Name: 患者衍生胰腺腺腺腺腺癌有机体模型的分离和特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 了解从胰腺导管腺癌患者样本中分离和培养类器官的方法，用于肿瘤异质性研究和药物敏感性测试。该技术可快速建立体外模型，助力个性化治疗策略开发。

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我们感谢加州大学圣地亚哥分校莫尔斯癌症中心生物样本库与组织技术共享资源、Lowy 实验室成员以及加州大学圣地亚哥分校外科系外科肿瘤学部的支持。AML 得到了美国国立卫生研究院（NIH）CA155620 项目、SU2C-CRUK-Lustgarten 基金会胰腺癌梦想团队奖（SU2C-AACR-DT-20-16）以及胰腺癌治愈基金捐赠者的慷慨资助。

所有用于研究的人体组织采集均经本机构审查委员会（IRB）审核并批准。以下所有实验步骤均在哺乳动物细胞培养实验室环境中，于无菌条件下进行。
1. 培养基制备
<ol>
	<li>条件培养基的制备。 
	注意：人胰腺类器官培养基需要丰富的生长因子和营养物质，并需添加条件培养基以提供足够的生长刺激，促进类器官扩增。以下所述的两种条件培养基均来自 commercially available 细胞系（参见材料表）。有关完整的实验方案和材料信息，请参考生产商的官方网站。
	<ol>
		<li>根据生产商的实验方案制备 R-spondin1 条件培养基。
		<ol>
			<li>首先，在含有丰富血清（10%）的条件下，使用适当的抗生素（Zeocin）筛选方法扩增表达 R-spondin1 的 293T 细胞。在制备条件培养基时，需撤除并彻底清洗掉抗生素和血清，确保最终的条件培养基中不含任何抗生素和血清。重要的是，收集后的条件培养基必须经过滤除菌（0.2 µm），以防止交叉污染。</li>
			<li>分装后的条件培养基可短期保存于 4 °C（6 个月内使用）或长期保存于 -20 °C（超过 6 个月）。应避免反复冻融。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据生产商的实验方案制备 L-Wnt-3A 条件培养基。
		<ol>
			<li>首先，在含有丰富血清（10%）的条件下，使用适当的抗生素（G-418）筛选方法扩增表达 L-Wnt-3A 的 L-M(TK-) 细胞。在制备条件培养基时，需撤除并清洗掉抗生素，确保最终的条件培养基中不含抗生素；但在整个培养和条件化过程中应维持血清的存在。重要的是，收集的条件培养基必须经过滤除菌（0.2 µm），以防止交叉污染。</li>
			<li>分装后的条件培养基可短期保存于 4 °C，或长期保存于 -20 °C。应避免反复冻融。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为进行质量控制，可采用 TOPFLASH 检测法，按照已发表的实验方案14，单独或联合检测 R-spondin1 和 L-Wnt-3A 条件培养基中的 Wnt 活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基础培养基的制备：用于配制完全类器官培养基以及类器官操作过程中的洗涤步骤。在 Advanced DMEM/F-12 培养基中添加谷氨酰胺至终浓度 1x、HEPES（10 mM）和青霉素/链霉素（100 U/mL）。基础培养基保存于 4 °C。</li>
	<li>类器官完全培养基的制备：在基础培养基中添加 R-spondin1 条件培养基至终浓度 10% v/v、L-Wnt-3A 条件培养基至终浓度 50% v/v，以及人 EGF（50 ng/mL）、人 FGF（100 ng/mL）、人胃泌素 I（10 nM）、小鼠 Noggin（100 ng/mL）、A83-01（500 nM）、B27 添加剂（1x）、烟酰胺（10 mM）、N-乙酰半胱氨酸（1.25 mM）和 Primocin（100 µg/mL）。
	<ol>
		<li>对于原代类器官分离、冻存后复苏的类器官培养，以及起始于单细胞的培养，需额外加入 Rho 激酶抑制剂 Y-27632，终浓度为 10.5 µM。</li>
		<li>类器官完全培养基应在冰上配制，并保存于 4 °C，建议在一个月内使用完毕。因此，推荐每周新鲜配制一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胰腺导管腺癌类器官的分离
注意：使用前至少12小时，将基底膜提取物（BME）溶液（生长因子减除型；参见材料表）置于冰上并在4 °C环境（冰箱或冷室）中解冻。使用前至少12小时，将用于类器官培养的组织培养板置于37 °C培养箱中孵育。
<ol>
	<li>将手术切除的肿瘤标本收集并运送至实验室用于研究，使用缓冲保存液以维持组织活性。可采用基础培养基或市售的组织保存液。</li>
	<li>收到标本后应尽快进行类器官分离。组织可在保存液中于术后24小时内储存，仍可成功获得类器官。</li>
	<li>进入实验室后，将肿瘤组织转移至一个10 cm的组织培养皿中，并移除保存液。</li>
	<li>使用金属镊子夹持组织，同时用#10手术刀片将肿瘤切成1 mm3或更小的碎片。较大的碎片需要更长时间消化，因此应尽量使组织碎片大小均一。若组织已自然解离或本身碎片小于1 mm3，可跳过此步骤。</li>
	<li>将组织碎片转移至含有10 mL基础培养基的15 mL锥形管中，通过反复倒置混匀。在200 × g条件下离心5分钟。离心后小心移除上清液，避免丢失组织碎片。</li>
	<li>向含有组织碎片的管中加入9 mL基础培养基和1 mL 10倍浓度的温和胶原酶/透明质酸酶溶液。为防止消化过程中细胞结团，向该溶液中添加20 µL 10 mg/mL的DNA酶I溶液。通过反复倒置混匀。</li>
	<li>将酶消化体系置于37 °C的摇床或旋转仪中孵育。为确保消化过程中的充分混合，组织碎片必须持续在溶液中运动。 
	注：该肿瘤酶解时间需根据每个标本的经验确定。成功的消化表现为组织碎片体积减小，直至肉眼无法清晰辨识。同时，随着显微组织碎片的释放，溶液浑浊度会增加。</li>
	<li>30分钟后，从37 °C培养箱中取出锥形管进行观察。若组织碎片仍清晰可见，继续在37 °C下持续混合进行解离。每30分钟重复观察一次，直至大部分或全部组织碎片已被解离。根据混合强度以及肿瘤碎片的大小和数量，此步骤可能短至30分钟（小样本）或长达12小时（大样本）。</li>
	<li>酶解完成后，在200 × g条件下离心5分钟。离心后应可见细胞沉淀，上清液应澄清，表明所有细胞均已沉淀。若未达到此状态，需重复离心。</li>
	<li>小心移除上清液，避免损失细胞沉淀。立即加入10 mL基础培养基，通过轻柔倒置混匀进行洗涤。在200 × g条件下离心5分钟。小心移除基础培养基，避免细胞损失，并重复洗涤一次，共完成两次洗涤。</li>
	<li>第二次洗涤后，小心移除所有基础培养基，将离心管置于冰上5分钟。</li>
	<li>此时，将一份类器官完全培养基置于37 °C水浴中预热。</li>
	<li>在保持离心管处于冰上的条件下，用预冷的BME重悬细胞沉淀。类器官分离时接种密度应较高。对于小量沉淀（约50 µL体积），使用200 µL BME；对于大量沉淀（约200 µL体积），使用800 µL BME。在冰上使用P200移液器轻轻吹打，使细胞与BME混合均匀，避免产生气泡。</li>
	<li>使用P200移液器在预热的12孔板每孔中央点加100 µL BME液滴。重复操作直至所有BME溶液分配完毕。小心将培养板转移至37 °C培养箱，使BME凝胶固化。</li>
	<li>10分钟后取出培养板，向每孔加入1 mL预热的类器官完全培养基。加液时沿孔壁缓慢加入，避免破坏BME液滴结构。</li>
	<li>使用倒置组织培养显微镜在明场下以4倍物镜观察细胞碎片。 
	注：单个细胞及显微组织碎片应清晰可见。成功的分离表现为24–48小时后出现超过10个类器官；培养物通常在一周内达到汇合。由于肿瘤标本具有异质性，部分类器官分离较为困难，每孔仅生长少量类器官，如图1所示。在此情况下，可延长培养至两周，以最大化可用于传代的细胞数量。为补偿培养过程中的培养基消耗与蒸发，每隔5天向每孔补充200 µL预热的类器官完全培养基。</li>
</ol>
3. 胰腺导管腺癌类器官的传代
<ol>
	<li>从组织培养孵箱中取出培养板。使用无菌细胞刮棒轻轻提起基底膜基质（BME）凝胶 dome，使其漂浮在完全培养基中。操作时避免刮擦孔底，以免去除附着在塑料表面的单层细胞（通常为成纤维细胞）。</li>
	<li>使用 p1000 移液器小心地将 BME 凝胶 dome 及培养基转移至 15 mL 圆锥形离心管中。对每个含有类器官的孔重复此步骤。</li>
	<li>用 1 mL 冷的基礎培养基轻轻洗涤每个已收获的孔，并将洗涤液转移至含有类器官的 15 mL 离心管中。</li>
	<li>使用 p1000 移液器充分混匀溶液和类器官，然后在 200 × g 条件下离心 5 分钟。离心后，管底将出现一层含有悬浮类器官的 BME 层以及一个类器官沉淀。小心吸除上清液，避免丢失 BME/类器官层。将离心管置于冰上。</li>
	<li>向离心管中加入 10 mL 冰冷的细胞回收溶液（CRS），通过反复颠倒彻底混匀。该步骤可在 4 °C 下使凝胶化的 BME 蛋白基质解聚。在冰上孵育 30 分钟，期间每 3 分钟颠倒混匀一次。如有条件，可将离心管置于冷室或 4 °C 冰箱中的旋转混合仪上孵育 30 分钟。</li>
	<li>30 分钟孵育结束后，在 200 × g 条件下离心 5 分钟。此时应可见类器官沉淀，而 BME 层应已消失。若 BME 层体积减小但仍可见，则在 4 °C 下继续孵育 30 分钟（期间定期混匀），并再次离心。</li>
	<li>确认 BME 完全解聚后，去除 CRS 溶液，保留类器官沉淀。用 10 mL 基础培养基通过颠倒混匀的方式洗涤类器官。在 200 × g 条件下离心 5 分钟后吸除上清液。将含有类器官沉淀的离心管置于冰上至少 5 分钟。</li>
	<li>可选：如需制备单细胞悬液，可将类器官与 3 mL 胰蛋白酶混合，并加入 30 µL 浓度为 10 mg/mL 的 DNAse I 溶液，以防止消化过程中细胞聚集。
	<ol>
		<li>在 37 °C 下进行酶解反应，每 2 分钟轻柔颠倒混匀一次，总时长不超过 10 分钟。在明场显微镜下观察并确认类器官已成功解离为单细胞。</li>
		<li>为终止酶反应，加入 10 mL 冰冷的基础培养基，并在 200 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>用 10 mL 基础培养基通过轻柔颠倒混匀的方式洗涤细胞。在 200 × g 条件下离心 5 分钟后吸除上清液，并重复洗涤一次。将含有细胞沉淀的离心管置于冰上至少 5 分钟。 
		注：我们建议在类器官常规传代过程中每 3–5 代进行一次此操作，以获得均一性高且数量丰富的类器官培养物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向细胞沉淀中加入冰冷的 BME，使用 p200 移液器在冰上轻轻混匀，直至溶液均匀。混匀过程中应避免产生气泡，上下吹打至少 5–10 次，并将移液器枪头靠近管底，以机械方式破碎类器官。作为参考，BME 体积应为 BME/细胞沉淀体积的 4–6 倍，确保传代比例不超过 1:2。</li>
	<li>使用 p200 移液器在预热的 12 孔板各孔中央点加 100 µL BME 液滴；重复操作直至所有 BME 溶液分配完毕。小心将培养板转移至 37 °C 孵箱，使 BME 凝胶充分固化。10 分钟后取出培养板，向每孔加入 1 mL 预热的类器官完全培养基。加液时应沿孔壁缓慢加入，避免破坏 BME dome 结构。</li>
	<li>类器官应在 24 小时内重新形成并开始生长。类器官培养物通常每 7–10 天传代一次，具体时间取决于培养密度和细胞增殖速度。必要时，每隔 5 天可向每孔补充 200 µL 预热的类器官完全培养基，以补偿生长因子消耗和液体蒸发。</li>
</ol>
4. 胰腺导管腺癌类器官的冻存与复苏
<ol>
	<li>冻存类器官时，按照步骤 3.1–3.7 所述方法收获类器官并解聚基底膜提取物（BME）。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入 1 mL 冻存液，轻轻混匀，并将混合液转移至预先标记好的冻存管中。</li>
	<li>将冻存管放入程序降温盒中，以确保温度平稳下降，随后置于 -80 °C 超低温冰箱中。24 至 48 小时后，将冻存管转移至液氮中长期保存。采用此方法，类器官可冻存数月乃至数年。</li>
	<li>复苏类器官时，从液氮中取出冻存的冻存管，并用干冰运输至细胞培养室。</li>
	<li>将冻存管置于 37 °C 水浴中快速解冻类器官，随后将管内内容物转移至含有 9 mL 室温预热基础培养基的 15 mL 锥形离心管中。</li>
	<li>在 200 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。将含有类器官沉淀的离心管置于冰上静置至少 5 分钟。</li>
	<li>按照步骤 3.9–3.11 所述方法，将类器官重悬于 BME 中并接种。 
	注意：类器官在冻融后恢复较慢，因此可在传代前培养长达两周。</li>
</ol>
5. 胰腺导管腺癌类器官的表征
注意：类器官的表征应在经过多次传代后的稳定培养物上进行，以降低成纤维细胞和免疫细胞等非上皮细胞类型的污染风险。
<ol>
	<li>从PDAC类器官中提取核酸
	<ol>
		<li>将类器官接种于专用于核酸提取的12孔板中。每孔加入的基底膜提取物（BME）不超过100 µL。为获得足够的DNA/RNA产量，每个培养样本至少接种2–4孔。培养类器官最长至5天，直至培养物接近汇合状态，但避免长期培养中积累过多的细胞碎片。</li>
		<li>从37 °C培养箱中取出培养板，彻底去除所有类器官完全培养基的残留，仅保留含有类器官的BME半球状结构。</li>
		<li>向每孔中加入900 µL酸性酚试剂（见材料表），使用p1000移液器充分混匀，直至溶液呈均一状态。BME将在酸性酚试剂中完全溶解，类器官在短暂孵育5分钟后发生裂解。 
		注意：酸性酚为危险化学品，可导致化学灼伤。操作时应采取适当防护措施并遵循规范操作流程。</li>
		<li>将均质溶液转移至2 mL离心管中，加入200 µL氯仿。孵育5分钟后，在4 °C下以12,000 × g离心15分钟。</li>
		<li>根据试剂盒说明书进行RNA和DNA的提取。RNA可从水相中提取，而DNA则从中间相和有机相中提取。纯化并定量后，来自同一培养样本不同孔的RNA和DNA可合并以提高产量。 
		备注：(1) 虽然我们强烈推荐使用本方法提取RNA，但目前已有多种优良方法可用于从培养细胞中分离DNA。(2) 为确认类器官培养物中存在肿瘤细胞，建议采用您首选的高通量测序方法对DNA进行测序，以鉴定PDAC标志性基因（KRAS, TP53, SMAD4, CDKN2A）中的突变。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PDAC类器官的药敏分型
	<ol>
		<li>按照前述步骤3.1–3.8所述方法从类器官中分离单细胞。为最大化细胞数量，应收获至少10个汇合的12孔板孔。</li>
		<li>将单细胞重悬于1 mL人源类器官完全培养基中。允许存在少量细胞团簇（约2–10个细胞），但较大的细胞团簇将对后续分析产生不利影响。</li>
		<li>使用自动细胞计数仪计数细胞并记录细胞活力。计算1 mL悬液中细胞的总数及活细胞数。</li>
		<li>用于药物测试时，每孔384孔板接种1,000个活细胞。对于384孔板，预计共需400,000个活细胞（按400孔计算）。</li>
		<li>将800 µL BME与含细胞的7.2 mL类器官完全培养基在冰上混合，用于细胞接种。保持混合物处于冰上，并向384孔板每孔加入20 µL。使用置于冰上的12通道移液器和储液槽可高效完成接种。为减少板内蒸发，可将外周孔用作储液槽（每孔加入60 µL PBS或水），但此操作将导致76个实验孔无法使用。</li>
		<li>将培养板在水平转子离心机中以100 × g离心1分钟。此步骤有助于微量的20 µL液体及类器官沉降至孔底。</li>
		<li>将培养板放入37 °C细胞培养箱中，使类器官形成。24小时后，使用明场显微镜检查类器官的形成情况。</li>
		<li>使用药物点样仪或等效设备，将溶于DMSO的治疗化合物加样至培养板中。每种药物浓度至少设置三个复孔。为有效进行剂量-反应分析，需通过实验确定每种药物的剂量范围，起始剂量为无明显效应的低剂量，终末剂量为观察到最大效应的高剂量。化疗药物的典型剂量范围已有近期文献报道9。</li>
		<li>使细胞暴露于治疗化合物中3–5天。</li>
		<li>可选：在实验结束时对培养板成像，以评估治疗对类器官大小、数量和形态的影响。</li>
		<li>根据试剂盒说明书，每孔加入20 µL发光型细胞活力检测试剂（见材料表）评估细胞活力。数据采集需使用发光检测仪，数据分析则需使用绘图软件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了分离、扩增和表征患者来源的胰腺导管腺癌（PDAC）类器官的现有方案。目前建立类器官培养的成功率超过70%；因此，这些方法尚未完全成熟，预计将随时间不断改进和完善。在取样时应充分考虑样本大小，因为PDAC的肿瘤细胞含量较低。因此，小样本中所含肿瘤细胞数量较少，仅能生成少量类器官。此外，许多患者在手术干预前会接受基于化疗和/或放化疗的新辅助治疗15。如果某种治疗对特定患者有效，则其肿瘤组织中可能不含存活细胞。为初步优化这些方法，优先获取未经化疗的患者样本较为理想，但实际情况中并不总能实现。有趣的是，我们发现肿瘤组织手术切除后的缺血时间并非类器官成功分离的主要决定因素，只要样本在24小时内完成处理即可。
胰腺导管腺癌是一种以显著的促结缔组织增生反应和致密间质基质沉积为特征的疾病。类器官虽然是快速分离和扩增上皮成分的优良工具，但该模型无法重现胰腺导管腺癌（PDAC）复杂的间质结构。其他方法，如患者来源的异种移植模型16或气液界面培养17，...

胰腺导管腺癌（PDAC）是一种致命性疾病，其特征是大多数患者确诊时已处于晚期，缺乏有效的治疗方法，导致5年总生存率始终低于10%1。仅有20%的患者在确诊时疾病尚处于局限阶段，适合进行根治性手术干预2,3。其余患者通常接受多种化疗药物联合治疗，但这些疗法仅对少数患者有效4,5。为应对这些迫切的临床需求，研究人员正在积极开发早期检测策略并研制更有效的治疗方法。为了加快重要发现的临床转化，科学家们正在采用基因工程小鼠模型、患者来源的异种移植模型、单层细胞系，以及最近兴起的类器官模型6。
利用富含生长因子和Wnt配体的条件培养三维上皮类器官，以促进未转化前体细胞增殖的方法，最初在小鼠肠道中被报道7，并迅速被应用于正常人胰腺组织8。除正常导管组织外，类器官技术还可用于人胰腺导管腺癌（PDAC）的分离、扩增和研究8。重要的是，该方法支持从手术标本以及细针和粗针穿刺活检样本中建立类器官，使研究人员能够研究疾病的所有阶段9,10。值得注意的是，患者来源的类器官能够很好地重现已明确的肿瘤转录组亚型，有望推动精准医疗平台的开发9,11。
目前针对胰腺导管腺癌（PDAC）的类器官培养方案能够成功扩增超过70%未经化疗患者的样本9。本文介绍了我们实验室用于分离、扩增和鉴定患者来源的PDAC类器官的标准方法。尽管已有其他PDAC类器官培养方法被报道12,13，但这些方法之间尚未进行系统性比较。由于该技术相对较新且发展迅速，我们预期这些方案将持续优化和改进；然而，组织处理和类器官培养的基本原则仍将持续具有应用价值。

<table><tbody><tr><td>12通道移液器（p20、p100或p200）及吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12孔板</td><td>Olympus</td><td>25-106</td><td></td></tr><tr><td>15 ml LoBind锥形管</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030122208</td><td></td></tr><tr><td>15 ml管旋转混合仪和/或振荡混合仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>384孔板</td><td>Corning</td><td>4588</td><td>超低吸附、黑色、光学透明</td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>TOCRIS</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>ADV DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>无动物源性重组人EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Cell Recovery Solution</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>在4 &amp;deg;C下使基底膜提取物解聚的试剂</td></tr><tr><td>CellTiterGlow</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>发光法细胞活力检测试剂</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>计算机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>StemCELL Tech</td><td>07930</td><td>细胞冻存液</td></tr><tr><td>Cultrex R-spondin1 (Rspo1) 细胞</td><td>Trevigen</td><td>3710-001-K</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>药物打印仪</td><td>Tecan</td><td>D300e</td><td>本实验室使用的药物打印仪</td></tr><tr><td>Excel</td><td></td><td></td><td>用于数据分析</td></tr><tr><td>超细Graefe镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>ThermoFisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>胃泌素I（人源）</td><td>TOCRIS</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>温和型胶原酶/透明质酸酶</td><td>STEMCELL Tech</td><td>7919</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>谷氨酰胺溶液</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td></td><td></td><td>用于数据分析</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>层流式组织培养罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>发光检测仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>表达L-Wnt-3A的细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>MACS组织保存液</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-100-008</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel基质</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>基底膜提取物（BME），生长因子减少型</td></tr><tr><td>Mr. Frosty冻存容器</td><td>ThermoFisher</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>p1000移液器及吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200移液器及吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>ThermoFisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>快速过滤单元（0.2 &amp;micro;m）</td><td>ThermoFisher</td><td>121-0020</td><td></td></tr><tr><td>重组人FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>无菌一次性手术刀，#10刀片</td><td>VWR</td><td>89176-380</td><td></td></tr><tr><td>组织培养离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿，10 cm</td><td>Olympus</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>TRIZol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>酸性苯酚溶液</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>ThermoFisher</td><td>R25001</td><td></td></tr></tbody></table>

患者来源的胰腺导管腺癌类器官模型的分离与表征

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

胰腺导管腺癌（PDAC）是最具致死性的恶性肿瘤之一。近年来，已有研究报道了可实现该疾病三维（3D）建模的下一代类器官培养方法。患者来源的类器官（PDO）模型可从手术标本以及小体积活检组织中分离获得，并能在体外快速形成。重要的是，类器官模型能够保留患者肿瘤中检测到的致病性遗传改变，并可预测患者对治疗的反应，从而支持转化医学研究。本文提供了将组织培养工作流程优化以用于研究三维基质包埋类器官模型的完整实验方案。我们详细阐述了原代PDAC类器官的分离与传代培养的方法及相关注意事项。此外，我们还介绍了如何在实验室中配制和进行定制类器官培养基的质量控制。最后，我们描述了对类器官模型进行下游表征的检测方法，包括核酸（DNA和RNA）的提取以及药物敏感性测试。尤为重要的是，我们提供了在科研实验室中实施类器官技术所需的关键注意事项。

为了说明从胰腺导管腺癌（PDAC）中分离类器官所面临的挑战，我们展示了如何从小份细胞含量较低的肿瘤样本中建立患者来源的类器官培养物。在初次接种后，每个孔中仅可见少量类器官，如图1所示。类器官被允许生长两周时间，并根据我们的方案进行传代，以建立更为稳定的培养体系，早期和晚期第1代的代表性图像如图1所示。需要注意的是，在初次分离的晚期阶段观察到的较大囊状类器官，在将类器官与冰上预冷的基底膜提取物（BME）混合时（见步骤2.13），极易破碎成较小的片段。
为了展示药物表型分析方案的结果，我们按照本方案所述方法，从一个已建立且生长迅速的代表性胰腺导管腺癌（PDAC）类器官中制备了单细胞悬液。每孔接种1000个活细胞，培养24小时使其恢复，随后加入细胞毒性化疗药物吉西他滨（Gemcitabine）和紫杉醇（Paclitaxel）进行处理。我们进行了三复孔的9点剂量反应实验，起始剂量为100 pM，最高剂量为2 µM。经过5天的药物处理后，分别拍摄了对照溶剂（DMSO）、2 ...

胰腺导管腺癌的患者来源类器官培养是一种快速建立的三维模型，能够高保真地代表上皮肿瘤细胞区室，为这种致命恶性肿瘤的转化研究提供了有力工具。本文中，我们提供了建立和扩增类器官以及利用这些模型进行相关生物学检测的详细方法。

胰腺导管腺癌（PDAC）是最具致死性的恶性肿瘤之一。近年来，新一代类器官培养技术的发展使得……

该方法具有重要意义，因为来源于患者的类器官模型是研究胰腺癌的一种强大且快速的工具，能够反映该疾病在遗传和表型上的异质性。该技术的主要优势在于，仅需少量肿瘤组织即可实现类器官的高成功率分离，并可在体外快速扩增，用于后续分析。研究类器官对细胞毒性药物的反应，有助于我们理解肿瘤为何会对治疗产生耐药性，并为制定更有效的治疗策略提供依据。开始此操作时，从培养箱中取出准备好的12孔板。使用无菌细胞刮刀轻轻提起基底膜提取物凝胶块，使其悬浮在完全培养基中，注意避免刮擦孔底。使用P1000移液器，小心地将基底膜提取物凝胶块及培养基转移至15毫升锥形管中。对每个含有类器官的孔重复此步骤。用一毫升冷的基础培养基轻轻洗涤已收集的每个孔，并将洗涤液转移至含有类器官的离心管中。使用 P1000 移液器充分混匀溶液和类器官，然后在 200 × g 下离心 5 分钟。在离心管底部会出现一层含有悬浮类器官的BME以及一个类器官沉淀。小心移除上清液，注意避免丢失BME和类器官层。将离心管置于冰上。向管中加入10毫升冰冻细胞回收溶液，通过倒置彻底混匀。冰上孵育30分钟，每3分钟通过倒置混匀一次。孵育结束后，在200 × g条件下离心5分钟。应可见类器官沉淀，而基质胶层应已消失。如果基质胶层体积减小但仍可见，则在4°C下额外孵育30分钟，并重复离心步骤。一旦基质胶已解聚，移除细胞回收溶液，保留类器官沉淀。用10毫升基础培养基通过倒置混匀的方式洗涤类器官。在200 × g下离心5分钟，弃去上清液，将含有类器官沉淀的离心管置于冰上至少5分钟。可选步骤：如需获得单细胞悬液，向类器官中加入3毫升胰蛋白酶溶液，并补充30微升DNA酶I溶液。将该酶促反应在 37 摄氏度下孵育，每 2 分钟轻柔颠倒混匀一次，最长持续 10 分钟。使用明场显微镜监测并确认单细胞解离成功。为终止酶促反应，加入 10 毫升冰浴的基礎培养基，于 200 × g 离心 5 分钟。然后移除上清液。加入10毫升基础培养基，通过轻轻倒置混匀来洗涤细胞。再次在200 × g下离心5分钟。弃去上清液，再重复洗涤和离心过程一次。将含有细胞沉淀的离心管置于冰上至少五分钟。之后，向细胞沉淀中加入预冷的BME，使用P200移液器轻轻吹打混合溶液，直至形成均一悬液。然后将移液枪枪头靠近管底，上下吹打至少5到10次，以机械方式分散类器官。使用P200移液枪在预热的12孔板每个孔中央加入100微升基质胶（BME）溶液，形成液滴状。重复操作，直至所有BME溶液加样完毕。然后小心将培养板转移至37摄氏度的培养箱中，使BME凝胶充分凝固。10分钟后取出培养板，向每孔加入1毫升预热的类器官完全培养基。类器官培养通常每7至10天传代一次，具体时间取决于培养密度和增殖情况。如有必要，每五天补充 200 微升预热的类器官完全培养基，以补偿生长因子消耗和蒸发损失。从类器官中分离出单细胞后，将单细胞重悬于 1 毫升人源类器官完全培养基中。接着，使用自动细胞计数仪对细胞进行计数，并记录细胞活力。计算一毫升悬浮液中的细胞总数和活细胞数。然后移除相当于400,000个细胞的体积，并将其转移至新试管中。向该试管中加入类器官完全培养基，使总体积达到7.2毫升。进行药物测试时，将800微升基质胶（BME）与含有细胞的7.2毫升类器官完全培养基在冰上混合，制备用于铺板的细胞悬液。将混合液转移至置于冰上的储液槽中，使用12通道移液器将20微升该混合液加入384孔板的每个孔中，使每孔约含有1,000个细胞。随后，将板在水平转子离心机中以100 × g离心1分钟，并将板放入37°C的组织培养孵育箱中。24小时后，使用明场显微镜检查类器官的存在情况。在本研究中，分离、扩增并表征了来自患者的胰腺导管腺癌（PDAC）类器官。为了说明从胰腺导管腺癌组织中分离类器官所面临的挑战，本研究利用一份细胞含量较少的小块肿瘤样本，建立了一个具有代表性的患者来源类器官培养物。类器官在两周时间内被允许生长至更大体积，并根据方案进行传代，以建立更稳定的培养体系。随后，从一个已建立且快速生长的代表性胰腺导管腺癌（PDAC）类器官中制备单细胞，以展示药物表型分析方案的结果。每个孔中接种1,000个活细胞，在给予细胞毒性化疗药物之前，让其恢复24小时。以100皮摩尔为低剂量、2微摩尔为高剂量，进行9.0剂量的三复孔实验。经过五天处理后，拍摄各化疗药物在溶剂对照组和高剂量组处理孔的代表性图像。拍摄图像后立即使用化学发光细胞活力试剂检测细胞活力，并通过绘图软件绘制结果。患者来源的类器官可能具有异质性的形态。因此，对每一份培养物都优化酶解离条件非常重要。患者来源模型的下游分析通常涉及对 DNA 和 RNA 的高通量测序。如果可能，应使用原代组织样本验证模型的分子特征。个体化类器官培养为胰腺癌患者的个体化治疗提供了可能性。请务必注意，苯酚-氯仿和化疗药物等危险化学品必须在配备适当的个人防护装备和安全设备的情况下进行操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

患者衍生胰腺腺腺腺腺癌有机体模型的分离和特征

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利用黑色素瘤患者来源类器官模型揭示治疗新机遇

前列腺癌的异质性和治疗耐药性仍是当前面临的挑战。本文介绍一种用于建立患者来源类器官（PDOs）的实验方案，该类器官可保留亲本肿瘤的关键特征。这一标准化模型有助于药物筛选及精准医学的发展。...

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患者来源的胰腺导管腺癌类器官模型的分离与表征

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