Name: 铁限分枝杆菌产生的细胞外囊泡的分离和特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学习在低铁条件下培养结核分枝杆菌并分离纯化细胞外囊泡的方法。该方案可获得高纯度膜囊泡，用于生化功能分析，有助于研究细菌致病机制。

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我们感谢 Rafael Prados-Rosales 分享抗 MEV 抗血清，以及 Navneet Dogra 进行纳米颗粒追踪分析。

1. 铁耗尽型限定培养基的制备
<ol>
	<li>在塑料容器中，将5 g KH2PO4、5 g L-天冬酰胺、20 mL甘油和2 g右旋糖溶于900 mL去离子水中，配制1 L最低培养基（MM）。避免使用玻璃器皿，以防铁污染。用5 N NaOH将pH值调节至6.8，并加水定容至1 L。</li>
	<li>加入50 g金属螯合树脂（MCR），使用磁力搅拌子在4 °C下轻轻搅拌24小时。通过带有塑料接收器的0.22 µm滤器过滤，以去除MCR并实现灭菌。为加快过滤速度并防止滤器堵塞，过滤前让树脂静置约30分钟。 
	注意：根据原子吸收光谱法测定，该培养基中残留铁含量低于2 µM。</li>
	<li>在MM中添加0.5 mg/L ZnCl2、40 mg/L MgSO4和0.1 mg/L MnSO4。分别用去离子水配制上述金属补充物的浓缩储备液（1,000倍），过滤灭菌后加入MM中。铁缺乏但补充其他金属的MM在此简称为低铁MM（LIMM）。</li>
	<li>从溶于10 mM HCl中的50 mM FeCl3储备液中取1 mL加入1 L LIMM中（终浓度为50 µM），以制备高铁MM（HIMM）。</li>
</ol>
2. 在铁限制条件下培养分枝杆菌
<ol>
	<li>解冻50 µL冻存的含15%甘油的结核分枝杆菌（Mtb）菌种，将其划线接种于添加了10% ADN增补剂（含5 g/L白蛋白、2 g/L葡萄糖、0.85 g/L氯化钠、0.2%甘油和0.05%吐温-80）的琼脂平板上10。将平板在37 °C培养至可见菌落。</li>
	<li>挑取单个Mtb菌落10，接种至2 mL添加ADN增补剂的分枝杆菌液体培养基中（材料表）。在37 °C振荡培养。</li>
	<li>使Mtb培养物生长至对数期末期（OD540&#160;约为0.8）。为确认生长状态，使用分光光度计测定OD540。</li>
	<li>取200 µL对数期末期培养物，均匀涂布于添加0.2%甘油、0.05%吐温-80及ADN增补剂的分枝杆菌琼脂平板（材料表）上。至少接种5块平板。将平板在37 °C培养至细菌生长形成融合菌层。Mtb约需1周时间。</li>
	<li>用LIMM润湿无菌棉签，用其从琼脂平板上刮取细菌，并接种至100 mL LIMM中，制备浓度约为OD540 1.0的浓缩菌悬液。</li>
	<li>将该菌悬液用LIMM稀释10倍至1 L，并分装至两个无菌塑料瓶中，每瓶500 mL。</li>
	<li>取2 mL培养物转移至5 mL培养管中，加入10 µL 10%（v/v）tyloxapol。</li>
	<li>将培养物静置于37 °C培养14天。</li>
</ol>
3. MEVs 的收集
<ol>
	<li>在收集时测定2 mL培养物在540 nm处的光密度（OD540）。将培养物进行10倍系列稀释，取每种稀释液100 µL接种于含有ADN和0.05% Tween-80的琼脂平板上。</li>
	<li>将培养物转移至五个225 mL锥形离心管中，在20 °C条件下以2,850 × g离心7分钟。</li>
	<li>用50 mL移液管收集培养上清液，并通过0.22 µm滤器过滤除菌。</li>
</ol>
4. MEVs 的分离
<ol>
	<li>将培养滤液转移至置于 4 °C 的搅拌式超滤系统中，使用 100 kDa 截留分子量的滤膜在 &#60;50 psi 条件下过滤浓缩至约 50 mL。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 15,000 x g 离心浓缩后的培养滤液 15 分钟，并收集上清液。</li>
	<li>将培养滤液置于聚碳酸酯超速离心管中，在 4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 2 小时。</li>
	<li>通过轻柔吹打，用总共 1 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重悬膜性沉淀物。</li>
	<li>取步骤 4.4 中获得的沉淀物悬液 0.5 mL，与 1.5 mL 的 60% 碘克沙醇溶液混合，得到终浓度为 45%（w/v）的碘克沙醇溶液。将该混合液加至 13 mm x 51 mm 聚丙烯薄壁超速离心管底部。</li>
	<li>在 MEV-碘克沙醇 45% 悬液上方，依次覆盖 1 mL 的 40%、35%、30%、25% 和 20%（v/v，溶于 PBS）碘克沙醇溶液，最上层加入 1 mL PBS。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 18 小时。</li>
	<li>使用 1 mL Hamilton 注射器从顶部开始收集 1 mL 的密度梯度组分。</li>
	<li>将每份收集的组分用 PBS 稀释至 20 mL，并在 4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 2 小时。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀物重悬于 0.5 mL PBS 中，并于 4 °C 保存该沉淀物。</li>
</ol>
5. MEVs 的定量分析
<ol>
	<li>通过Bradford法测定各组分中的蛋白质浓度（材料表），遵循制造商的说明书。</li>
	<li>进行膜脂质分析。
	<ol>
		<li>将每种梯度组分各10 µL与荧光膜探针1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene共同孵育 p- 在96孔黑色板中，于50 µL PBS体积内，加入对甲苯磺酸盐（TMA-DPH），终浓度为1 µg/mL。</li>
		<li>将培养板在33 °C下孵育20分钟。</li>
		<li>在360 nm激发波长和430 nm发射波长下测定荧光。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. MEV的定性分析
<ol>
	<li>进行蛋白质电泳。
	<ol>
		<li>将约 1 µg 的 MEV 样品与 16 µL 样品混合，加入 4 µL 的 5 倍上样缓冲液（10% w/v SDS，10 mM 二硫苏糖醇，20% v/v 甘油，0.2 M Tris-HCl，pH 6.8，0.05% w/v 溴酚蓝），在 85 °C 下加热 5 分钟。</li>
		<li>将样品上样至 10% Tris/甘氨酸 SDS-聚丙烯酰胺凝胶11，在电泳缓冲液（25 mM Tris 碱，190 mM 甘氨酸，0.1% SDS）中以 10 V/cm 的电压电泳，直至蓝色染料前沿迁移至凝胶底部。</li>
		<li>使用超敏蛋白质染色液（材料表）对凝胶进行染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行点印迹（dot blot）。
	<ol>
		<li>取浓度约为 0.5 µg/µL 的 MEV 悬液 2 µL，进行两倍系列稀释后，点样至硝酸纤维素膜上，并按照制造商说明书进行点印迹操作。</li>
		<li>以针对 MEV 制备物免疫小鼠获得的抗血清作为一抗，稀释比例为 1:5,000；以辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠抗体作为二抗，稀释比例为 1:10,000。使用适当的 HRP 底物显影试剂和成像系统检测抗原-抗体复合物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行负染色及电子显微镜观察。
	<ol>
		<li>在室温下，用含 2% 戊二醛的 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液固定 250 µL MEV 样品 2 小时，随后在含 4% 甲醛、1% 戊二醛和 0.1% PBS 的溶液中 4 °C 过夜孵育。</li>
		<li>用 2% 四氧化锇对固定后的样品染色 90 分钟。</li>
		<li>用乙醇逐级脱水样品，并包埋于 Spurr 环氧树脂中。</li>
		<li>在透射电子显微镜下观察 MEV。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li>
<li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li>
<li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li>
<li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Pst%2FSenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778(2018).</li>
<li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731(2017).</li>
<li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li>
<li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Plating+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064(2012).</li>
<li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies.+A+laboratory+manual%22">Antibodies. A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).</li>
<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

已开发出多种用于纯化真核细胞来源外泌体的方法12。相比之下，关于有效纯化细菌来源细胞外囊泡（EVs）的方法报道较少7。高效分离结核分枝杆菌（Mtb）来源的细胞外囊泡（MEVs）需考虑培养这种致病性分枝杆菌所固有的困难。Mtb分裂周期较长（约24小时），且必须在生物安全三级（BSL-3）条件下操作。因此，优化MEV分离方法的效率至关重要。由于分枝杆菌会向培养基中释放糖脂及其他疏水性分子，这些物质易于聚集并污染粗制的MEV样品，因此在进行生化和功能研究之前，对MEVs进行纯化和验证尤为重要。基于先前研究发现Mtb在铁限制条件下可增强MEV的释放，已建立了一种从铁限制培养的分枝杆菌中纯化EV的实验方案。此外，已证实非致病性的M. smegmatis在低铁条件下也会增加EV的释放（数据未显示）。因此，该相同方案也可用于在生物安全二级（BSL-2）条件下纯化该菌的EVs。
该实验步骤的关键环节是低铁培养基的制备。应按照此处所述方法制备该培养基，并将其储存于塑料容器中，而非玻璃容器...

分枝杆菌胞外囊泡（MEVs）是大小为60−300 nm的膜结合纳米颗粒，由快速和缓慢生长的分枝杆菌自然释放1。致病性分枝杆菌释放的MEVs可通过高浓度且受保护形式分泌的免疫活性蛋白、脂质和糖脂，作为与宿主相互作用的一种机制2,3,4。为了表征MEVs并理解其生物发生过程和功能，严格且高效的囊泡纯化与验证方法至关重要。迄今为止，MEVs已从在富铁培养基中培养的分枝杆菌的培养滤液中分离获得1,5,6,7,8。
然而，先前的研究表明，铁限制会显著促进结核分枝杆菌（Mtb）释放囊泡，可能是通过分泌到MEV中的铁载体分枝杆菌素（mycobactin）来捕获铁9。尽管已有从高铁培养基培养的Mtb中分离MEV的方法报道，但尚未见高效获取低铁培养条件下MEV的有效方法。因此，本方法的目标是从低铁培养物中分离、纯化并定量MEV，以便用于生化和功能分析，以及研究分枝杆菌囊泡生成的遗传决定因素。

<table><tbody><tr><td>Amicon 搅拌式超滤池，型号 108</td><td>EMD Milipore</td><td>UFSC40001</td><td>超滤系统</td></tr><tr><td>BD 聚丙烯 225 mL 锥形离心管</td><td>Fisher</td><td>05-538-61</td><td>锥形离心管</td></tr><tr><td>Biomax 100 kDa 截留分子量超滤膜</td><td>EMD Milipore</td><td>PBHK07610</td><td>超滤膜</td></tr><tr><td>Chelex-100 树脂</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2842</td><td>金属螯合树脂</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 琼脂</td><td>BD Difco</td><td>262710</td><td>分枝杆菌琼脂平板</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 肉汤</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>分枝杆菌液体培养基</td></tr><tr><td>硝酸纤维素印迹膜</td><td>GE Healthcare</td><td>10600001</td><td>印迹膜</td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>碘克沙醇</td></tr><tr><td>聚碳酸酯超速离心管 25 mm × 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td>聚碳酸酯超速离心管 25 mm × 89 mm</td></tr><tr><td>聚丙烯薄壁离心管 13 mm × 15 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>聚丙烯薄壁离心管 13 mm × 15 mm</td></tr><tr><td>蛋白定量染料</td><td>BioRad</td><td>5000006</td><td>Bradford 蛋白染色液</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby</td><td>Molecular Probes</td><td>S12000</td><td>超敏蛋白染色剂</td></tr><tr><td>TMA-DPH</td><td>Molecular Probes</td><td>T204</td><td>1-(4-三甲基铵苯基)-6-苯基-1,3,5-己三烯 &lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-甲苯磺酸盐</td></tr><tr><td>真空过滤瓶</td><td>CellPro</td><td>V50022</td><td>过滤装置</td></tr></tbody></table>

分离与表征铁限制条件下分枝杆菌产生的细胞外囊泡

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

分枝杆菌，包括引起人类结核病的病原体结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb），能够自然释放含有免疫活性分子的细胞外囊泡（EVs）。目前对囊泡生成的分子机制、囊泡内容物及其在病原体与宿主相互作用界面的功能等方面的认识仍十分有限。要解决这些问题，需要采用严格的细胞外囊泡分离、纯化和验证流程。先前研究发现，当结核分枝杆菌（M. tuberculosis）暴露于铁限制条件时——这种条件模拟了Mtb在宿主体内的生存环境——囊泡的产生量会增加。本文提供了一套完整且详细的实验方案，用于从缺铁培养的分枝杆菌中分离和纯化细胞外囊泡，并采用定量与定性方法对纯化后的囊泡进行验证。

通过密度梯度差速沉降法对MEV进行纯化（图1，图2）。在所述条件下，MEV主要分离于梯度组分3（F3），对应25%碘克沙醇。该结论基于蛋白质、膜脂的检测、完整MEV的显微观察、纳米颗粒尺寸分布以及与抗囊泡抗血清的阳性反应（图2，图3）。以菌落形成单位（CFUs）归一化的蛋白质和脂质浓度显示，在低铁条件下MEV产量较高铁条件（50 µM FeCl3）下约增加八倍（图3）。尽管仅展示了一次代表性实验的结果，但该结果高度可重复，已通过多次（>10次）MEV分离实验验证。采用本方法从1 L低铁培养物中获得的纯MEV产量约为500 µg蛋白质。
...

Mycobacterium tuberculosis 在低铁条件下会增加胞外囊泡的产生和释放。本研究详细描述了一种建立低铁条件的方案，以及针对铁缺乏条件下释放的分枝杆菌胞外囊泡进行纯化和表征的方法。

分枝杆菌，包括人结核病的致病菌结核分枝杆菌（Mtb），可天然释放细胞外囊泡（EVs）……

该方法允许在严格的低铁条件下培养结核分枝杆菌，并从低铁培养滤液中纯化膜囊泡。由于已知铁限制可刺激膜囊泡的产生，本方案能够获得大量高纯度的膜囊泡，可用于进一步的生物化学或功能分析。当使用非致病性的耻垢分枝杆菌演示该方案时，该方案同样可在生物安全二级（BSL-2）设施中用于致病性的结核分枝杆菌。首先，在塑料容器中将五克磷酸二氢钾、五克L-天冬酰胺、20毫升甘油和两克右旋葡萄糖溶解于900毫升去离子水中，配制一升最小培养基。用5 N氢氧化钠将pH值调节至6.8，并用去离子水定容至一升。然后加入50克金属螯合树脂，使用磁力搅拌子在4摄氏度下轻轻搅拌24小时。第二天，停止搅拌，让树脂沉淀约30分钟。使用带有塑料接收器的22微米滤器单元过滤溶液，以除去残留的树脂并实现灭菌。然后，在最低培养基中添加0.5毫克/升氯化锌、40毫克/升硫酸镁和0.1毫克/升硫酸锰。将一株结核分枝杆菌单菌落接种于2 mL添加了ADN增补剂的分枝杆菌液体培养基中，在37°C条件下振荡培养。当出现可见生长时，取2 mL培养物，在分光光度计上测定其540 nm处的光密度（OD 540）。当 OD 540 达到 0.8 时停止培养，这表明已进入对数生长后期。取 200 微升对数生长后期的培养物，均匀涂布于添加了 0.2 甘油、0.5% 吐温 80 和 ADN 的分枝杆菌琼脂平板上。至少接种五个平板。将培养皿在37摄氏度下孵育。一周后，细菌生长形成融合的菌层，肉眼可见。然后用低铁最低培养基润湿一支无菌棉签。使用该拭子从琼脂平板上采集细菌。将细菌接种于试管中含100毫升低铁最低培养基的液体中。采集足够的细菌以制备OD 540为1的菌悬液。用低铁最低培养基将悬浮液稀释10倍至一升，并分装到两个无菌塑料瓶中。接着，将2毫升培养物转移至5毫升培养管中。加入10微升10%（体积比）的tyloxapol。将培养物在 37 摄氏度下孵育 14 天。将培养物转移至五个 225 毫升的锥形离心管中，在 20 摄氏度下以 2,850 × g 离心 7 分钟。用 50 毫升移液管收集培养上清液，并通过 0.22 微米滤膜过滤除菌。为了分离MEVs，将培养滤液转移至置于4°C的搅拌式超滤系统中，通过100千道尔顿截留分子量的滤膜在低于50 PSI的压力下进行过滤浓缩。随后，在4°C条件下，以15,000 × g离心15分钟，将浓缩后的培养滤液离心，并将上清液收集至聚碳酸酯超速离心管中。接着，在4°C条件下，以100,000 × g离心2小时。随后，弃去上清液，并通过轻柔吹打，将膜性沉淀物重悬于总共一毫升的无菌 PBS 中。取 0.5 毫升沉淀悬液，与 1.5 毫升 60% 碘克沙醇溶液混合，置于聚丙烯薄壁超速离心管底部。依次在该 MVE 碘克沙醇 45% 悬液上方覆盖一毫升 40%、35%、30%、25% 和 20% 碘克沙醇溶液，以及一毫升 PBS 于最上层。在4°C条件下，以100,000 × g离心18小时。随后，使用1毫升Hamilton注射器从顶部开始收集1毫升密度梯度组分。将每份收集的组分用PBS稀释至20毫升，并在4°C条件下以100,000 × g离心2小时。去除上清液，并用0.5毫升PBS重悬。将试管置于4摄氏度保存。为进行膜脂分析，将每份梯度组分各取10微升，加入终浓度为每毫升1微克的荧光膜探针TMA-DPH，在96孔黑色板的每个孔中用50微升PBS配制混合液。将培养板在 33 摄氏度下孵育 20 分钟。以 360 纳米为激发波长、430 纳米为发射波长测定荧光。在本方案中，MEV 通过密度梯度差速沉降法进行纯化。在所述条件下，MEV 主要分离于梯度组分三，对应 25% 碘克沙醇。点印迹分析显示，囊泡相关蛋白在组分三中富集。负染色法也证实了组分三中存在 MEV，纳米颗粒分析显示 MEV 的大小约为 100 纳米。将蛋白质和脂质浓度归一化至菌落形成单位后，结果显示，在低铁条件下，MEV 产量相较于高铁条件约增加八倍。点印迹分析显示，与铁充足条件下的结核分枝杆菌培养物相比，铁限制条件下结核分枝杆菌培养物的密度梯度组分中 MEV 相关标志物信号更强。请遵循最低限度培养基的制备说明，以确保铁限制条件，并防止膜囊泡被脂蛋白聚集体污染。通过此方法纯化的分枝杆菌膜囊泡可用于生化表征和功能分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

铁限分枝杆菌产生的细胞外囊泡的分离和特征

来源：Gupta, S., et al. 铁限制条件下分枝杆菌产生的细胞外囊泡的分离与表征. J. Vis. Exp. (2019)本视频演示了培养的步骤 结核分枝杆菌...

在铁限制条件下培养结核分枝杆菌

来源：Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. 铁限制条件下分枝杆菌产生细胞外囊泡的分离与表征。 J. Vis. Exp. (2019)本视频展示了从在模拟宿主环境的限铁条件下培养的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

从Mycobacterium tuberculosis中分离含铁载体的细胞外囊泡

来源：Watson, D. C., et.al. 大肠杆菌及其他细菌来源细胞外囊泡的可扩展分离与纯化. J. Vis. Exp.

细菌外膜来源的胞外囊泡的分离与富集

本视频介绍了一种基于尺寸排阻色谱法（SEC）的方法，用于分离源自脑免疫细胞——小胶质细胞的细胞外囊泡（EVs）。这些细胞外囊泡作为分子载体，可递送调节免疫反应的介质。因此，分离得到的细胞外囊泡可用于构建体外模型，以研究神经免疫反应过程中小胶质细胞与神经元之间的相互作用。...

基于SEC的分离小胶质细胞来源细胞外囊泡技术：从小胶质细胞条件培养基中分离细胞外囊泡的方法

关键词：SEC，小胶质细胞，细胞外囊泡，条件培养基，分离方法

本视频演示了利用尺寸排阻色谱法（SEC）从结核分枝杆菌（Mycobacterium...

一种用于纯化分枝杆菌胞外囊泡的尺寸排阻色谱技术

血液中存在的细胞外囊泡被认为可作为多种疾病的新型生物标志物。本文介绍了一种从外周血样本中分离大型质膜来源微囊泡的实验方案，并通过常规流式细胞术和蛋白质印迹法对其进行后续分析。...

外周血微囊泡的分离与表征

本方案详细描述了从蓝细菌培养物中分离、浓缩和表征细胞外囊泡的方法。同时讨论了从不同规模培养物中纯化囊泡的技术路径、各方法之间的权衡，以及处理野外样品时的注意事项。...

蓝细菌胞外囊泡的分离与表征

该方案描述了尺寸排阻色谱法，一种简便且可重复的富集技术 结核分枝杆菌 来自培养上清液的细胞外囊泡...

Mycobacterium tuberculosis 通过尺寸排阻色谱法富集细胞外囊泡

本方案提供了在从细胞培养上清液中分离细胞外囊泡时如何避免内毒素污染以及如何对其进行正确评估的指导。...

低内毒素含量的癌细胞系来源细胞外囊泡的分离

本方案详细描述了从无菌培养的分枝杆菌中富集天然的分枝杆菌胞外囊泡（mEVs）的方法 Mycobacterium smegmatis （耻垢分枝杆菌，Msm）以及如何设计并富集含有mCherry（一种红色荧光报告蛋白）的重组MsmEVs。最后，通过富集含有EsxA蛋白的MsmEVs验证了这一新方法。...

分枝杆菌天然及重组细胞外囊泡的富集

本方案描述了从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡的方法，该方法结合酶消化和尺寸排阻色谱技术，能够从结构复杂且产量较低的组织中可重复地回收富含囊泡的组分，用于后续分子分析。...

通过尺寸排阻色谱法从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡

学习在低铁条件下培养结核分枝杆菌并分离纯化细胞外囊泡的方法。该方案可获得高纯度膜囊泡，用于生化功能分析，有助于研究细菌致病机制。

分离与表征铁限制条件下分枝杆菌产生的细胞外囊泡

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