从一个成年小鼠脑半球分离区域特异性微胶质，进行深度单细胞RNA测序
2019年12月3日
我们为从成年小鼠大脑半球的不同解剖区域分离微胶质提供方案，然后为全长转录体进行深度单细胞RNA测序的半自动库制备。该方法将有助于阐明微胶质在健康和疾病中的功能异质性。
这种方法允许在单细胞水平上无偏地捕获微胶质基因表达，这可以帮助阐明健康而患病大脑中微胶质的分子异质性。该技术的主要优点是，它提供了从不同大脑区域快速分离微胶质的详细程序，并展示了如何有效地生成用于深度测序的单细胞RA6库的播放基础。要开始此过程，请准备文本协议中概述的所有需要的缓冲区和解决方案，并在冰上冷却它们。
安乐死和斩首鼠标后，用小剪刀切开头部的皮肤，露出下面的头骨。然后，切穿下垂缝合线、羊皮缝合线和冠状缝合线。使用钳子在不损害组织的情况下拉出双骨和异形骨的两侧，并小心地将大脑移入含有中等 A 的解剖培养皿中。
使用数字 55 钳子将小脑与皮质叶和脑干分离。然后，使用数字55钳仔细解剖出海马和线状体从皮层，并转移每个组织到一个单独的集合培养皿。首先，使用剃刀刀片将每个大脑区域切成小于一立方毫米的细片。
使用带尖端的一毫升移液器，将组织件转移到预冷却的 Dounce 均质器中。通过缓慢地将活塞旋转到 Dounce 均质器中，使组织均匀，进行 6 到 10 次全冲程，直到不存在可见的块。然后，通过70微米过滤器将分离的组织转移到50毫升管中。
用总共六毫升的冷介质 A 冲洗每个 Dounce 均质器和活塞，然后将冲洗转移到 15 毫升管中进行离心。在400倍g和4摄氏度下将单细胞悬浮液离心5分钟，5分钟休息。在磁性分离器中用三毫升 MCS 冲洗一个大损耗柱和三个大选择柱。
当组织样品的离心完成时，移液器取出并丢弃上流液，而不会干扰颗粒。在含有RNase抑制剂的MCS缓冲液中重新填充细胞。将100微升的米林去除珠添加到每个管中，每个管中含有从皮层和小脑中再悬浮的细胞，并在每个管中加入50微升的米林去除珠，每个管中含有从海马和色相体中再悬浮的细胞。
在冰上孵化管子10分钟。在此之后，将MCS添加到含有皮质细胞的管子中，使其体积达到两毫升，并加入剩余的管子，使每个体积达到一毫升。一旦柱为空的冲洗缓冲液，将两毫升皮质细胞加载到大损耗柱上，将彼此一毫升的细胞悬浮加载到单独的大选择柱上。
接下来，用一毫升的 MCS 缓冲液清洗大耗竭柱，每次洗涤时使用一毫升 MCS 缓冲液洗涤每个大选择柱两次。通过 35 微升滤机盖过滤细胞到圆底 FACS 管中。这些管子在400倍g和4摄氏度下离心5分钟，以产生细胞。
然后，慢慢倒出上根，在纸巾上涂抹管子的边缘。用 300 微升的 FACS 缓冲液重新填充每个管中的细胞。首先，在每个管中加入5微升小鼠FC受体块试剂。
在冰上孵育五分钟。然后，在每个管中添加一个 CD45 PE 尺寸 7 微升和 CD11B BV421 微升。在室温下将管子孵育在摇床上10分钟。
在此之后，添加两毫升的 FACS 缓冲液进行洗涤。在400倍g和4摄氏度下离心5分钟，以产生细胞的颗粒。用含有一微升的RNase抑制剂和0.5微升的碘化丙胺的FACS缓冲液，在每管中重新填充细胞。
按照标准的 FACS 程序，将带 100 微米喷嘴的单活微胶质分拣到 96 孔 PCR 板中，每个孔中包含四个微升的解液缓冲液。简要地旋转板，并使用台顶离心机旋转它们。将盘子存放在零下80摄氏度，直到库准备。
准备好继续操作时，在冰上解冻盘子。使用热循环器执行第一个转录，以生成cDNA，并放大cDNA与额外的外核素酶消化步骤，如文本协议中概述。之后，通过在每个井中加入18微升磁珠来净化cDNA。
在磁性支架上孵育板五分钟。然后，取出上一液，用新鲜制作的80%乙醇洗两次样品，每次洗净时用80微升乙醇。要进行标记，请使用纳米光移液机将每个 cDNA 样品的 0.4 微升与 1.2 微升 Tn5 标记试剂混合在 384 井板中，在 55 摄氏度下进行 10 分钟。
要停止标记反应，在室温下加入0.4微升中和缓冲液5分钟。接下来，在384个索引和1.2微升PCR混合到样本和放大库，如文本协议中概述。将同一 384 井板的所有独立库汇集在一起，并使用磁珠来净化最终的池库。
在这项研究中，微胶质从成年小鼠大脑半球的皮层、小脑、海马和线状体中分离。在显微镜下，使用锥蓝和血细胞计对准备好的细胞悬浮液进行检查，以估计在进行抗体染色之前清除米林的产率、细胞活力和功效。此时，皮层的总细胞计数应超过30，000，其他组织应超过5，000。
超过90%的细胞应该是可行的与小梅林碎片。FACS 机器用于对微胶质进行排序，微胶质通常是 CD45 低和 CD11B 正。成功分离应产生超过80%的微胶质出所有活的单细胞，至少对于皮质组织。
一旦单个微胶质被捕获到解解缓冲液中，RNA被释放，然后反向转录到cDNA，然后被放大23个周期。作为毛细管电泳平台，碎片分析仪和高灵敏度NGS片段套件提供有关尺寸分布的快速、准确信息，以及96井板每个井中存在的cDNA分子数量。显示500到5000个碱基对之间的污迹样本，以及高于一定浓度阈值的样本可用于制作库。
这些样本被测序到每个细胞超过一百万的原始读取深度，从而饱和了单细胞RNA测序方法的检测能力。每个微胶质细胞的映射率约为60%，超过2000个基因。以前从这种分离方法生成的数据通过独立实验复制，证明了在序列种群中检测微胶质特异性基因的敏感性。
通过单微胶质转录的信息，研究人员可以在他们感兴趣的环境中发现独特的细胞群，并进一步研究这些新识别的细胞群的功能相关性。
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概览
本文概述了一种从成年小鼠脑半球不同区域分离小胶质细胞的协议。深度单细胞RNA测序的半自动化文库制备方法，可以在健康和疾病背景下研究小胶质细胞的功能异质性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经生物学
- 细胞生物学
- 转录组学
背景
- 小胶质细胞是参与神经元健康的重要脑免疫细胞。
- 了解小胶质细胞功能有助于深入了解神经退行性疾病。
- 单细胞RNA测序提供了详细的基因表达谱。
- 该方法有助于研究疾病模型和细胞反应。
研究目的
- 提供一种可靠的小胶质细胞分离协议。
- 能够在单细胞水平上分析基因表达。
- 阐明不同条件下小胶质细胞的分子异质性。
使用的方法
- 通过解剖和均质技术分离小胶质细胞。
- 通过FACS进行细胞分选以丰富小胶质细胞群体。
- 文库制备包括从分离的细胞中合成cDNA和扩增。
- 协议包括缓冲液、孵育和离心步骤以获得最佳结果。
主要结果
- 该程序允许有效分离和表征小胶质细胞。
- 单细胞RNA测序揭示了多样的基因表达模式。
- 有助于了解小胶质细胞在健康和疾病中的作用。
- 该方法确保了分离细胞的高活性和高产率。
结论
- 本研究展示了一种研究小胶质细胞生物学的关键方法。
- 研究结果增强了对小胶质细胞在健康和疾病中功能的理解。
- 研究结果可能指导未来神经免疫相互作用的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Region-specific isolation of adult mouse microglia for deep single-cell RNA sequencing enables high-resolution mapping of cellular heterogeneity, supporting mechanistic de-risking in neuroinflammation and neurodegeneration pipelines. This workflow provides predictive confidence for target validation and functional annotation of microglial subpopulations, informing early-stage portfolio decisions. Integration of robust single-cell transcriptomics enhances translational continuity from discovery through preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microglial heterogeneity across brain regions for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by revealing region- and state-specific gene expression profiles.
- Facilitates identification of novel microglial subtypes relevant to disease models.
- Provides high-confidence data for prioritizing targets in neuroimmune pathways.
Screening & Assay Development
- Generates validated single-cell suspensions suitable for downstream transcriptomic assays.
- Delivers quantitative, reproducible cell viability and yield metrics for assay standardization.
- Enables scalable preparation of region-specific microglia for compound screening platforms.
- Supports robust evaluation of compound effects on distinct microglial populations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microglial transcriptomic profiles with disease-relevant biomarkers for translational studies.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by linking molecular signatures to functional phenotypes.
- Supports risk-adjusted advancement of neuroinflammation and neurodegeneration programs.
- Provides mechanistic insights for predictive modeling of therapeutic responses.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions region-specific microglia isolation and deep single-cell RNA sequencing at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless integration into neurobiology-focused pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping microglial diversity at single-cell resolution.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-content transcriptomic data for comparative analysis across brain regions and conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and mechanistic continuity from mouse models to human disease contexts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for region-specific cell isolation and single-cell profiling across neurobiology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroimmune target validation.
- Operational Value: Standardizes isolation and sequencing workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of neuroinflammation assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and programs based on robust single-cell data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in brain dissection, FACS, and single-cell library preparation.
- Demands access to high-sensitivity sequencing and capillary electrophoresis platforms.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and data analysis protocols.
- Adaptable to other brain regions or species with protocol optimization.
- Dependent on maintaining high cell viability and minimizing myelin contamination for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
Brain Region Dissection
1:43
Mechanical Tissue Dissociation
2:40
Myelin Removal
4:25
Staining for Fluorescence-activated Cell Sorting
5:18
Index FACS Sorting
5:46
Single-cell RNA-sequencing Library Preparation
7:17
Results: Isolation of Region-Specific Microglia for Deep Single-Cell RNA Sequencing
9:16
Conclusion
