铁限分枝杆菌产生的细胞外囊泡的分离和特征
2019年10月31日
结核分枝杆菌显示，由于低铁条件，细胞外囊泡的产量增加并释放。这项工作详细介绍了产生低铁条件的协议，以及针对缺铁而释放的分菌外囊泡的纯化和表征方法。
该方法允许在严格的低铁条件下培养结核分枝杆菌，从低铁培养物中净化膜囊泡。由于铁限制已知可以刺激膜囊泡的产生，因此该协议产生高丰度的纯膜囊泡，可用于进一步生化或功能测定。当我们演示使用分枝杆菌，非病毒菌株的协议，该协议可以遵循在BSL-2设施使用结核分枝杆菌，致命的菌株。
首先，在塑料容器中溶解5克磷酸磷酸盐、5克L-芦笋、20毫升甘油和2克葡萄糖，在900毫升的去维化水中，准备1升最小介质。使用五个正常氢氧化钠将 pH 调节到 6.8，用去离子水将体积调节为 1 升。然后加入50克金属溷合树脂，在4摄氏度下使用磁搅拌棒轻轻搅拌24小时。
第二天，停止搅拌，让树脂沉淀物约30分钟。通过 22 微米过滤单元（带塑料接收器）进行过滤，对溶液中剩余的树脂进行消毒和去除。现在，补充最低介质每升氯化锌0.5毫克，每升硫酸镁40毫克，每升硫酸锰0.1毫克。
在两毫升分枝杆菌中接种单一聚落的分枝杆菌，辅以 ADN 浓缩。在37摄氏度下与搅拌孵育。当有可见的生长时，提取培养的两毫升，并在分光光度计上测量OD 540。
当 OD 540 达到 0.8 时停止孵育，这表示对数阶段较晚。将 200 微升的晚期对数培养剂传播到分枝杆菌油板上，并辅以 0.2 甘油、0.5%Tween 80 和 ADN。至少接种五个板。
在37摄氏度下孵育板。一周后，细菌的生长是可见的汇合层。然后在低铁最小介质中湿润无菌棉签。
使用此拭子从阿加板中收集细菌。在管中用100毫升的低铁最小介质中接种细菌。收集足够的细菌，准备一个悬挂与OD 540之一。
用低铁最小介质将悬浮液稀释10倍至1升，并分成两个无菌塑料瓶。接下来，将培养的两毫升转移到五毫升培养管。按体积tyloxapol添加10微升10%体积。
在37摄氏度下孵育培养14天。将培养器转移到五个 225 毫升锥形离心管和离心机，温度为 2，850 次 g，在 20 摄氏度下为 7 分钟。用 50 毫升移液器收集培养物，并通过 0.22 微米过滤器进行过滤器消毒。
为了分离 MEV，将培养物过滤转移到放置在 4 摄氏度的搅拌细胞超滤系统中，并通过 100 千吨截止膜以低于 50 PSI 的压力过滤浓缩物。然后在4摄氏度下将浓度培养物以15，000倍g的过滤器离心15分钟，并在聚碳酸酯超离心管中收集上流液。在摄氏4度下将上一代在10万次g下离心两小时。
之后，通过温和的移液，去除上清液，将无菌颗粒重新在一毫升无菌PBS中。在聚丙烯薄壁超离心管底部将 0.5 毫升颗粒悬浮液与 1.5 毫升 60%碘异醇溶液混合。覆盖此 MVE 碘沙醇 45%悬浮液与一毫升 40%35%30%25%和 20% 碘桑醇溶液和一毫升 PBS 的顶部。
在4摄氏度下以10万次g的离心机，18小时。接下来，使用一毫升汉密尔顿注射器收集从顶部开始的一毫升密度梯度分数。用PBS将每个收集的分数稀释到20毫升，在4摄氏度下以10万倍g的离心机稀释两小时。
取出0.5毫升PBS中的上上液和重新暂停。将管子存放在摄氏四度。为了进行膜脂质分析，将每个梯度分数的10微升与荧光膜探针TMA-DPH结合，最终浓度为每毫升1微克，在96孔黑板的每个孔中每毫升PBS中含量为1微克。
在33摄氏度下孵育板20分钟。测量荧光在360纳米的激发和430纳米的排放。在该协议中，MEV通过密度梯度的差分沉积进行纯化。
在所述条件下，MEV主要以梯度分数三分离，对应于25%的碘桑醇。囊泡相关蛋白质集中在点印分析显示的分数三中。负染色也证实了第三部分中存在 MEV，纳米粒子分析表明，MEV的大小约为 100 纳米。
蛋白质和脂质浓度正常化为菌落形成单位，相对于高铁条件，低铁的 MEV 产量增加了约八倍。点印迹分析表明，与铁足够的 MTB 培养物不同，来自铁有限 MTB 培养物的 MEV 相关标记的强信号。按照说明制备最小介质，以确保铁有限的条件，并防止膜囊泡与脂蛋白聚合物污染。
以这种方式纯化的分枝杆菌囊泡可用于生化特性和功能分析。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究提出了一种在低铁条件下培养结核分枝杆菌的协议，这种条件能够增强细胞外囊泡的产生。本文详细介绍了这些囊泡的纯化和表征方法，为其潜在的生化应用提供了洞见。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 细胞生物学
- 生物化学
背景
- 结核分枝杆菌被认为对铁限制有反应。
- 细胞外囊泡在细菌通讯和发病机制中起作用。
- 了解囊泡产生可以帮助开发治疗策略。
- 低铁条件刺激膜囊泡的产生。
研究目的
- 建立在低铁条件下培养结核分枝杆菌的可靠方法。
- 纯化并表征因铁缺乏而产生的细胞外囊泡。
- 提供一个可以在BSL-2设施中使用的协议。
使用的方法
- 准备含特定成分的最低培养基。
- 调整pH值并添加金属螯合树脂。
- 在受控的低铁条件下培养结核分枝杆菌。
- 从培养滤液中纯化膜囊泡。
主要结果
- 获得了大量纯净的膜囊泡。
- 使用结核分枝杆菌进行了协议的演示。
- 结果表明，铁限制有效地刺激了囊泡的产生。
- 纯化的囊泡可用于进一步的生化分析。
结论
- 建立的协议对于研究结核分枝杆菌中的细胞外囊泡是有效的。
- 了解囊泡的产生可以增强对细菌发病机制的认知。
- 这种方法可以促进未来对分枝杆菌生物学的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables the isolation of extracellular vesicles from iron-limited mycobacteria, providing a scalable source of pathogen-derived biomolecules for target validation and assay development. By enhancing vesicle yield under host-relevant conditions, it supports mechanistic de-risking of tuberculosis therapeutic candidates through defined pathogen-host interface components. The method delivers standardized, quantifiable vesicle preparations suitable for downstream screening and biomarker discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of pathogen-derived molecular cargo for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides purified vesicles from iron-limited cultures to validate target engagement in disease-relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized vesicle preparations for developing immunoassays or functional readouts.
- Operational Value: Supports assay reproducibility through consistent vesicle yield and size distribution under controlled iron restriction.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of vesicle-host interactions relevant to pathogenesis and immune modulation.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of vesicle biomarkers across infection models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows by supplying pathogen-derived extracellular vesicles for target validation and assay optimization prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on vesicle-associated virulence factors and immunomodulatory molecules.
- Screening: Enables preparation of standardized vesicle inputs for high-throughput binding or functional assays.
- Analytics: Provides quantifiable outputs including vesicle size (~100 nm), protein/lipid concentration, and density gradient fractionation data.
- Translational Research: Connects vesicle composition to disease-relevant iron-limited conditions mimicking the host environment.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable platform for producing mycobacterial vesicles across multiple projects and strains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by using vesicles produced under physiologically relevant iron stress.
- Operational Value: Delivers eight-fold higher vesicle yield under low iron versus high iron conditions, improving material efficiency.
- Strategic Value: Reduces biological de-risking timelines by providing standardized pathogen-derived inputs for early assay development.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions based on vesicle-associated target engagement in iron-limited models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mycobacterial culture handling and BSL-2 containment for virulent strains.
- Depends on access to ultrafiltration, ultracentrifugation, and iodixanol gradient preparation equipment.
- Necessitates standardization of iron chelation and metal supplementation across production batches.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to other bacterial species or growth conditions.
- Includes practical limitations such as the 14-day incubation period and multi-step purification timeline.
