化碳输送的进行，在较慢的扫描速度下，这种吸气相肌电活动逐渐增强。喉肌-杓状肌复合体无吸气性神经支配，因此不应从这些肌肉中检测到吸气相电位。该技术已被用于研究电刺激预处理对兔面部肌肉再神经支配特异性的影响，以及衰老大鼠舌肌萎缩的情况。

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