用于大鼠环周性食管重建的组织工程移植物

在大鼠模型中，食管环周修复在技术上具有挑战性，因此需要开发一种组织工程食管，以实现食管黏膜和肌肉的再生，同时避免食管吻合口漏的发生。我们已构建一种双层管状支架作为初步模型，其由内层纳米纤维和外层3D打印丝组成，并结合微血管吻合技术，以尽量减少移植后唾液渗漏。传统的标准食管重建术常伴随多种并发症和较高的发病率。

因此，食管组织工程可能是构建患者自体食管模型的一种有前景的替代策略。混合支架、生物反应器培养以及口服营养系统的组合可应用于任何具有类似污染环境且持续承受机械压力的系统。首先，将3D打印的食管支架暴露于紫外线下照射一小时，再用乙醇浸泡10分钟，并用PBS清洗三次，以实现灭菌。

最后一次洗涤后，将双层管状支架放入非黏附性的24孔组织培养板中，并在支架内表面均匀而轻柔地加入每毫升基底膜基质中含1×10⁶个脂肪来源的人类间充质干细胞的生长培养基。使用脉动流生物反应器系统，将接种细胞的管状支架牢固地固定在生物反应器培养室内的丙烯酸支架上，并向培养室中加入500 mL生长培养基。随后，在含5%二氧化碳的湿润环境中施加1 dyne/cm²的流动诱导剪切应力。

五天后，根据标准操作流程，使用活/死细胞活力检测试剂盒检测支架内表面的细胞反应，并通过共聚焦显微镜对细胞成像。在开始手术操作前，确认麻醉大鼠对足底反射无反应，并将动物置于无菌手术单上呈仰卧位。使用电动剪毛器去除手术区域的毛发，并依次用聚维酮碘和70%乙醇擦拭暴露的皮肤进行消毒。

进行T管置入时，在大鼠腹部做正中皮肤和肌肉切口，使用手术刀片在胃前壁创建一个3毫米的开口。将硅胶T管的管端插入缺损部位，使其固定于胃壁，并仔细将导管缝合至胃肌层组织。使用4-0薇乔缝线缝合腹壁。

将植入的T型管远端小心地通过皮下隧道插入颈部后方，并使用套管针将肝素帽连接到T型管末端，以防止胃内容物反流。肝素帽就位后，使用4-0聚乳酸羟乙酸缝线缝合腹部皮肤的所有层次，并将大鼠放入代谢笼中持续监测，直至完全恢复卧位。T型管植入一周后，按照所示方法准备大鼠进行手术。

将大鼠置于显微镜下，在暴露的已消毒皮肤上做一前正中颈部切口。分离颈阔肌以暴露气管食管结构。将食管左侧与气管分离。

仔细将食管上段与甲状腺分离，使用手术剪在食管上制作一个长度为五毫米的全周性缺损，缺损需包含食管的所有层次。接着，在食管上段残端右后下缘与支架之间置入9-0缝线，然后从右向左继续缝合食管上段残端与支架，以在远端食管缺损的上端建立显微吻合。随后，以相同方式将支架与食管下段残端的上缘进行吻合。

吻合完成后，将周围甲状腺组织瓣覆盖于移植部位，以确保移植物的血液供应及稳定维持。随后，使用4-0薇乔缝线缝合皮下肌肉和皮肤组织，并将大鼠置于代谢笼中，放置在红外线加热装置上并持续监测，直至完全恢复卧位。通过注射将人源间充质干细胞包埋的基底膜基质均匀涂布于支架内壁后，扫描电子显微镜评估显示，该基质中的人源间充质干细胞呈现出预期的细胞形态。

如所示，在大鼠全周性食管缺损模型中进行食管移植后，移植物被甲状腺腺瓣覆盖，以实现稳定固定并向植入部位提供血液供应。食管移植大鼠的体重在术后约九天内维持在340克左右，此后由于多种原因，动物体重迅速下降，并在第15天前死亡。尽管大多数大鼠会因毛球引起非食管性梗阻，但在所有实验动物中，均未观察到明显的穿孔、吻合口漏伴瘘管形成、血清肿积聚、脓肿形成或周围软组织坏死等现象。

通过角蛋白免疫荧光染色可确认移植部位的再上皮化，而Masson三色染色则可清晰观察到再生的胶原层和弹性纤维。通过抗肌萎缩蛋白（desmin）免疫组织化学分析评估，丰富的新生血管形成也证明了食管肌层的再生。该手术的成功依赖于通过颈部后方固定T管以实现其稳定维持，从而在食管重建期间提供营养支持。

为了克服该手术常见的早期死亡率，可在食管植入后应用类器官或早期血管化技术，以促进功能性食管重建。