Name: 器官细胞生存在器官细胞切片培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: 了解小鼠小脑器官型切片培养技术，用于模拟神经发育过程中浦肯野细胞死亡并筛选神经保护药物。该方法保留组织结构和细胞连接，为研究神经退行性疾病提供可靠的体外模型。

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成像工作在西北大学先进显微镜中心完成，该中心由授予罗伯特·H·卢里综合癌症中心的美国国家癌症研究所癌症中心支持专项基金（NCI CCSG P30 CA060553）慷慨资助。我们感谢肖恩·麦克德莫特提供的技术协助与支持，以及玛雅·爱泼斯坦为图1提供的手绘插图。

所有涉及动物的实验均按照西北大学动物研究委员会的规定进行。
1. 器官型小脑切片培养前的准备
<ol>
	<li>在事先用70%乙醇喷洒过的细胞培养超净台内，于连接无菌接收瓶的250 mL瓶顶式真空过滤器中制备200 mL培养基。加入100 mL基础培养基Eagle（BME）、50 mL Hank平衡盐溶液（HBSS）、50 mL热灭活马血清、1 mL 200 mM L-谷氨酰胺（终浓度1 mM）以及5 mL 200 g/L葡萄糖溶液（终浓度5 mg/mL）。将培养基经真空过滤后，置于+4 °C保存，可使用长达一个月。</li>
	<li>在无菌生物安全柜中，从包装中取出一个6孔细胞培养板，每孔加入1 mL培养基。若需进行处理，向处理孔中加入药理试剂，对照孔中加入等体积的溶剂对照溶液。本研究中，向处理孔加入1 µL无菌3 M KCl溶液（终浓度30 mM），向对照孔加入1 µL无菌水。</li>
	<li>将所需数量的独立包装、带有亲水性聚四氟乙烯（PTFE）膜（孔径=0.4 µm）的细胞培养小室移入细胞培养超净台内。小心拆开包装，用无菌镊子取出细胞培养小室，逐个放入6孔板的孔中，避免小室膜与培养基界面产生气泡。将小室置于37 °C、5% CO2培养箱中至少平衡2小时后再进行细胞培养。 
	注意：组织切片机长期放置于细胞培养超净台内。</li>
	<li>准备两个200 mL烧杯，一个装有150 mL无菌水，另一个装有150 mL 70%乙醇。使用前，先将手术器械浸入70%乙醇中，再浸入水中冲洗。 
	注意：手术器械接触乙醇后不可立即使用。</li>
	<li>将双刃刀片在70%乙醇烧杯中消毒，用无菌镊子将其安装至刀片架上，并使用刀片夹紧扳手固定。晾干后备用。</li>
	<li>将组织切片机配套的塑料圆盘在70%乙醇烧杯中消毒。放置圆盘前，用70%乙醇喷洒切割台表面，晾干后备用。</li>
</ol>
2. 解剖与小脑器官型切片培养
<ol>
	<li>将小鼠幼崽放入细胞培养超净台中进行解剖操作。</li>
	<li>使用直型手术剪迅速剪下幼崽头部（图1A）。</li>
	<li>用直型敷料镊夹住幼崽鼻部固定头部，从后端开始，沿头侧至中线方向，使用直型眼科剪剪开头皮。</li>
	<li>颅骨的切开操作步骤相同。 
	注意：解剖过程中务必使剪刀尖端朝外，以避免损伤小脑。</li>
	<li>取出脑组织并转移至盛有冷HBSS + 5 mg/mL葡萄糖的60 mm培养皿中。</li>
	<li>使用无菌直型精细镊小心分离出小脑（图1B），再用无菌弯型精细镊将其转移至组织切片机切割台上的塑料载片上。</li>
	<li>通过旋转切割台调整组织方向，以进行旁矢状切面切割。</li>
	<li>向右拉动切割台释放旋钮，移动切割台，使刀片位于组织边缘。</li>
	<li>将切片厚度调整为350 µm，刀片速度设为中等。</li>
	<li>启动切片机。待整个小脑完全切片后（图1C），关闭切片机。</li>
	<li>用无菌镊子取出塑料载片。</li>
	<li>小心将塑料载片靠近盛有HBSS + 5 mg/mL葡萄糖的60 mm培养皿。使用无菌移液管将冷HBSS + 5 mg/mL葡萄糖溶液滴加到组织上，使小脑切片落入缓冲液填充的培养皿中以便收集。</li>
	<li>使用微探针将小脑切片彼此分离。用移液管取出质量良好的切片（建议选用靠近蚓部的组织切片），并将其放入预先平衡的细胞培养插入式培养器中（图1D）。</li>
	<li>使用微探针将小脑切片在细胞培养插入式培养器上定位，然后用移液管小心吸除多余的HBSS + 5 mg/mL葡萄糖溶液。 
	注意：此阶段组织极为脆弱，易受物理损伤。每插入式培养器可培养的小脑切片最大数量取决于供体动物的年龄。P0–P4龄动物可培养6–8片，P5以上龄动物可培养4–6片。</li>
	<li>将培养皿放入培养箱中，每2–3天完全更换一次培养基。</li>
	<li>为评估浦肯野细胞存活情况，可在体外培养5天时即收集切片。若用于其他目的，切片可在培养中维持数周（图1F）。 
	注意：在进行浦肯野细胞存活实验时，更换细胞培养基时无需重新添加药理学处理剂（图1F）。</li>
</ol>
3. 免疫荧光
<ol>
	<li>从培养箱中取出6孔板，吸去细胞培养基，用1× PBS洗涤细胞培养插件，并在插件下方加入1 mL、上方加入500 µL冷的4%多聚甲醛溶液，于4℃固定1小时。</li>
	<li>在旋转摇床上用1× PBS对插件进行4次洗涤，每次10分钟，每次在插件下方加入1 mL、上方加入500 µL。</li>
	<li>用刷子将小脑切片从一个细胞培养插件转移至已预装含有1× PBS、0.25% Triton X-100和3% BSA（PBS-TB）的24孔板中的一个孔内，每孔500 µL。</li>
	<li>在室温下用PBS-TB溶液孵育切片1小时，进行通透和封闭处理。</li>
	<li>将一抗用PBS-TB溶液稀释后加入，每孔200 µL，在4℃下于旋转摇床上避光孵育过夜。</li>
	<li>次日，在旋转摇床上用1× PBS进行4次洗涤，每次10分钟，每孔500 µL。</li>
	<li>加入用PBS-TB溶液稀释的二抗，每孔200 µL，在室温下于旋转摇床上避光孵育2小时。</li>
	<li>在旋转摇床上用1× PBS进行4次洗涤，每次10分钟，每孔500 µL。</li>
	<li>使用Hoechst 33342（用1× PBS稀释至2 µg/mL）对切片进行核复染，在室温下避光孵育10分钟，每孔500 µL。</li>
	<li>用移液管将小脑切片转移至显微镜载玻片上，避光完全自然晾干。用1× PBS重新润湿切片后，滴加数滴封片剂（约80 µL）覆盖盖玻片，注意避免产生气泡。</li>
	<li>待封片剂完全固化后，小脑切片即可用于成像。</li>
</ol>
4. 细胞存活的成像与定量分析
<ol>
	<li>根据制造商和/或成像核心设施的说明，打开显微镜和激光器。</li>
	<li>启动图像采集软件。</li>
	<li>使用10倍物镜，定位未发生改变的小脑切片，这些切片通常包含9–10个叶（一般为靠近小脑蚓部的小脑切片）。</li>
	<li>启动z轴层扫采集功能。设定z轴层扫范围，以涵盖小脑切片中所有存在的浦肯野细胞。设置步长为2 µm，并开始采集。将采集的图像以采集软件制造商指定的格式保存，以保留相关元数据。</li>
	<li>使用Bio-formats插件18在ImageJ中打开采集的文件。</li>
	<li>进入 图像 &#62; 堆栈 &#62; Z轴投影…（图2A）。</li>
	<li>在“投影类型”下拉菜单中选择 最大强度投影，然后点击 确定（图2B）。</li>
	<li>将生成一幅扁平化的二维图像。双击 多点 工具，使 点工具 窗口出现。取消勾选 标记点 选项，以便更清晰地观察已计数的细胞。随后，直接点击浦肯野细胞的胞体开始计数（图1E）。已计数细胞的总数将显示在 点工具 窗口的底部（图3）。 
	注意：通常，每个细胞培养插件中至少可量化3个无损伤且包含9–10个叶的切片。为评估药理学试剂的神经保护作用，应至少进行3次独立实验。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

小脑脑片培养是研究出生后发育过程中程序性浦肯野细胞死亡的有力工具。该技术可用于快速筛选候选分子的神经保护潜力。其主要优点在于操作简便、成本效益高，且对设备的投入要求较低（振动切片机的价格可能比组织切片器高出3倍以上）。此外，每只幼鼠可制备10至15片健康的脑片，仅需一只动物即可同时进行多种不同的实验分析。
为了获得一致且可重复的实验结果，必须尽可能高效地进行培养，并选择健康的 cerebellar 组织切片用于培养。该方法也适用于长期培养（可长达数月）。因此，在解剖和切片过程中必须采用良好的无菌操作技术，以避免污染，从而无需在培养中添加抗生素。
小脑切片培养模型可保留组织切片平面内及培养区域中的原有细胞间相互作用。但需注意：与培养区域外靶区的连接可能被切断。传入纤维提供的神经营养因子供应也可能中断，从而影响神经元的存活。这一问题可通过进行器官型切片共培养部分克服。已有研究表明，当与下橄榄核切片共同培养时，攀爬纤维能够侵入出生后的小脑切片培养物14,<sup ...

体外建模是生物医学研究中的重要工具。它使研究人员能够在特定的细胞类型或分离的系统/器官中研究并严格控制特定机制。器官型脑片培养是一种广泛应用的体外技术，尤其在神经科学领域1。该方法最初由Gähwiler建立，他采用滚管技术培养脑片2，随后Yamamoto等人进行了改进，引入微孔膜用于进行皮层脑片培养3。与原代细胞培养相比，器官型脑片培养的优势在于能够保留组织的细胞结构以及组织切片平面上的天然细胞间连接。
已从中枢神经系统的多个部位培养出器官型脑片，例如海马体4、大脑皮层5、纹状体6、小脑4,7以及脊髓8,9等。此类脑片已被证实是药物发现研究中的有力工具10。神经活性分子的作用可通过多种方式进行评估：利用免疫染色和生物化学检测评估细胞存活与神经退行性变，或通过电生理学和活体成像技术评估神经环路的形成或破坏。
本研究的目的是描述一种简单的器官型小脑切片培养方法，该方法被公认为是体外模拟小脑发育的相关模型。特别是，我们聚焦于浦肯野细胞发育性死亡的研究。在体内，浦肯野细胞在出生后第一周发生凋亡，峰值出现在出生后第3天（P3）11。在小脑切片培养中也观察到相同的模式：当小脑取自出生后第1至第8天（P1–P8）的动物时，浦肯野神经元通过凋亡方式死亡，死亡高峰同样出现在P34,12。器官型小脑切片培养的应用已帮助鉴定出多种神经营养保护分子7,13，并部分揭示了这种程序性细胞死亡所涉及的机制14,15,16。本文所述方案基于Stoppini等17在海马组织中的研究，并由Dusart等4针对小脑组织进行了改良。该方案包括出生后小脑的快速解剖与切割；将小脑切片置于含有微孔膜的细胞培养插入式培养板上进行培养，可选择性地添加神经营养保护处理；以及通过免疫荧光染色评估神经元存活情况。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594 驴抗小鼠 IgG 二抗</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>A21203</td><td></td></tr><tr><td>基础Eagle培养基（BME）</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>21010046</td><td></td></tr><tr><td>II级A2型生物安全柜</td><td>NuAire</td><td>NU-540-400</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>刷子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗钙结合蛋白D-28K抗体（CB-955）</td><td>Abcam</td><td>ab82812</td><td></td></tr><tr><td>CO2培养箱</td><td>NuAire</td><td>NU-5700</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 平底6孔细胞培养板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，22 × 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>直型持针钳</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8949</td><td></td></tr><tr><td>双刃刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>50949411</td><td></td></tr><tr><td>200度乙醇</td><td>Decon Labs, Inc</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>直型眼科剪</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8428</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-127</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 100X</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>25030149</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖溶液</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; 平衡盐溶液</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物</td><td>Fisher Scientific</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>马血清，热灭活，新西兰来源</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>McIlwain组织切片机</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9914528</td><td></td></tr><tr><td>微电极</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-850</td><td></td></tr><tr><td>Millicell细胞培养插入式培养皿</td><td>Millipore Sigma</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow 一次性无菌PES膜滤器，250 mL</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R 共聚焦激光显微镜系统</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements 成像软件</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Acros Organics</td><td>41678-0010</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>直型手术剪</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8403</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床 Belly Dancer</td><td>IBI Scientific</td><td>BDRLS0003</td><td></td></tr><tr><td>Prism 8</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿，60 mm 带握环</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012921</td><td></td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>Falcon/Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>无菌移液管</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>13-711-21</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

浦肯野细胞在离体小脑切片培养中的存活

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

器官型脑片培养是一种强大的体外模型，相较于解离的原代细胞培养，能更接近地模拟体内环境。在出生后早期发育阶段，小脑浦肯野细胞已知会经历一个易损期，在此期间发生程序性细胞死亡。本文提供了在此关键时期进行小鼠器官型小脑脑片培养的详细实验方案。通过进一步标记脑片，可评估浦肯野细胞的存活情况以及神经保护治疗的效果。该方法对于筛选新的神经活性分子具有极高的应用价值。

如图4所示，本方案可制备小脑组织切片培养物，通过免疫荧光染色和图像采集步骤评估浦肯野细胞的存活情况。浦肯野细胞使用抗-Calbindin D-28K抗体（稀释度1/200）与Alexa594标记的抗小鼠二抗（稀释度1/300）联合标记。图像拼接由显微镜采集软件（NIS-Elements）自动完成，以获得完整小脑切片的图像。每片切片中的浦肯野细胞数量被输入Prism 8软件，用于生成图表并进行统计分析。在P6阶段，对照组中浦肯野细胞的存活率较低，这与其已知的易损期一致4（图4A,E）。随着供体动物年龄增长并度过该关键时期，细胞存活率逐渐升高（图4C,E）。通过高浓度KCl处理小脑切片，可成功诱导其去极化并促进细胞存活14（图4...

器官型脑片培养是研究神经发育或变性/再生过程的有力工具。本文描述了一种在小鼠小脑脑片培养中模拟浦肯野细胞神经发育性死亡的实验方案。该方法可能有助于神经保护药物发现领域的研究。

器官型脑片培养是一种强大的体外模型，与分离的原代细胞培养相比，能更接近地模拟体内环境。在早期……

器官型脑片培养是研究神经发育以及退行性或再生过程的有力工具。与分离的原代细胞培养相比，该技术能更紧密地模拟体内环境，因为组织的结构以及细胞间的天然连接在切片平面内得以保留。该方法可用于快速筛选候选分子的神经保护潜力。在此，我们演示了发育中小脑浦肯野细胞死亡的研究。但器官型脑片培养同样适用于模拟中枢神经系统几乎所有区域的神经退行性疾病。来自我实验室的技术员肖恩·麦克德莫特（Sean McDermott）将与詹妮弗·拉科托马蒙吉（Jennifer Rakotomamonjy）共同演示该实验步骤。在收获小脑切片之前，于无菌生物安全柜中，向六孔培养板的每个孔中加入一毫升经真空过滤的培养基，并向处理孔中加入感兴趣的药理学试剂，向对照孔中加入等体积的溶剂。使用无菌镊子将一个孔径为0.4微米的聚四氟乙烯（PTFE）膜滤器插入每个孔中，注意避免膜与培养基界面处产生气泡，并将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中平衡两小时。为收获小脑，用直头敷料镊夹住幼鼠鼻部固定头部，用直眼科剪从后端向外侧沿中线剪开头皮。以相同方式剪开颅骨，剪刀尖端朝外，避免损伤小脑，然后使用刮勺将脑组织转移至含有冷HBSS和5毫克/毫升葡萄糖的60毫米培养皿中。使用直头敷料镊子小心分离出小脑，并用无菌弯头精细镊子将组织放置在切片机切削台的塑料圆盘上。旋转切削台以调整组织方向，以便获取旁矢状切面，然后将切削台释放旋钮向右拉动，移动切削台，直至刀片位于组织边缘处。然后将切片厚度调整为350微米，刀片速度调至中等，启动切片机。当整个小脑切片完成后，关闭切片机。使用无菌镊子将切片持于一个新的60毫米培养皿上方。使用移液管将含葡萄糖的HBSS冲洗到培养皿上，使脑片落入皿中。然后尽量减少对样本的触碰，用显微探针将脑片分离。用移液管将靠近小脑蚓部的脑片转移至六孔板中的各个细胞培养插件上，并用显微探针将脑片调整至每个插件的中央位置。当所有切片放置完毕后，小心吸除多余的 HBSS 加葡萄糖溶液，并将培养板放回细胞培养箱中。进行免疫荧光染色时，移除每个孔中的上清液，并用 PBS 清洗插入膜。每个插入膜的孔中加入 1 毫升冰冷的 4% 多聚甲醛，同时在每个插入膜表面加入 500 微升，固定 1 小时。固定结束后，在轨道摇床上用移液器将每个插入物下方加入1毫升新鲜PBS，上方加入500微升新鲜PBS，每次洗涤10分钟，共洗涤四次。预先在24孔板的每个孔中加入500微升PBS-TB，用画笔将每个细胞培养插入物中的小脑切片转移至24孔板的各个独立孔中。室温下对切片进行一小时的通透和封闭处理。孵育结束后，在摇床上于4°C条件下，每孔加入200微升用PBS-TB稀释的目标一抗，避光孵育过夜。次日早晨，在摇床上用新鲜PBS清洗切片4次，每次10分钟，每孔500微升。随后在摇床上避光、室温条件下，加入相应的荧光标记二抗孵育2小时。孵育

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器官细胞生存在器官细胞切片培养

本方法描述了小脑类器官培养物的制备，以及特定凋亡刺激对不同类型小脑细胞存活能力的影响。...

器官型小脑培养：凋亡挑战与检测

我们介绍一种可用于观察并定量评估在小脑组织切片培养物中生长的单个浦肯野细胞树突树形态的实验方案。该方案旨在促进对浦肯野细胞树突发育机制的研究。...

器官型脑片培养中浦肯野细胞树突形态的分析

本视频展示了一种从小鼠幼崽脑组织中获取小脑器官型切片的技术，并将切片培养于添加了营养物质和生长因子的培养基中，以模拟小脑的发育过程 体外...

分析器官型小脑切片培养中浦肯野细胞的存活情况

本文介绍了一种利用前脑和小脑脑片培养系统研究NG2细胞和少突胶质细胞的技术。该方法可在保持组织细胞结构完整性的同时，通过简便地调控细胞外环境，观察少突胶质细胞谱系中细胞增殖与分化的动态过程。...

用于研究少突胶质细胞动态及髓鞘形成的器官型脑片培养技术

本文介绍了一种利用脑片组织培养技术研究海马体出生后神经发生的实验方法。该方法可实现 体外...

用于研究出生后神经发生的器官型脑片培养

小脑外颗粒层是发育中大脑内发生最大规模过渡性扩增的部位。本文介绍了一种在增殖高峰期靶向该层进行遗传修饰的实验方案 离体...

离体 培养鸡小脑切片及颗粒细胞前体的靶向电穿孔

本文介绍了一种从小鼠小脑制备脑片器官型培养物的方法，并通过免疫组织化学染色显示髓鞘，适用于研究中枢神经系统中髓鞘形成及再髓鞘化的机制。...

制备及髓鞘化器官型小脑切片培养物的免疫染色

尽可能充分地在体外实验中模拟体内条件并非易事。使用原代细胞培养是理解完整生物体中细胞生物学的重要一步。本方案详细介绍了如何成功培养和培育小鼠胚胎小脑神经元。...

从小鼠胚胎小脑分离神经元的原代培养

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由人多能干细胞可扩展地生成成熟小脑类器官及通过免疫染色进行表征

本文中，我们提供了一种可重复的方法，用于生成并长期维持移植了神经干细胞的脊髓组织切片 离体 用于测试细胞替代疗法的模型。...

长期小鼠脊髓器官型切片培养作为验证脊髓损伤后细胞移植的平台

小脑浦肯野细胞（PCs）对DNA损伤应答缺陷尤为敏感。本文介绍了一种用于直观评估小脑器官型培养物中浦肯野细胞对DNA损伤应答动态过程的实验方案，该方法涉及对蛋白质结合的多聚（ADP-核糖）链进行染色。...

利用小脑器官型培养物在浦肯野细胞中可视化DNA损伤应答

了解小鼠小脑器官型切片培养技术，用于模拟神经发育过程中浦肯野细胞死亡并筛选神经保护药物。该方法保留组织结构和细胞连接，为研究神经退行性疾病提供可靠的体外模型。

浦肯野细胞在离体小脑切片培养中的存活

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