Name: 在重复性扩散创伤性脑损伤小鼠模型中诱导创伤后癫痫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 了解如何通过改良落重法在小鼠模型中诱导轻度弥漫性创伤性脑损伤，并学习脑电图数据采集技术以研究创伤后癫痫的发病机制。该模型有助于开发生物标志物和治疗策略。

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本研究由美国国立卫生研究院国家神经疾病与卒中研究所（R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/美国）以及美国国防部（DoD）通过心理卫生与创伤性脑损伤研究计划（Award No. W81XWH-15-2-0069）向CURE提供的资助支持。特此感谢Ivan Zuidhoek对稿件的校对工作。

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作者无任何利益冲突需要披露。

与诱导局灶性损伤或局灶性与弥漫性损伤结合的 CCI 和 FPI 模型不同，本方案中描述的重复性弥漫性创伤性脑损伤模型可在无局灶性脑损伤的情况下诱导弥漫性损伤，且无需进行头皮或颅骨开窗，从而避免了相关的炎症反应。该模型无需实施颅骨切除术的另一优势在于，不仅可植入电极用于慢性连续脑电图（EEG）记录，还可制备减薄颅骨的颅窗，以便在创伤性脑损伤（TBI）前、损伤后即刻以及损伤后数天、数周甚至数月内，对动物进行长期活体双光子成像，如 Shandra 和 Robel 201913 所述。
无论选择哪种动物模型，所采用的数据采集方法都是任何成功且全面研究的关键要素。在创伤后癫痫的啮齿类动物模型中，癫痫发作频率较低14，平均每天仅发生0.3−0.4次发作9,15，且首次发作前的潜伏期可能在初始创伤性脑损伤（TBI）手术后持续数天、数周甚至数月。最后，与非创伤性模型相比，后者通常在较短时...

每年，全球约有6000万人受到创伤性脑损伤（TBI）的影响。受伤个体发展为癫痫的风险更高，且癫痫可能在初始损伤数年后才出现。尽管严重的TBI与更高的癫痫风险相关，但即使是轻度TBI也会增加个体罹患癫痫的可能性1,2,3,4。所有TBI均可分为局灶性、弥漫性，或两者的组合。许多（即使不是全部）TBI中均存在弥漫性脑损伤，这是由于加速-减速和旋转力导致不同密度的脑组织相互剪切所致。根据定义，弥漫性损伤仅在轻度/脑震荡性非穿透性脑损伤中孤立发生，此时在计算机断层扫描（CT）中无法观察到脑部病灶5。
目前，对已发生或有风险发展为创伤后癫痫（PTE）患者的管理存在两个关键问题。第一个问题是，一旦PTE发作，其癫痫发作对现有的抗癫痫药物（AEDs）具有耐药性6。第二个问题是，AEDs在阻止癫痫发生方面同样无效，且目前尚无有效的替代治疗策略。为弥补这一不足并寻找更优的治疗靶点和候选疗法，有必要深入探究PTE根本性的细胞与分子机制6。
创伤后癫痫的一个显著特征是初始创伤事件与自发性、无诱因、反复发作的癫痫发作之间存在一段潜伏期。这一时间窗口内发生的事件自然成为研究人员关注的焦点，因为该时间段可能为完全治疗和预防创伤后癫痫提供机会。此类研究最常使用动物模型，因为动物模型具有多种明显优势，其中最重要的一点是，对人类患者进行持续监测在如此可能漫长的期间内既不切实际又成本高昂。此外，癫痫发生根本性的细胞和分子机制只能通过动物模型进行探索。
与通过化学致痫剂或电刺激（急性、慢性或点燃法）等生理相关性较低的方法在创伤性脑损伤（TBI）后诱导癫痫发作的模型相比，具有自发性创伤后癫痫发作和癫痫的动物模型更受青睐。自发性创伤后癫痫发作模型可用于研究TBI如何改变健康的大脑网络，从而导致癫痫发生。而在TBI后施加额外刺激的研究则用于评估TBI暴露如何降低癫痫发作阈值并影响对癫痫发作的易感性。通过化学或电刺激诱导癫痫发作的动物模型的优势在于可用于检验对抗癫痫药物（AEDs）耐药的具体机制，以及现有和新型AEDs的疗效。然而，由于以下原因，这些数据在人类中的相关性和可转化性可能尚不明确7：1）癫痫发作机制可能与单纯TBI诱导的机制不同；2）并非所有这些模型都会产生自发性癫痫发作7；3）致痫剂本身、给药所需的套管，或刺激电极植入深部结构（如海马或杏仁核）所造成的损伤，本身就可能导致癫痫易感性升高，甚至出现海马癫痫样场电位7。此外，某些致痫剂（如红藻氨酸）会直接导致海马损伤和硬化，这在弥散性TBI后并不典型。
直到最近，仅有两种创伤后癫痫的动物模型：控制性皮层冲击（CCI，局灶性）或液体冲击损伤（FPI，局灶性和弥漫性）8。这两种模型均会在啮齿类动物中引起显著的局灶性损伤，伴随组织丢失、出血和胶质增生8。这些模型模拟了由显著局灶性损伤引发的创伤后癫痫。最近一项研究表明，重复（3次）弥漫性创伤性脑损伤足以诱导小鼠出现自发性癫痫发作和癫痫，即使不存在局灶性损伤9，从而增加了第三种经证实可产生自发性复发性癫痫发作的啮齿类PTE模型。这一新模型模拟了弥漫性创伤性脑损伤所引起的细胞和分子变化，更真实地代表了人类中轻度、震荡性脑损伤的人群。在此模型中，癫痫发作前存在三周或更长的潜伏期，并随后出现晚期的自发性复发性癫痫发作，这为研究创伤后癫痫发生的根本机制、在癫痫发作出现后测试预防策略和新型治疗候选药物的疗效提供了可能，同时也为开发创伤后癫痫发生的生物标志物提供了潜力，因为约有一半的动物会发展为创伤后癫痫。
选择用于创伤后癫痫研究的动物模型取决于科学问题、所研究的脑损伤类型，以及用于确定潜在细胞和分子机制的研究工具。最终，任何创伤后癫痫模型都必须证明在创伤性脑损伤（TBI）后出现自发性癫痫发作，并且在部分TBI动物中存在一个初始潜伏期，因为并非所有遭受TBI的患者都会发展为癫痫。为此，本实验方案采用同步视频采集的脑电图（EEG）技术。理解数据采集硬件及方法背后的技术细节对于准确解读数据至关重要。关键的硬件因素包括记录系统的类型、电极类型（螺钉或导线电极）及其材质、同步视频采集系统（作为EEG系统的一部分或第三方系统），以及计算机系统的性能参数。根据研究目标、感兴趣的EEG事件、后续分析方法以及数据存储的可持续性，在任何系统中设置适当的采集参数都是至关重要的。最后，必须考虑电极配置（导联方式）的方法，因为每种配置都有其优缺点，并会影响数据的解读。
本方案详细介绍了如何使用改良的Marmarou落锤模型10,11在小鼠中诱导弥漫性损伤，从而产生自发性、非诱发性、反复发作的癫痫发作，并描述了通过单极、双极或混合导联方式获取单通道和多通道连续同步视频脑电图（EEG）的手术方法。

<table><tbody><tr><td>0.10&quot; 螺钉</td><td>Pinnacle Technology Inc., KS, USA</td><td>8209</td><td>0.10 英寸长，不锈钢材质</td></tr><tr><td>0.10&quot; 螺钉</td><td>Pinnacle Technology Inc., KS, USA</td><td>8403</td><td>0.10 英寸长，带预焊导线引线</td></tr><tr><td>0.12&quot; 螺钉</td><td>Pinnacle Technology Inc., KS, USA</td><td>8212</td><td>0.12 英寸长，不锈钢材质</td></tr><tr><td>1EEG 头部连接器</td><td>Invitro1 (Plastics One 的子公司), VA, USA</td><td>MS333/8-A/SPC</td><td>3 根独立的聚四氟乙烯绝缘铂铱合金导线电极（可绞合或非绞合，直径 0.005 英寸），延伸至螺纹塑料基座下方</td></tr><tr><td>2EEG/1EMG 头部连接器</td><td>Pinnacle Technology Inc., KS, USA</td><td>8201</td><td>2 通道 EEG / 1 通道 EMG</td></tr><tr><td>3% 过氧化氢</td><td></td><td></td><td>药房</td></tr><tr><td>3EEG 头部连接器</td><td>Pinnacle Technology Inc., KS, USA</td><td>8235-SM-C</td><td>定制 6 针连接器，用于 3 通道 EEG</td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA</td><td>060969</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA</td><td>060969</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>Harlan/Envigo Laboratories Inc</td><td></td><td>雄性，12–16 周龄</td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td></td><td>雄性，12–16 周龄</td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA</td><td>026357</td><td>注：仅在同日进行立体定位电极植入时，在体重跌落过程中添加该药物</td></tr><tr><td>氯己定消毒剂</td><td></td><td></td><td>药房</td></tr><tr><td>牙科水泥与溶剂套装</td><td>Stoelting Co., USA</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>钻机</td><td>Foredom</td><td>HP4-917</td><td></td></tr><tr><td>钻头</td><td>Meisinger USA, LLC, USA</td><td>HM1-005-HP</td><td>0.5 mm，圆形，1/4，钢制</td></tr><tr><td>干式灭菌器</td><td>Cellpoint Scientific, USA</td><td></td><td>Germinator 500</td></tr><tr><td>EEG 系统 1</td><td>Biopac Systems, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EEG 系统 2</td><td>Pinnacle Technology Inc., KS, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇 &amp;ge;70%</td><td>VWR, USA</td><td>71001-652</td><td>KOPTEC USP，生物技术级（140 Proof）</td></tr><tr><td>眼膏</td><td>Pro Labs Ltd, USA</td><td></td><td>可在普通线上商店和药房购买的 Puralube Vet Ointment 无菌眼用润滑剂</td></tr><tr><td>吸入麻醉用氟利索液体</td><td>MWI Veterinary Supply Co., USA</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>脱毛产品</td><td>Church &amp;amp; Dwight Co., Inc., USA</td><td></td><td>Nair 乳霜</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>MWI Veterinary Supply Co., USA</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘外科溶液</td><td>Purdue Products, USA</td><td>004677</td><td>贝塔碘</td></tr><tr><td>Rimadyl/卡洛芬</td><td>Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA</td><td>026357</td><td></td></tr><tr><td>焊料</td><td></td><td></td><td>五金店</td></tr><tr><td>电烙铁</td><td>Weller, USA</td><td>WP35</td><td>ST7 型烙铁头，0.8 mm</td></tr><tr><td>不锈钢圆盘</td><td></td><td></td><td>定制制作</td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布垫</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>22362178</td><td></td></tr><tr><td>无菌带衬垫吸水毛巾垫</td><td>Cardinal Health, USA</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>组织粘合剂</td><td>3M Animal Care Products, USA</td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

诱导重复性弥散性创伤性脑损伤小鼠模型中的创伤后癫痫

Inducing Post-Traumatic Epilepsy in a Mouse Model of Repetitive Diffuse Traumatic Brain Injury

创伤性脑损伤（TBI）是获得性癫痫的主要病因之一。TBI 可导致局灶性或弥漫性脑损伤。局灶性损伤由直接的机械力引起，有时会穿透颅骨，直接在脑组织中形成病灶。在脑部影像学检查中，这些病灶表现为挫伤、裂伤和出血区域。局灶性病灶可诱导神经元死亡和胶质瘢痕形成，存在于所有遭受 TBI 人群的 20%−25% 中。然而，在大多数 TBI 病例中，损伤是由加速-减速力及其继发的组织剪切力所致，从而引起非局灶性的弥漫性损伤。一部分 TBI 患者在经历数月甚至数年的潜伏期后，会发展为创伤后癫痫（PTE）。目前尚无法预测哪些患者将发展为 PTE，且 PTE 患者的癫痫发作难以控制，因此亟需进一步研究。直到最近，该领域仅有两种经过验证可产生自发性创伤后癫痫发作的动物/啮齿类模型，这两种模型均表现为伴有大脑皮层甚至有时皮层下结构大面积组织丢失的显著局灶性病灶。与这些模型不同，研究发现，采用改良的落锤法诱导的弥漫性 TBI 足以引发自发性惊厥性和非惊厥性癫痫发作，即使在无局灶性病灶或组织丢失的情况下亦可发生。与人类获得性创伤后癫痫患者相似，该模型在损伤后存在一段潜伏期，随后才出现癫痫发作。在本实验方案中，将向科研界提供一种新的创伤后癫痫模型，详细阐述如何诱导无病灶的弥漫性 TBI，并在数月时间内进行持续的长期视频-脑电图动物监测。本方案将详细说明动物操作、落锤操作、两种信号采集系统的电极植入方法，以及在手术、术后监测和数据采集各步骤中常遇到的技术挑战。

此处所述方案介绍了一种使用小鼠重复性弥散性创伤性脑损伤（TBI）模型，单独诱导弥散性损伤（例如，在无局灶性病灶的情况下）的方法。图1). 图1A 展示了重量下落装置及其组件（图1A，a1−a5用于在此模型中诱导TBI的关键步骤及操作过程中的关键环节（图1B，b1−b5).
该模型的特点包括：由于创伤性脑损伤（TBI）所致的脑部无局灶性病灶、意识丧失、高存活率以及迟发性癫痫发作的出现（&#62;创伤性脑损伤（TBI）后1周，部分TBI小鼠在经历至少三周的潜伏期后出现自发性、无诱因的反复发作性癫痫。
本方案详细演示了建立无菌手术区域的步骤（图2</str...

本系统性实验方案描述了一种新的重复性轻度创伤性脑损伤后创伤后癫痫的动物模型。第一部分详细介绍了使用改良的重物坠落模型诱导创伤性脑损伤的操作步骤。第二部分提供了用于单通道和多通道脑电图数据采集系统的外科手术方法指导。

创伤性脑损伤（TBI）是获得性癫痫的主要病因之一。TBI 可导致局灶性或弥漫性脑损伤。局灶性损伤是由于……

本方案首次详细描述了一种由轻度创伤性脑损伤诱导的创伤后癫痫小鼠模型。采用轻度弥散性创伤性脑损伤模型，可模拟人类创伤性脑损伤病理的重要特征，因为后者几乎总是包含弥散性成分。为了开发生物标志物和治疗方法，有必要利用能够恰当再现人类病理特征的动物模型开展研究。我们的创伤性脑损伤模型还有助于深入了解轻度创伤性脑损伤或脑震荡后导致脑功能障碍的机制。在确认小鼠无痛觉反射反应后，将小鼠置于泡沫垫上，并将其头部置于重物坠落装置下方。将一个直径1.3厘米、厚1毫米、重880毫克的平头不锈钢圆片置于动物头部正中，位置介于两眼与两耳之间。移除重量下落管中的插销，使100克重物杆从50厘米高度自由下落。为对照组小鼠诱导假手术损伤时，需将重物杆从管中取出，以防止下落过程中插销意外释放。完成重物下落损伤诱导后，将动物仰卧置于加热垫上，加热垫表面覆盖无菌聚乙烯衬里吸水毛巾，并持续监测直至动物完全恢复卧姿。然后将小鼠放入一个干净的笼子中，笼子预先放置在加热垫上预热，并提供恢复凝胶和几块湿润的饲料，持续 45 分钟。为准备脑电图电极植入的手术区域，将温度传感器置于加热垫上，并将重新麻醉的脑损伤小鼠放置在立体定位仪加热垫上的无菌洞巾中。用耳杆固定头部后，为动物的眼睛涂抹润滑眼膏，并使用脱毛膏去除头皮上的毛发。用聚维酮碘外科消毒液和70%乙醇，以圆形擦拭方式交替擦拭暴露的皮肤，每种溶液各擦拭20秒，共三次进行消毒。去除头皮后，在切开的皮肤边缘使用小型止血钳以扩大暴露区域。接下来，用手术刀轻轻去除骨膜，并用过氧化氢擦拭颅骨。当颅骨清除组织后呈现白色外观时，使用无菌纱布或棉签将骨面擦干。进行电极植入时，使用高速钻机配合直径0.5毫米的圆形钢制钻头，以每分钟5,000至6,000转的速度钻出六个孔，用于放置螺钉电极。所有孔钻完后，将六个螺钉电极置入钻孔中，并将半勺牙科水泥粉末与数滴溶剂混合。使用刮刀搅拌，直至牙科水泥混合物变得微黏但可塑，并具有足够的硬度，以便在放置于动物颅骨上时能够被充分压实。将水泥涂抹在整个暴露的颅骨表面以及每个螺钉电极上。一到两分钟后，打开电烙铁，并将三个脑电图头帽固定在立体定位仪的臂架上。将头帽放置在颅骨上方，使六根导线引线的位置与每个螺钉电极的导线引线位置相对应。降低装置，使其腹侧部分平稳地接触牙科水泥。将每个螺钉电极的导线与头帽上对应的导线引线相互绞合，对每对绞合的导线进行焊接以确保信号传导良好，并使用剪刀剪去多余的导线。将每对焊接好的导线引线弯曲固定在头帽上。当所有导线对均弯曲到位后，用新鲜的牙科水泥覆盖所有导线，仅暴露头帽的黑色部分。松开夹住皮瓣的止血钳，并在植入物周围涂抹氯己定消毒剂，以防止感染。然后将动物从装置转移到天平上，测量其体重，作为后续监测的参考值，再将动物放入一个干净的笼子中，并置于带有监测设备、恢复凝胶和几块湿润饲料的温暖加热垫上。本图显示的是，在多次重物坠落致创伤性脑损伤后第97天，使用本视频方案所示的三电极脑电图头帽装置记录到的小鼠自发性癫痫发作。此处显示的是，在多次重物坠落致创伤性脑损伤后第65天，记录到的一次小鼠非惊厥性电图癫痫发作。本图展示了小鼠在反复坠重法诱导的创伤性脑损伤后第23天，使用单通道脑电图头戴装置记录到的一次自发性癫痫发作。一次典型癫痫发作的频谱功率显示，其最高能量密度出现在10至40赫兹范围内，峰值位于15赫兹。本方案展示了动物在反复坠重法诱导的创伤性脑损伤后癫痫发作的时间进程，揭示了部分动物出现癫痫发作簇集的现象，并强调了获取连续而非间歇性记录的重要性。钢盘的准确定位、螺钉电极的精细植入以及导线引线的小心焊接，对于成功进行长期实验均至关重要。在脑电图监测后，可根据是否出现癫痫发作，将脑损伤动物分为不同组别，进而分析其细胞、分子和生理学差异。将创伤后癫痫动物与虽有创伤性脑损伤但未发生癫痫发作的动物进行区分，对于干预措施和生物标志物的开发具有重要意义。

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Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

在重复性扩散创伤性脑损伤小鼠模型中诱导创伤后癫痫

本视频演示了在小鼠模型中诱导创伤性脑损伤（TBI）的操作步骤。将一只麻醉后暴露颅骨的小鼠置于操作台，通过颅骨开窗，使用撞击装置诱导可控的皮层损伤。该损伤可破坏脑组织，导致认知功能障碍和运动协调能力受损。...

使用撞击器设备建立小鼠创伤性脑损伤模型

来源：Shandra, O. 等，在重复性弥散性创伤性脑损伤小鼠模型中诱导创伤后癫痫。J. Vis. Exp.

通过重物坠落致伤法在小鼠模型中诱导创伤后癫痫发作的技术

来源：Yang, Z., 等. 小鼠重复性脑震荡损伤模型. J. Vis. Exp.

在小鼠模型中模拟重复性脑震荡损伤

来源：Macheda, T.，等。小鼠轻度创伤性脑损伤的电磁控制闭合式头部模型。J. Vis. Exp.

小鼠模型中轻度创伤性脑损伤的诱导

脑震荡是创伤性脑损伤中最常见的类型。因此，一种可重复的动物脑震荡模型，若能复制患者损伤的重要特征，则可能为以严谨、可控且高效的方式研究脑震荡提供有效手段。...

小鼠重复性脑震荡损伤模型

运动员每年会遭受数百次轻度创伤性脑损伤（mTBI）或脑震荡；然而，这些损伤对大脑所造成的影响尚不明确。因此，建立一种能够稳定重现临床相关症状的单次及重复性mTBI动物模型，将有助于推动对轻度创伤性脑损伤和脑震荡的研究进展。...

单次与重复性轻度创伤性脑损伤的小鼠模型

神经递质改变是脑震荡后发生的神经功能障碍机制，并可能导致有时灾难性的长期后果。该大鼠模型结合了可实现活体神经递质定量的微透析技术，以及通过对头颈部施加快速加速和减速的落重技术，后者是人类颅脑创伤的重要因素。...

一种结合力与旋转的新型可转化脑震荡大鼠模型及活体脑部微透析技术

本文介绍了一种在成年雄性Wistar大鼠中使用侧向液体打击损伤（FPI）模型诱导重度创伤性脑损伤（TBI）的实验方案。同时，我们还展示了如何利用无线遥测系统进行连续的视频脑电图（video-EEG）记录，并监测符合创伤后癫痫发生特征的癫痫样放电活动。...

使用无线视频脑电图系统监测侧向液体打击致创伤性脑损伤后癫痫样放电

本方案介绍了一种通过闭合性头部损伤（CHI）方法诱导的重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）小鼠改良模型。该方法采用颅骨变薄窗口结合液体打击技术，可减少因脑膜暴露所引起的常见炎症反应，同时提高了在啮齿类动物中建立rmTBI模型的可重复性和准确性。...

改良的小鼠重复性轻度创伤性脑损伤模型结合颅骨变薄窗与液体打击技术

小鼠模型在行为神经科学研究中日益受到关注。随着模型的发展，开发针对小鼠的敏感行为检测方法变得尤为重要。本实验方案描述了“意大利面矩阵取物任务”（Pasta Matrix Reaching...

感觉运动皮层损伤后小鼠缺血性卒中模型中的代偿性肢体使用及运动技能学习的行为评估

了解如何通过改良落重法在小鼠模型中诱导轻度弥漫性创伤性脑损伤，并学习脑电图数据采集技术以研究创伤后癫痫的发病机制。该模型有助于开发生物标志物和治疗策略。

诱导重复性弥散性创伤性脑损伤小鼠模型中的创伤后癫痫

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