Name: 从一个成年小鼠脑半球分离区域特异性微胶质，进行深度单细胞RNA测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学习从成年小鼠脑半球分离皮层、海马、纹状体和小脑区域特异性小胶质细胞的方法，结合FACS分选与深度单细胞RNA测序技术，揭示健康和疾病状态下小胶质细胞的分子异质性。

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我们感谢 Mariko L. Bennett、Liana Nicole Bonanno 和 Spyros Darmanis 在本实验方案开发过程中提供的帮助。同时感谢斯坦福共享流式分选设施（Stanford Shared FACS Facility）的 Meredith Weglarz 和 Lisa Nichols，以及斯坦福蛋白质与核酸设施（PAN）的 Yen Tran 和 Michael Eckart 在拍摄过程中给予的大力支持。本工作由 JPB 基金会和 Vincent J. Coates 基金会资助。

所有涉及啮齿类动物的实验程序均符合斯坦福大学指南，该指南遵循国家和州的法律法规及政策。所有动物实验程序均经斯坦福大学实验动物护理与使用委员会批准。
注意：所有溶液和缓冲液的组成均在材料表中提供。
1. 细胞分离当天的准备工作
<ol>
	<li>准备以下试剂并置于冰上预冷：培养基 A（50 mL）、磁珠激活细胞分选（MCS）缓冲液（30 mL）、流式细胞分选（FACS）缓冲液（25 mL）、磷酸盐缓冲液（PBS；30 mL）、DNase（320 µL）和RNase抑制剂（30 µL）。 
	注意：此处提供的体积足以从单只小鼠半脑的4个脑区（例如皮层、小脑、海马和纹状体）中分离小胶质细胞。若使用更多组织，请相应扩大体积。</li>
	<li>将四个洁净的2 mL Dounce匀浆器置于冰上，每个匀浆器中加入含80 µL DNase（12,500 单位/mL）和5 µL RNase抑制剂的2 mL 培养基 A。将研杵放入15 mL离心管中并在冰上预冷。</li>
	<li>标记四个6 cm培养皿，注明用于组织收集的脑区，并在每个培养皿中加入200 µL预冷的培养基 A，置于冰上。另取一个6 cm培养皿加入约5 mL 培养基 A用于解剖。 
	注意：使用前确保所有试剂均为无菌且适用于RNA相关实验。实验台面和解剖工具需保持洁净，并用RNase去污染溶液喷洒处理（材料表）。</li>
</ol>
2. 脑区解剖
注意：此步骤应耗时约 30 分钟。
<ol>
	<li>向一只幼年至成年阶段的小鼠（&#62;1个月大）腹腔内注射400−500 µL的氯胺酮/甲苯噻嗪混合液（氯胺酮24 mg/mL，甲苯噻嗪2.4 mg/mL）。 
	注： 本示例使用雄性小鼠，但雌雄均可适用。</li>
	<li>等待5分钟后，轻捏后肢足部以确认无回缩反应。</li>
	<li>立即使用26 G × 3/8针头进行经心灌注，灌注液为20−30 mL冰冻PBS，直至流出液中无可见血液。</li>
	<li>使用手术剪将小鼠断头。用小剪刀剪开皮肤以暴露颅骨，随后剪开矢状缝、人字缝和冠状缝。用镊子小心剥离两侧顶骨和枕骨，避免损伤组织，然后将脑组织小心转移至含有A型培养基的解剖培养皿中。</li>
	<li>使用预冷刀片沿中线将脑组织切成两个半球。 
	注： 从单侧半球中分离出的本步骤所述四个脑区，可获得足够数量的小胶质细胞，用于单细胞或批量RNA测序分析。另一侧半球可用于免疫组织化学或RNA原位杂交验证。</li>
	<li>使用#55号镊子将小脑从大脑皮层和脑干分离，并将组织转移至收集用培养皿中。</li>
	<li>使用#55号镊子小心地从皮层中分离出海马和纹状体，并分别将各组织转移至收集用培养皿中。</li>
</ol>
3. 机械组织解离
注意：除染色步骤外，细胞和试剂应始终置于低温环境中。此步骤大约需要 30 分钟。
<ol>
	<li>用剃刀将每份脑组织切成小于&#60;1 mm3 的细小组织块。</li>
	<li>使用剪去枪头的1 mL移液器将组织块转移至预冷的Dounce匀浆器中，每个匀浆器内含2 mL含有DNase和RNase抑制剂的A液。</li>
	<li>通过缓慢地将杵子在Dounce匀浆器内推入和拉出，进行6−10次完整研磨，直至无可见组织块残留。 
	注意：Dounce匀浆可杀死神经元及大多数其他胶质细胞，但可使小胶质细胞保持相对完整。研磨不足或过度均可能导致细胞得率降低。</li>
	<li>将解离后的组织通过70 µm细胞筛滤器转移至50 mL离心管中。</li>
	<li>用总共6 mL冷A液冲洗每个Dounce匀浆器及杵子，并将冲洗液通过同一滤器滤入相应的离心管中。</li>
	<li>将单细胞悬液（每份约8 mL）转移至15 mL锥形离心管中，在4 °C条件下以400 × g 离心5分钟，刹车设为5。</li>
</ol>
4. 髓鞘去除
注意： 此步骤应耗时约 60 分钟。
<ol>
	<li>在磁力架中准备1个大型去除非细胞（LD）柱（用于皮层）和3个大型富集（LS）柱（用于其余3个脑区）（材料表）。每根柱用3 mL MCS缓冲液冲洗。</li>
	<li>离心结束后，用移液器小心吸出并弃去上清液，避免扰动沉淀。对于皮层和小脑组织，将细胞重悬于850 µL MCS缓冲液中，并加入1.8 µL RNase抑制剂；对于海马和纹状体组织，将细胞重悬于400 µL MCS缓冲液中，并加入0.9 µL RNase抑制剂。 
	注意： 所用柱类型（LD与LS）及重悬体积根据组织中髓鞘含量进行了优化。若检测其他脑区，可能需要根据组织大小及髓鞘含量调整条件。髓鞘去除效果可在步骤4.9中评估。</li>
	<li>向皮层和小脑来源的细胞中各加入100 µL髓鞘去除磁珠，向海马和纹状体来源的细胞中各加入50 µL髓鞘去除磁珠。</li>
	<li>轻柔混匀细胞与磁珠，将离心管置于冰上孵育10分钟。</li>
	<li>用MCS缓冲液将皮层细胞悬液体积补至2 mL，其余样本补至1 mL（即：向皮层细胞中加入1 mL缓冲液；向海马和纹状体细胞中各加入500 µL缓冲液；小脑细胞无需添加缓冲液）。</li>
	<li>当柱内冲洗缓冲液完全流尽后，在每根柱下方放置一个15 mL离心管。将皮层细胞（2 mL）上样至LD柱，其余样本（各1 mL）上样至LS柱。立即用1 mL MCS缓冲液分别冲洗原离心管，并将洗涤液加载至相应柱中。</li>
	<li>用1 mL MCS缓冲液洗涤LD柱一次，每个LS柱用1 mL MCS缓冲液各洗涤两次。洗涤过程中持续收集穿流液。</li>
	<li>通过35 µm滤网帽将细胞过滤至圆底FACS管中。 
	注意： 每管应收集约4 mL去除了髓鞘的单细胞悬液。</li>
	<li>可选：取10 µL细胞悬液与10 µL 0.4%台盼蓝溶液混合。在10倍明场显微镜下观察，以评估细胞得率、存活率及残留髓鞘水平。 
	注意： 成功的制备应获得超过90%的活细胞（形态呈圆形且排斥蓝色染料），髓鞘碎片极少或无。</li>
	<li>在4 °C条件下，以400 × g 离心5分钟（刹车设为5）使FACS管中的细胞沉淀。缓慢倾倒弃去上清液，并将管口边缘轻触纸巾吸除残留液体。每管细胞用300 µL FACS缓冲液重悬。 
	注意： 若倾向于使用MCS分选，可在去除髓鞘后使用CD11b磁珠富集小胶质细胞及其他髓系细胞。这些细胞可用于非板基的单细胞RNA测序（scRNA-seq）以及批量RNA测序（bulk RNA-seq）。该替代方案的局限性在于CD11b磁珠无法将小胶质细胞与其他对该抗原呈阳性的相关免疫细胞区分开来。</li>
</ol>
5. 荧光激活细胞分选染色
注意：此步骤应耗时约 40 分钟。
<ol>
	<li>向每支试管中加入 5 µL 小鼠 Fc 受体阻断试剂（材料表），冰上孵育 5 分钟。</li>
	<li>向每支试管中加入 1 µL CD45-PE-Cy7 和 1 µL CD11b-BV421。 
	注意：也可使用其他荧光素偶联的抗体。可同时加入针对 TMEM119 的抗体，TMEM119 是稳态小胶质细胞的特异性标志物9，但建议与 CD45 和 CD11b 联合使用，因为某些小胶质细胞亚群可能丢失 TMEM119 的表面表达。</li>
	<li>室温（RT）摇床上孵育 10 分钟。</li>
	<li>加入 2 mL FACS 缓冲液进行洗涤。</li>
	<li>在 4 °C、400 × g 离心 5 分钟收集细胞，缓慢倒出上清液，并将试管边缘轻触于纸巾上吸除残留液体。每管中加入含 1 µL RNase 抑制剂和 0.5 µL 碘化丙啶（PI，1:1,000 稀释）的 400 µL FACS 缓冲液重悬细胞。</li>
</ol>
6. 索引 FACS 分选
注意： 此步骤应耗时约 1 小时。
<ol>
	<li>按照标准的流式细胞分选（FACS）程序，根据散射光信号（排除碎片）、单细胞、活细胞（碘化丙啶阴性）、小胶质细胞和髓系细胞（CD45+, CD11b+）设置门控。 
	注意：典型的小胶质细胞表达CD45的水平低于其他边界相关巨噬细胞（如血管周围巨噬细胞和软脑膜巨噬细胞），因此如果研究重点是这些经典小胶质细胞的基因表达谱，则选择CD45低表达且CD11b+的细胞群通常已足够1,2。然而，某些小胶质细胞亚群可能具有较高的CD45表达水平，这在发育阶段或疾病状态下尤为明显。为了确保对小胶质细胞基因表达进行无偏分析，可通过索引分选（index sorting）记录CD45高表达和CD45低表达的免疫表型，并分别收集这两群细胞用于测序及后续分析。此外，可利用TMEM119的表面表达来标记稳态小胶质细胞群体（见步骤5.2），并将其与CD45表达水平及测序结果联合分析。</li>
	<li>将单个小胶质细胞（使用100 µm喷嘴）分选至含有裂解缓冲液（每孔4 µL）的96孔聚合酶链式反应（PCR）板中（具体细节参见已发表的实验方案14）。 
	注意：可在裂解缓冲液中加入外部RNA对照联盟（External RNA Control Consortium, ERCC）RNA外参混合物（材料表），稀释比例为1:2.4 × 107，用于质量控制和标准化2。</li>
	<li>短暂涡旋振荡PCR板，然后使用台式离心机离心沉降。</li>
	<li>立即将样品置于干冰上速冻，并将PCR板保存于-80 °C，直至进行文库构建。 
	注意：作为替代方案，也可将更多细胞收集至含RNA提取缓冲液的1.5 mL离心管中，用于批量RNA测序（bulk RNA-seq）。根据作者经验，按照已发表的实验方案2,14，3,000个细胞足以生成高质量的测序文库。</li>
</ol>
7. 单细胞RNA测序文库构建
注意：此处遵循已发表的方案14，借助液体处理机器人并结合若干修改来构建单细胞RNA测序文库。本文仅对该流程进行简要描述，并重点说明其中的差异。同时处理4块板约需2.5天。
<ol>
	<li>将平板置于冰上解冻，使用含Oligo-dT30VN引物的裂解缓冲液进行逆转录反应，利用热循环仪生成cDNA表1）：42 °C 90 分钟；70 °C 5 分钟；4 °C 保存。然后在扩增 cDNA 时，在起始阶段增加一步外切核酸酶消化处理（表2) 使用PCR预混液和原位PCR（ISPCR）引物（材料表）以及以下PCR条件：37 °C 30分钟；95 °C 3分钟；23个循环：98 °C 20秒，67 °C 15秒，72 °C 4分钟；72 °C 5分钟。</li>
	<li>使用磁珠按每孔18 µL（0.7:1比例）纯化cDNA。将板置于磁力架上孵育5分钟，用新鲜配制的80%乙醇每孔80 µL洗涤样品两次。干燥板15–20分钟后，每孔加入20 µL洗脱缓冲液洗脱cDNA。 
	注意： 为确保质量，使用片段分析仪（高灵敏度下一代测序[NGS]片段分析，1−6,000 bp）检测cDNA的片段大小分布和浓度，仅对片段大小在500−5,000 bp范围内且浓度高于0.05 ng/µL的样品进行后续处理。</li>
	<li>为构建文库，将每份cDNA样本各取0.4 µL与1.2 µL文库制备试剂盒中的Tn5转座酶片段化试剂混合材料表在384孔板中，借助纳升级移液仪于55 °C反应10分钟。 
	注意： 此处加入建议反应体积的1/12.5（5 µL样本和15 µL标签化试剂），以降低成本并同时提高通量。使用纳升级移液系统（材料表用于在384孔板之间转移试剂（本步骤及后续步骤）。</li>
	<li>加入 0.4 µL 中和缓冲液，于室温孵育 5 分钟以终止片段化反应。</li>
	<li>添加384个索引（材料表，0.4 µL 正向引物和 0.4 µL 反向引物，向各样品中加入 1.2 µL PCR 混合液（每份 2 µL），并按照以下条件扩增文库：72 °C 3 分钟；95 °C 30 秒；10 个循环（95 °C 10 秒，55 °C 30 秒，72 °C 1 分钟）；72 °C 5 分钟。</li>
	<li>将来自同一块384孔板的所有单个文库（每种取1 µL）合并，使用磁珠（材料表，0.7:1 的比例）纯化最终合并的文库。</li>
	<li>使用荧光计（材料表）以测定浓度，并使用生物分析仪（材料表) 在测序前检测混合文库的大小分布。目标测序深度为每个细胞100万条原始读长。</li>
	<li>遵循标准的生物信息学流程对测序读长进行过滤和修剪，并完成序列比对2使用计数表和元数据作为输入，利用 Seurat 软件包进行聚类分析15.</li>
</ol>

<ol><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

小胶质细胞会主动与中枢神经系统中的其他细胞类型相互作用，并且对环境刺激非常敏感。为了在分离过程中尽量减少炎症反应及其基因表达的异常变化，本方案在先前发表的方法9基础上进行了优化，现可实现从单只小鼠单侧脑半球的多个脑区并行分离小胶质细胞。组织和试剂始终保持低温，实验需及时完成（从解剖到分选约需3.5小时），并根据组织量有限的特点减少了洗涤步骤和试剂用量。我们选择使用Dounce匀浆法而非其他匀浆方法（如酶消化法），因为机械解离可杀死并去除神经元和其他胶质细胞，同时对小胶质细胞造成的损伤或激活较小9,18。然而，过度匀浆可能会降低小胶质细胞的得率，应予以避免。已有研究显示，基于机械解离结合磁珠法去除髓鞘，再进行FACS分选的流程对小胶质细胞的激活程度较低，这体现在经典炎症基因（如 Tnf、Il1b、Nos2 和 Nfkb2）的表达水平极低9（<strong c...

小胶质细胞占所有神经细胞的5%−10%，是分布于中枢神经系统（CNS）中的常驻巨噬细胞1。在血脑屏障的保护下，健康成年大脑中的典型小胶质细胞具有许多细长的突起，这些突起可快速伸展和回缩，以与实质中的神经元及其他胶质细胞相互作用。在特定发育阶段或受到损伤及疾病相关的免疫刺激时，小胶质细胞还可转变为阿米巴样形态，表现出增强的吞噬功能1,2,3,4。近年来令人振奋的研究发现明确表明，小胶质细胞绝非对脑源性或病理信号无动于衷的旁观者，而是在调控大脑发育和稳态中发挥关键作用，例如支持神经元存活、修剪未成熟突触、促进少突胶质细胞系细胞分化以及血管生成1。随着小胶质细胞更多功能被揭示，人类遗传学研究进一步推动了这一领域的热潮，这些研究表明许多神经退行性疾病风险基因（如TREM2）主要甚至仅在小胶质细胞中表达5,6,7。鉴于其在发育中的重要性及可能驱动疾病的作用，近年来人们投入巨大努力以深入理解小胶质细胞的基因调控机制与功能，期望为神经退行性疾病发现新的治疗靶点1,8。
RNA测序（RNA-seq）能够无偏倚地表征特定细胞类型的基因表达，从而指导科学家在复杂的细胞网络中研究基因功能7。以往RNA-seq主要在群体细胞样本上进行，由此发现了可将小胶质细胞与其他神经细胞和免疫细胞区分开的稳态基因特征9。然而，这种方法可能忽略小胶质细胞之间的分子和功能差异，尤其是那些在发育过程中短暂存在或与衰老及疾病相关的亚群。事实上，单细胞RNA测序（scRNA-seq）凭借其高灵敏度和分辨率，揭示了多种背景下小胶质细胞此前被低估的异质性，彻底改变了该研究领域2,3,10。此外，由于中枢神经系统与循环系统交界处存在其他类似的免疫细胞，scRNA-seq提供的信息有助于设计新工具，在缺乏先验知识的情况下分离这些相关细胞并解析其功能2,11。
已开发出多种不同的单细胞RNA测序（scRNA-seq）平台，每种平台适用于特定的应用场景12。总体而言，基于液滴的方法（如10x Genomics）通量较高，每次运行可对数千至上万个细胞进行测序，且对输入样本的选择性较低，适用于包含混合细胞群体、需要广泛分类的样本。而基于平板的方法则具有更高的灵敏度和测序深度13,14，通常用于靶向细胞分选后获得的特定细胞群体，以揭示细微差异或低丰度转录本。鉴于小胶质细胞在中枢神经系统（CNS）所有细胞类型中所占比例较小，尤其是那些与发育或疾病相关的亚群，通常需要从特定感兴趣区域分离小胶质细胞，并获取深度且全长的转录组信息，以深入理解其异质性。
本文详细介绍了如何从单侧半脑的不同小鼠脑区分离小胶质细胞，这些细胞可用于基于平板的半自动化文库制备流程，进而进行单细胞（或批量）RNA测序。另一侧半脑则可用于组织学验证。本分离方案在先前发表的方法9基础上进行了优化，旨在最大限度地提高少量起始材料中的细胞得率，同时保持小胶质细胞内源性基因表达谱的完整性。我们采用荧光激活细胞分选（FACS）技术将小胶质细胞（或其他感兴趣的免疫相关细胞）富集至96孔板中，并缩小文库制备过程中试剂的使用体积，以提高通量。本文重点介绍这一高灵敏度的单细胞RNA测序平台，尽管也可应用其他基于平板的策略。该方法可轻松适用于从小鼠其他解剖组织（如损伤或疾病病灶区域）中分离小胶质细胞，且适用于几乎任何出生后阶段的小鼠。高效分离不同脑区来源的小胶质细胞，将有助于深入理解其在生理状态和疾病中的功能。

<table><tbody><tr><td>5 M 甜菜碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# B0300-5VL</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP 混合液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R0192</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 15575020</td><td></td></tr><tr><td>10X Hanks&amp;rsquo; 平衡盐溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 14185-052</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X KAPA HIFI Hotstart 预混液</td><td>Kapa Biosciences</td><td>Cat# KK2602</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 圆底聚苯乙烯管，带细胞筛帽</td><td>Corning</td><td>Cat# 352235</td><td></td></tr><tr><td>AATI 高灵敏度 NGS 片段分析试剂盒（1 bp &amp;ndash; 6,000 bp）</td><td>Advanced Analytical</td><td>Cat# DNF-474-1000</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A8806</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington</td><td>Cat# LS002007</td><td>工作液：12500 单位/ml</td></tr><tr><td>DTT，分子级</td><td>Promega</td><td>Cat# P1171</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA 外参混合液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 4456740</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 A 套组（96 个索引）</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 B 套组（96 个索引）</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2002</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 C 套组（96 个索引）</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2003</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 D 套组（96 个索引）</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2004</td><td></td></tr><tr><td>λ外切酶（5 U/&amp;mu;l）</td><td>New England BioLabs</td><td>Cat# M0262S</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 Fc 封闭剂</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat# 553142</td><td></td></tr><tr><td>髓鞘去除磁珠</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>Cat# 130-096-433</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA 样本制备试剂盒</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 高输出试剂盒 v2.5（150 个循环）</td><td>Illumina</td><td>Cat# 20024907</td><td></td></tr><tr><td>PBS（10X），pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 70011044</td><td></td></tr><tr><td>PCRClean DX 磁珠</td><td>Aline Biosciences</td><td>Cat# C-1003-50</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# P3566</td><td>染色：1:1000</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Thermal Fisher Scientific</td><td>Cat# Q32851</td><td></td></tr><tr><td>大鼠单克隆抗小鼠/人 CD11b，Brilliant Violet 421（克隆 M1/70）</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 101236; RRID: AB_11203704</td><td>染色：1:300</td></tr><tr><td>大鼠单克隆抗小鼠 CD45，PE/Cy7（克隆 30-F11）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625</td><td>染色：1:300</td></tr><tr><td>重组 RNase 抑制剂</td><td>Takara Bio</td><td>Cat# 2313B</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe 逆转录酶（100 U/&amp;mu;l）</td><td>Clontech</td><td>Cat# 639538</td><td>含 5x 第一链缓冲液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;寡核苷酸&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 &amp;mu;M ISPCR 寡核苷酸：5' - AAGCAGTGGTATCAA&lt;br/&gt;CGCAGAGT-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli 等, 2014)</td></tr><tr><td>Oligo-dT30VN 引物：5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA&lt;br/&gt;GAGTACT 30 VN-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli 等, 2014)</td></tr><tr><td>TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA&lt;br/&gt;GTACATrGrG+G-3'（&quot;r&quot; 代表核糖核苷酸，&quot;+&quot; 代表 LNA 碱基）</td><td></td><td></td><td>(Picelli 等, 2014)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS 缓冲液</td><td></td><td></td><td>配方：经无菌过滤的 1% FBS、2 mM EDTA、25 mM HEPES 溶于 1X PBS</td></tr><tr><td>MCS 缓冲液</td><td></td><td></td><td>配方：经无菌过滤的 0.5% BSA、2 mM EDTA 溶于 1X PBS</td></tr><tr><td>培养基 A</td><td></td><td></td><td>配方：15 mM HEPES、0.5% 葡萄糖溶于不含酚红的 1X HBSS</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养板&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>384 孔刚性 PCR 微孔板，Axygen Scientific</td><td>VWR</td><td>89005-556</td><td></td></tr><tr><td>硬壳 96 孔 PCR 板</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9631</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 匀浆器，2 ml</td><td>Wheaton</td><td>357422</td><td></td></tr><tr><td>大型去除非目标细胞柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>大型选择柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand 支架</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>RNAzap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>筛网（70 &amp;mu;m）</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf&quot; target=&quot;_blank">http://www.bdbiosciences.com/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>生物分析仪</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>片段分析仪</td><td>Agilent</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito HTS 纳升级移液机器人</td><td>TTP Labtech</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/&quot; target=&quot;_blank">https://www.ttplabtech.com/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 荧光计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr></tbody></table>

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞rna测序

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

作为中枢神经系统中的常驻巨噬细胞，小胶质细胞积极调控大脑发育和稳态，其功能障碍可能引发人类疾病。近年来在揭示稳态下小胶质细胞的分子特征及其在环境刺激下基因表达变化方面已取得显著进展。随着单细胞基因组学技术的发展与成熟，人们日益认识到小胶质细胞的异质性可能构成了其在不同发育阶段和病理条件下发挥多样化功能的基础。通过高效分离特定感兴趣区域的小胶质细胞，并对单个细胞进行高灵敏度的分析，可进一步解析此类异质性。本文提供了一种从单只成年小鼠单侧脑半球不同脑区快速分离小胶质细胞的详细实验方案。同时展示了如何将分选后的小胶质细胞用于基于孔板的深度单细胞RNA测序。我们还讨论了该方法在其他应用场景中的可适应性，并提供了优化系统以适应大规模研究的指导建议。

本方案描述了一种从一个成年灌注脑半球的不同脑区分离和分选小胶质细胞的方法，并随后进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。我们使用Dounce匀浆器制备单细胞悬液，并将其作为富集小胶质细胞的第一步。匀浆不足或过度均会降低细胞得率。此外，成年小鼠脑组织含有较高水平的髓鞘，若未充分去除，也可能降低分选效率和得率。因此，在进行抗体染色前，我们使用台盼蓝染色和血细胞计数板在显微镜下检查细胞悬液，以评估细胞得率、存活率以及髓鞘去除效果（步骤4.9）（图1）。此时，皮层组织的总细胞数应超过30,000，其他组织应超过5,000。细胞存活率应超过90%，且髓鞘碎片较少。
我们使用流式细胞分选仪（FACS）来分选小胶质细胞（或髓系细胞），这些细胞通常表现为CD45低表达且CD11b阳性。对于皮质组织而言，成功的分离应能从所有活的单细胞中获得超过80%的小胶质细胞（图2）。死亡/濒死细胞群仅占制备细胞的一小部分（约10%）。
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我们提供了一种从成年小鼠大脑半球不同解剖区域分离小胶质细胞的方案，随后进行半自动化的文库制备，以实现全长转录组的深度单细胞RNA测序。该方法将有助于阐明小胶质细胞在健康与疾病状态下的功能异质性。

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞RNA测序

作为中枢神经系统中的常驻巨噬细胞，小胶质细胞积极参与调控大脑发育和稳态，其功能障碍可能引发……

该方法能够在单细胞水平上无偏倚地捕获小胶质细胞的基因表达，有助于阐明健康和疾病大脑中小胶质细胞的分子异质性。该技术的主要优势在于，它提供了一套详细的快速分离不同脑区小胶质细胞的操作流程，并展示了如何高效构建用于深度测序的单细胞RNA文库。开始此操作前，请按照文本方案中所述准备好所有所需的缓冲液和溶液，并将其置于冰上预冷。处死小鼠并断头后，使用小型剪刀剪开头顶部的皮肤以暴露下方颅骨。随后剪开矢状缝、人字缝和冠状缝。用镊子小心移除两侧顶骨和间顶骨，避免损伤组织，并将脑组织小心转移至含有A液的解剖培养皿中。使用预冷的刀片沿中线将脑组织切成两个半球。使用55号镊子将小脑与大脑皮层及脑干分离。然后，使用55号镊子小心地从皮层中分离出海马和纹状体，并将每种组织分别转移至不同的收集用培养皿中。首先，使用剃刀片将每个脑区切成小于1立方毫米的细小组织块。使用剪去尖端的1毫升移液器，将组织块转移至预冷的Dounce匀浆器中。通过缓慢地将杵子推入和拉出Dounce匀浆器，进行6到10次完整的研磨，直至无可见的组织块为止。然后，将解离的组织通过70微米细胞筛过滤，收集到50毫升离心管中。用总共六毫升的冷介质A冲洗每个Dounce匀浆器及其杵，然后将冲洗液转移至15毫升离心管中进行离心。在4°C条件下，以400 × g离心单细胞悬液5分钟，刹车设为5。用3毫升MCS在磁性分离器中冲洗一个大型耗竭柱和三个大型选择柱。当组织样本的离心步骤完成后，用移液器吸出上清液并弃去，注意不要扰动沉淀。用含有RNase抑制剂的MCS缓冲液重悬细胞。向每管来自皮层和小脑的重悬细胞中加入100微升髓鞘去除磁珠，向每管来自海马和纹状体的重悬细胞中加入50微升髓鞘去除磁珠。将离心管置于冰上孵育10分钟。随后，向含有皮质细胞的离心管中加入MCS，使总体积达到2毫升；向其余各管中分别加入MCS，使每管体积达到1毫升。当洗涤缓冲液完全流尽后，将2毫升皮质细胞悬液加载至大型去除柱中，将每种其他细胞悬液各1毫升分别加载至不同的大型选择柱中。接下来，用一毫升 MCS 缓冲液洗涤大容量耗竭柱，并用一毫升 MCS 缓冲液分别洗涤每个大容量筛选柱两次。将细胞通过 35 微米滤网帽过滤至圆底 FACS 管中。在 4 摄氏度下，以 400 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。然后，缓慢倒出上清液，并用纸巾轻拭管口边缘。每管中加入 300 µL FACS 缓冲液重悬细胞。首先，每管加入 5 µL 小鼠 FC 受体阻断试剂。冰上孵育五分钟。然后，向每管中加入一微升 CD45 PE size seven 和一微升 CD11B BV421。室温下在摇床上孵育 10 分钟。此后，加入 2 毫升 FACS 缓冲液进行洗涤。在 400 × g 离心力及 4 °C 条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。将每管中的细胞重悬于 400 微升 FACS 缓冲液中，缓冲液中需含有 1 微升 RNase 抑制剂和 0.5 微升碘化丙啶。按照标准的流式细胞分选（FACS）操作流程，使用100微米喷嘴将单个活的小胶质细胞分选至含有裂解缓冲液的96孔PCR板中，每孔含4微升裂解缓冲液。短暂涡旋振荡PCR板，然后使用台式离心机离心。将板子保存在-80°C，直至进行文库制备。准备就绪后，将反应板置于冰上解冻。使用热循环仪进行第一链转录以生成 cDNA，并按照文本方案中所述，通过额外的外切酶消化步骤扩增 cDNA。此后，通过向每个孔中加入 18 微升磁珠来纯化 cDNA。将培养板置于磁力架上孵育5分钟。随后，移除上清液，并用新鲜配制的80%乙醇洗涤样品两次，每次洗涤每孔使用80微升乙醇。进行标签化（tagmentation）时，使用纳升级移液设备，在384孔板中将每个cDNA样品0.4微升与文库构建试剂盒中的Tn5标签化试剂1.2微升混合，在55摄氏度下反应10分钟。为终止标签化反应，加入 0.4 µL 中和缓冲液，室温孵育 5 分钟。随后，向样品中加入 384 个索引序列和 1.2 µL PCR 混合液，并按照文本方案中所述条件扩增文库。将来自同一块 384 孔板的所有单个文库合并，使用磁珠纯化最终合并的文库。本研究中，从小鼠单侧脑半球的皮层、小脑、海马和纹状体中分离小胶质细胞。通过台盼蓝染色和血细胞计数板在显微镜下检测所制备的细胞悬液，以评估细胞得率、细胞活力以及脱髓鞘效果，然后再进行抗体染色。此时，皮层组织的总细胞数应超过 30,000，其他组织应超过 5,000。超过90%的细胞应具有活性，且髓鞘碎片较少。使用流式细胞分选仪（FACS）对小胶质细胞进行分选，这类细胞通常表现为CD45低表达且CD11B阳性。成功的分离应使小胶质细胞占所有活单细胞总数的80%以上，至少在皮质组织中应达到此标准。单个微胶质细胞被捕获进入裂解缓冲液后，RNA被释放并随后逆转录为cDNA，再进行23个循环的扩增。作为一种毛细管电泳平台，片段分析仪配合高灵敏度NGS片段试剂盒可快速、准确地提供每个96孔板孔中cDNA分子的大小分布及数量信息。若样品在500至5,000个碱基对之间呈现弥散条带，并且浓度高于特定阈值，则可用于文库构建。每个细胞的测序深度超过一百万条原始读长，达到了单细胞RNA测序方法的检测能力饱和点。在约60%的比对率下，每个小胶质细胞可检测到超过2,000个基因。通过独立实验重复获得了此前发表的、采用该分离方法生成的数据，证明了在测序群体中检测小胶质细胞特异性基因的灵敏度。通过单个小胶质细胞转录信息，研究人员可以发现特定研究背景下独特的细胞群体，并进一步研究这些新鉴定群体的功能相关性。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

从一个成年小鼠脑半球分离区域特异性微胶质，进行深度单细胞RNA测序

对小鼠脑部特定区域进行RNA表达谱分析，需要精确且可重复的组织采集策略。本文描述了一种结合冠状面脑切片与组织打孔器辅助显微解剖的技术方案。从所获样本中提取的总RNA产量与质量验证了该方法的实用性。...

一种无需激光捕获显微切割的小鼠脑区精细分离方法，用于总RNA提取及后续的高通量测序与基因表达谱分析

该视频演示了一种从成年小鼠脑皮层中分离小胶质细胞的技术。首先，对皮层进行分割和匀浆处理，以去除神经元和其他胶质细胞，同时保留小胶质细胞。随后，将细胞悬液与抗髓鞘磁珠以及磁场接触，从而有效分离出小胶质细胞和髓系细胞，去除髓鞘碎片及含有髓鞘的细胞。...

从成年小鼠大脑皮层中分离小胶质细胞

本文介绍了一种从小鼠脑组织中分离原代小胶质细胞的实验方案。该技术有助于深入理解神经系统疾病。通过结合密度梯度离心与磁珠分选方法，可获得产量充足且纯度较高的细胞样本。此外，我们还概述了小胶质细胞表征的具体步骤。...

通过密度梯度离心法对小鼠原代小胶质细胞进行表征与分离

本文介绍了一种从小鼠中枢神经系统体外分离多种胶质细胞群体的实验方案。该方法可分离出不同区域的小胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞以及星形胶质细胞，以便在多种培养体系中分别研究各类细胞的表型特征。...

从小鼠中枢神经系统多个区域分离和提取胶质细胞

本方案详细描述了单细胞核测序的低起始量样本制备流程，包括小鼠颈上神经节和星状神经节的解剖、细胞解离、冷冻保存、细胞核分离以及标签条形码标记。...

低输入量细胞核分离及条形码抗体多重检测小鼠交感神经节用于单细胞核RNA测序

本文介绍了一种利用柱状磁性激活细胞分选技术，在脱髓鞘疾病动物模型中分离和纯化原代小胶质细胞的实验方案。...

脱髓鞘动物模型中通过磁激活细胞分选法分离小鼠原代小胶质细胞

迄今为止，尚无能够从同一只小鼠中同时分离出所有主要中枢神经系统常驻细胞类型的实验方案。本方案适用于正常小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠，可用于研究神经炎症期间复杂的细胞网络，同时减少所需实验小鼠的数量。...

从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

本方案概述了从成年小鼠脊髓中分离纯化星形胶质细胞和小胶质细胞的方法，可用于后续的RNA分析和细胞培养等应用。方案包括详细的细胞解离方法及操作步骤，旨在提高分离细胞的质量和得率。...

从成年小鼠脊髓中分离纯化的星形胶质细胞和小胶质细胞 体外 检测与转录组学研究

我们描述了一种利用磁珠激活细胞分选（MACS）技术从小鼠下丘脑（或类似的较小脑区结构）中快速分离小胶质细胞的实验方案。经MACS分选获得的下丘脑小胶质细胞可用于 离体 分析并可接种培养以进行 体外...

通过磁激活细胞分选法从新鲜灌注的成年小鼠脑组织中分离下丘脑小胶质细胞

本方案描述了如何从成年小鼠中分离和纯化原代海马区小胶质细胞，并进一步介绍了对这些急性分离的细胞进行全细胞膜片钳记录的操作步骤。...

从成年小鼠海马体中分离小胶质细胞并进行全细胞膜片钳记录

本方案结合流式细胞术和单细胞RNA测序技术，用于分离和表征出生后早期小鼠脑小脑中的小胶质细胞状态。该方法通过酶解消化、Percoll离心及免疫染色，揭示小胶质细胞的异质性，从而加深对其在小脑发育与疾病中作用的理解。...

流式细胞术与单细胞分析用于表征小鼠出生后早期脑发育过程中小胶质细胞的活化

学习从成年小鼠脑半球分离皮层、海马、纹状体和小脑区域特异性小胶质细胞的方法，结合FACS分选与深度单细胞RNA测序技术，揭示健康和疾病状态下小胶质细胞的分子异质性。

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞RNA测序

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